VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
VẬT LIỆU
Các thí nghiệm được thực hiện trên 2 chủng Trichoderma, kí hiệu : T1 , T2 Chủng T1, T2 được cung cấp bởi nhóm nghiên cứu đề tài : “Khảo sát sự phân bố của Trichoderma ở miền Đông Nam Bộ “ thuộc bộ môn Sinh Hóa, trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
1.2 Dụng cụ và hóa chất :
- Và các dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm
- Cám gạo từ đại lý thức ăn gia súc
- Trấu từ nhà máy xay lúa.
MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM
2.1 Môi trường giữ giống PGA :
- Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch, cắt lát và nấu chín trong 30 phút
- Cho agar vào nấu tan, trong khi nấu phải khuấy đều
- Cho glucose vào, khuấy đều cho tan
- Cho vào ống nghiệm khoảng 10 ml môi trường, đậy nút bông
- Hấp khử trùng bằng nồi Autoclave ở 1 atm trong 30 phút
- Sau khi hấp khử trùng xong, môi trường bên trong ống nghiệm còn lỏng, các ống nghiệm được đặt nghiên sao cho môi trường bên trong tạo mặt phẳng dài khoảng 10 cm
Giữ môi trường bên trong ống nghiệm trong 24 giờ xem có bị nhiễm hay không rồi mới sử dụng
Giống được cấy chuyền ở nhiệt độ phòng, sau 6 ngày đã mọc bào tử đem bảo quản ở tủ lạnh 4 o C
Nếu bảo quản giống ở nhiệt độ phòng thì sau 15 ngày phải cấy chuyền ống giống Nếu bảo quản giống ở điều kiện 4 o C thì sau 45 ngày phải cấy chuyền ống gioáng
2.2 Môi trường nhân giống chủng nấm Trichoderma :
- Bổ sung nước đạt độ ẩm 50%
- Các chất khoáng hòa tan trong nước trước, sau đó trộn chung với cám, traáu
- Làm ẩm môi trường đến độ ẩm 50% bằng cách thêm nước
- Cho tất cả vào erlen
2.3 Môi trường bán rắn khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzym cellulase từ chủng nấm Trichoderma :
- Bổ sung nước đạt độ ẩm cần thiết
- Cám, trấu, bã mía trộn đều
- Các chất khoáng hòa tan trong nước trước, sau đó trộn chung với cám, trấu, bã mía
- Làm ẩm môi trường đến độ ẩm cần thiết bằng cách thêm nước
- Cho tất cả vào bao chịu nhiệt
PHƯƠNGPHÁP
3.1 Phương pháp nuôi cấy Trichoderma và tách chiết enzym cellulase từ môi trường nuôi cấy :
-Sau khi hấp khử trùng, các bao chịu nhiệt chứa môi trường ở mục 2.2 được để nguội Tiến hành cho môi trường vào các khay có thể tích 17x24x5, đậy thật kín bằng vải
-Giống nấm được nhân giống trong các erlen được cấy vào trong các khay Nuôi cấy ở 30 o C Mỗi ngày tưới phun 4 – 5 lần
-Canh trường nuôi cấy được thu nhận sau từng khoảng thời gian nhất định 3.1.2 Tách chiết enzym cellulase từ canh trường nuôi cấy :
Sau thời gian nuôi cấy, enzym cellulase được tách chiết bằng cách sau :
- Cân 10 g canh trường cho vào erlen Cho vào khoảng 100 ml nước cất hoặc dung dịch đệm Để lên máy lắc trong 1 giờ
- Sau 1 giờ, tiến hành lọc qua vải lọc hay giấy lọc
- Dịch lọc được đem ly tâm ở 4 000 vòng/phút trong 10 phút
- Thu lấy dịch ly tâm, định tới mức 100 ml bằng bình định mức, sử dụng nhử dũch enzym cellulase thoõ
3.2 Phương pháp xác định tổng số lượng tế bào bằng đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu :
-Buồng đếm là một phiến kính trong, dày, hình chữ nhật
Phần giữa của buồng đếm là phần lõm phẳng, trên đó có kẻ một hoặc hai khung đếm gồm 400 ô hình vuông Xung quanh khung đếm ghi tên loại buồng đếm và thông số kỹ thuật tương ứng, giúp người sử dụng dễ dàng nhận biết và theo dõi quá trình đếm.
-Trường hợp 1 : 1 khung có 16 ô lớn, 1ô lớn có 25 ô nhỏ Vậy 1 khung có
-Trường hợp 2 : 1 khung có 25 ô lớn, 1ô lớn có 16 ô nhỏ.Vậy 1khung có
Diện tích 1 ô nhỏ là 1/400 mm 2 Vậy Vô nhỏ = 0,1 mm x 1/400 mm 2 = 1/4000 mm 3 3.2.3 Cách đếm :
-Đặt lammen sạch phủ lên khung đếm
-Dùng ống nhỏ giọt hút dung dịch bào tử đã pha loãng, bỏ đi vài giọt đầu, bơm nhẹ vào rãnh buồng đếm, dung dịch thấm vào kẽ buồng đếm và lammen
-Dung dịch chảy tràn từ từ vào các rãnh, lan tỏa lắp đầy khắp lammen, hơi thừa một ít Nếu bị bọt kẹt lại trong lammen thì phải làm lại
-Đặt buồng đếm lên bàn kẹp của kính hiển vi, dùng kẹp cố định buồng đếm
-Thao tác kính hiển vi, dùng vật kính x10 để điều chỉnh sơ bộ trước, sau đó dùng vật kính x40 để đếm
-Đếm số tế bào trong 1ô nhỏ, đếm lần lượt từng ô nhỏ trong khu vực -Trong tất cả các ô nhỏ cần đếm số tế bào nằm hẳn trong ô trước, sau đó đếm số tế bào nằm ở cạnh phiá trên và cạnh bên phải ô
-Đếm tất cả 80 ô nhỏ có trong 5 khu vực( 1khu vực có 16 ô nhỏ) hoặc đếm
125 ô nhỏ có trong 5 khu vực( 1khu vực có 25 ô nhỏ)
Trong đó: a = số tế bào trung bình có trong 1ô nhỏ (V = 1/4000 mm 3 )
4000 = số qui đổi từ 1/4000 mm 3 thành 1mm 3
1000 = số qui đổi từ 1 mm 3 thành 1ml (1ml= 1000 mm 3 )
3.3 Phương pháp xác định hàm lượng đường khử (Phương pháp Miller)
Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử 3,5 – dinitrosalisylic (DNS) Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử
Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử acid dinitrosalisylic sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu
- Thuốc thử acid dinitrosalisylic (DNS) : Cân 1 g DNS pha trong 20 ml dung dịch NaOH 2N, thêm vào 50 ml nước cất và 30 g muối sodium potassium tartrate Đun nhẹ cho tan rồi định mức tới 100 ml
- Dung dũch glucose maóu (500 àg/ml) : Caõn 0,5 g D – glucose pha trong nước cất thành 1 lít
3.3.3.1 Dựng đồ thị chuẩn glucose :
Từ dung dịch glucose chuẩn, pha các dung dịch glucose chuẩn có nồng độ từ
H Số tế bào/1ml mẫu =
Nồng độ glucose (àg/ml) 0 50 100 150 200 250 Theồ tớch dung dũch glucose maãu (ml)
Cho 0,5 ml dung dịch glucose chuẩn vào ống nghiệm sạch và khô, thêm 0,5 ml thuốc thử DNS và đun cách thủy 3 phút Sau đó, để nguội đến nhiệt độ phòng rồi thêm 5 ml nước cất vào mỗi ống nghiệm Cuối cùng, đo mật độ quang ở bước sóng 530 nm, chọn ống nghiệm chứa nước cất làm đối chứng.
Vẽ đường chuẩn glucose với trục tung là mật độ quang, trục hoành là nồng độ glucose
Phản ứng của dung dịch đường cần phân tích với thuốc thử acid dinitrosalisylic được tiến hành như trong phần xây dựng đồ thị chuẩn
Nồng độ đường trong mẫu được xác định nhờ vào đường chuẩn glucose đã dựng
3.4 Phương pháp xác định hoạt tính hệ enzym cellulase :
3.4.1 Nguyeân taéc : Để xác định hoạt tính enzym cellulase, ta cần sử dụng CMC (Carboxymethyl cellulose) như cơ chất, ủ dịch chiết enzym với CMC trong 60 phút pH 5,0 Hệ enzym cellulase sẽ tác dụng lên CMC, phóng thích các phân tử glucose, dựa vào hàm lượng glucose xác định hoạt tính enzym cellulase
3.4.2.1Dung dịch đệm Mc Ilvaine (pH 2,2-8,0) a) Dung dịch acid citric 0,1M: 21,008g acid citric (C6H8O7) được hòa tan và dẫn nước đến 1000 ml a(àg/ml).5.n.V ẹvht/g MT/1h = m b) Dung dịch dinatri hydrophotphat: 35,62g Na2HPO4.2H2O hoặc 71,7g
Na2HPO4.12H2O được hòa tan và dẫn nước đến 1000 ml
Dung dịch đệm có pH khác nhau phụ thuộc vào X ml dung dịch (a) và dẫn đến 20ml bởi dung dịch (b)
Cân chính xác 3 g CMC, hòa tan trong dung dịch đệm acetat 0,2M, pH 5,0, khuấy trong 2 giờ ơ û45 o C để hòa tan cơ chất, thêm dung dịch đệm cho đủ 1000 ml 3.4.3 Cách tiến hành :
Hỗn hợp phản ứng gồm : 1 ml dịch chiết enzym cellulase, 3 ml dung dịch cơ chất, 1 ml dung dịch đệm
Hỗn hợp được ủ ở nhiệt độ 50 o C trong 1 giờ Sau thời gian ủ, bất hoạt enzym bằng cách đun sôi trong 10 phút
Lấy 0,5 ml hỗn hợp trên đem xác định hàm lượng glucose theo phương pháp Miler ở 3.3
3.4.4 Cách tính : Đơn vị hoạt tính của enzym cellulase được xác định như sau : một đơn vị hoạt tớnh (đvht) tương ứng với 1 àg glucose trong thời gian thủy phõn cơ chất CMC
Trong đó : a : Hàm lượng glucose (àg/ml)
5 : Thể tích của hỗn hợp phản ứng (ml) n : Hệ số pha loãng
V : Thể tích dịch enzym ban đầu (ml) m : Khối lượng chế phẩm enzym (g)
3.5 Phương pháp định lượng protein (phương pháp Lowry) :
Hầu hết các protein đều chứa Tyrosin và Tryptophan Hàm lượng của những acid amin này tùy thuộc vào loại protein Vì vậy, những protein cùng một loại với nhau có hàm lượng các acid amin này giống nhau
Khi cho protein tác dụng với thuốc thử Folin sẽ tạo thành một phức chất có màu Cường độ màu của phức này tỉ lệ với hàm lượng Tyrosin và Tryptophan (cũng là hàm lượng protein) Vì thế ta có thể dùng phương pháp so màu để xác định hàm lượng protein
- Dung dịch albumin 0,1% : Cân chính xác 0,1 g albumin pha với nước cất thành 100 ml dung dịch
- Dung dịch A : Cân 2 g Na2CO3 hòa tan trong NaOH N/10 và định mức thành 100 ml
- Dung dịch B : Cân 0,5 g CuSO4.5H2O hòa tan trong dung dịch citrat natri 1% và định mức thành 100 ml
- Dung dịch C : Pha dùng ngay trong ngày gồm hỗn hợp của 2 dung dịch A và B được pha theo tỉ lệ 49:1
- Thuốc thử Folin (phòng thí nghiệm bộ môn sinh hóa cung cấp)
Ta thực hiện đường chuẩn với một loại protein tinh khiết có sẵn, thường là albumin của bò đã đông khô theo bảng sau để có được các dung dịch albumin chuẩn cú nồng độ protein từ 0 đến 250 (àg/ml) a (àg/ml) 10 -3 n V mg protein/g = m
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
KHẢO SÁT ĐỘNG HỌC QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP
1.1 Khảo sát ảnh hưởng pH của môi trường nuôi cấy lên quá trình sinh tổng hợp enzym cellulase ở hai chủng Trichoderma : Để khảo sát điều kiện pH môi trường nuôi cấy và xác định pH tốt nhất để nuôi cấy từng chủng Trichoderma Chúng tôi tiến hành nuôi cấy từng chủng Trichoderma trên môi trường bán rắn có pH=3,0-8,0
Bảng 1 : Hoạt tính enzym cellulase của chủng T1 theo pH của môi trường nuôi cấy pH
Theồ tớch dũch enzym (ml) ∆OD
Hàm lượng glucose (àg/ml)
H oa ùt t ớn h c hu ng ( ủ vh t/g ) Đồ thị 1: Hoạt tính enzym cellulase của chủng T1 theo pH của môi trường nuôi cấy Nhận xét:
Qua bảng 1 và đồ thị 1 : chúng tôi nhận thấy hoạt tính enzym cellulase tăng từ pH 3,0 – 4,5 và đạt cực đại tại pH = 5,0 Hoạt tính bắt đầu giảm khi pH > 5,0
Kết quả thí nghiệm cho thấy chủng T1 sinh tổng hợp enzym cellulase có hoạt tính cao nhất khi được nuôi cấy trong môi trường có pH = 5,0
Bảng 2 : Hoạt tính enzym cellulase của chủng T2 theo pH của môi trường nuôi cấy pH
Theồ tớch dũch enzym (ml) ∆OD
Hàm lượng glucose (àg/ml)
H oa ùt t ớn h c hu ng (ủ vh t/g ) Đồ thị 2 : Hoạt tính enzym cellulase của chủng T2 theo pH của môi trường nuôi cấy Nhận xét:
Qua bảng 2 và đồ thị 2, hoạt tính enzym cellulase gia tăng khi chủng T2 được nuôi cấy trong môi trường có pH từ 3,0 đến 5,5, đạt mức cao nhất tại pH 6,0 Tuy nhiên, khi pH cao hơn 6,0, hoạt tính enzym bắt đầu suy giảm Do đó, kết quả thử nghiệm xác định rằng chủng T2 thể hiện hoạt tính enzym cellulase tối ưu nhất khi nuôi cấy trong môi trường có pH đạt 6,0.
1.2 Khảo sát ảnh hưởng lượng nước thêm vào môi trường nuôi cấy lên quá trình sinh tổng hợp enzym cellulase ở hai chủng Trichoderma Để khảo sát lượng nước thêm vào môi trường nuôi cấy và xác định lượng nước thêm vào tối ưu cho từng chủng Trichoderma Chúng tôi tiến hành : Nuôi cấy từng chủng
Trichoderma trên môi trường bán rắn có pH là pH tối ưu đã được xác định ở mục
IV.1.1 và lượng nước thêm vào thay đổi từ 45% đến 65%
Bảng 3: Hoạt tính enzym cellulase của chủng T1 theo lượng nước thêm vào môi trường nuôi cấy
Theồ tớch dũch enzym (ml) ∆OD
Hàm lượng glucose (àg/ml)
H oa ùt t ớn h c hu ng (ủ vh t/g ) Đồ thị 3 : Hoạt tính enzym cellulase của chủng T1 theo lượng nước thêm vào môi trường nuôi cấy
Từ bảng 3 và đồ thị 3, chúng tôi nhận thấy chủng T1 sinh tổng hợp enzym cellulase có hoạt tính cao nhất khi lượng nước thêm vào môi trường nuôi cấy là 50% và khi lượng nước thêm vào lớn hơn hay nhỏ hơn 50% thì hoạt tính giảm dần
Bảng 4: Hoạt tính enzym cellulase của chủng T2 theo lượng nước thêm vào môi trường nuôi cấy
Theồ tớch dũch enzym (ml) ∆OD
Hàm lượng glucose (àg/ml)
H oa ùt t ớn h c hu ng (ủ vh t/g ) Đồ thị 4: Hoạt tính enzym cellulase của chủng T2 theo lượng nước thêm vào môi trường nuôi cấy
Qua bảng 4 và đồ thị 4, chúng tôi thấy rằng hoạt tính enzym cellulase của chủng T2 tăng dần khi lượng nước thêm vào từ 45% đến gần 55% và đạt cực đại khi lượng nước thêm vào là 55% Hoạt tính enzym giảm dần khi lượng nước thêm vào lớn hơn 55%
1.3 Khảo sát động học quá trình sinh tổng hợp enzym cellulase ở hai chủng Trichoderma theo thời gian nuôi cấy
Mục đích : Khảo sát thời gian nuôi cấy và xác định thời điểm tối ưu để lấy enzym cellulase của từng chủng Trichoderma
Tiến hành : Nuôi cấy từng chủng Trichoderma trên môi trường bán rắn với điều kiện pH và lượng nước thêm vào tối ưu đã được xác định ở mục IV.1.1 và IV.1.2, tiến hành nuôi cấy trong 7 ngày Trong quá trình nuôi cấy, thu dịch enzym thô theo thời gian: 1ngày, 2 ngày , …, 7 ngày, tiến hành xác định hoạt tính như ởmục III.3.4
Bảng 5: Hoạt tính enzym cellulase của chủng T1 theo thời gian nuôi cấy
Theồ tớch dòch enzym (ml)
Hàm lượng glucose (àg/ml)
H oa ùt t ớn h c hu ng (ủ vh t/g ) Đồ thị 5 : Hoạt tính enzym cellulase của chủng T1 theo thời gian nuôi cấy
Từ đồ thị và bảng số liệu, có thể thấy rằng hoạt tính của enzym cellulase có mối liên hệ tỷ lệ thuận với quá trình lan tơ và phát triển của chủng T1 Cụ thể, hoạt tính enzym tăng dần từ thời điểm bắt đầu nuôi cấy cho tới ngày thứ 2, lúc này đạt cực đại Sau ngày thứ 2, hoạt tính enzym giảm dần.
Bảng 6: Hoạt tính enzym cellulase của chủng T2 theo thời gian nuôi cấy
Theồ tớch dòch enzym (ml)
Hàm lượng glucose (àg/ml)
H oa ùt t ớn h c hu ng (ủ vh t/g ) Đồ thị 6 : Hoạt tính enzym cellulase của chủng T2 theo thời gian nuôi cấy
Theo Bảng 6 và Đồ thị 6, hoạt tính enzym cellulase của chủng T2 gia tăng nhanh chóng từ thời điểm bắt đầu đến ngày thứ 3 Vào ngày thứ 3, hoạt tính enzym đạt mức cao nhất và tiếp tục giảm dần sau đó.
Chúng tôi nhận thấy hoạt tính của enzym cellulase ở 2chủng Trichoderma đều tăng theo thời gian, sau đó đạt cực đại và giảm dần Điều này có thể giải thích là do trong thời gian đầu (1-2 ngày), Trichoderma sử dụng các chất dinh dưỡng có trong môi trường nuôi cấy để tăng sinh khối do đó hoạt tính enzym cellulase không đáng kể Khi các chất dinh dưỡng dễ sử dụng này cạn kiệt thì nấm mốc bắt buộc phải tổng hợp enzym cellulase phân giải cellulose để thu chất dinh dưỡng và phát triển, do đó hoạt tính enzym tăng lên rất cao Tuy nhiên, sau đó các chất dinh dưỡng khác (trừ nguồn Carbon) trong môi trường dần cạn kiệt, nấm mốc không có điều kiện thuận lợi để phát triển và tổng hợp enzym cellulase giảm dần dẫn đến hoạt tính enzym ngày càng giảm đi
Sự khác nhau về thời gian sinh tổng hợp enzym cellulase là do các điều kiện sinh lý khác nhau của từng chủng Trichoderma : 2 ngày (T1), 3 ngày (T2)
2 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG pH, NHIỆT ĐỘ, THỜI GIAN THỦY PHÂN LÊN HOẠT TÍNH ENZYM CELLULASE THU NHẬN TỪ HAI CHUÛNG TRICHODERMA
2.1 Aûnh hưởng của pH lên hoạt tính enzym cellulase của hai chủng
Tìm hiểu ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của enzym cellulase và xác định pH tối ưu để thu enzym cellulase của từng chủng
-Nuôi cấy Trichoderma trên môi trường bán rắn với các điều kiện tối ưu được xác định ở IV.1
-Sử dụng dung dịch đệm có pH khác nhau từ 3,0 đến 7,0 để chiết tách enzym từ môi trường nuôi cấy
-Tiến hành các phản ứng ở 50 0 C trong các điều kiện pH khác nhau từ 3,0 – 7,0 Kết quả thu được như sau :
Bảng 7 : Aûnh hưởng của pH lên hoạt tính enzym cellulase của chủng T1 pH
Theồ tớch dũch enzym (ml) ∆OD Hàm lượng glucose (àg/ml)
H oa ùt t ớn h c hu ng (ủ vh t/g ) Đồ thị 7 : Aûnh hưởng của pH lên hoạt tính enzym cellulase của chủng T1
Qua bảng 7 và đồ thị 7, chúng tôi nhận thấy hoạt tính của enzym cellulase tăng trong khoảng pH từ 3,0 – 4,5, và hoạt tính của enzym đạt cực đại tại pH = 4,5 Khi pH lớn hơn 4,5 thì hoạt tính của enzym thấp dần
Bảng 8 : Aûnh hưởng của pH lên hoạt tính enzym cellulase của chủng T2 pH
Theồ tớch dũch enzym (ml) ∆OD Hàm lượng glucose (àg/ml)
H oa ùt t ớn h c hu ng (ủ vh t/g ) Đồ thị 8 : Aûnh hưởng của pH lên hoạt tính enzym cellulase của chủng T2
Từ bảng 8 và đồ thị 8, chúng tôi nhận thấy ở pH từ 3,0- 4,5 hoạt tính của enzym cellulase tăng dần và đạt cực đại tại pH = 5,0 Khi pH tiếp tục tăng thì hoạt tính giảm dần Như vậy để thu nhận enzym cellulase ta nên sử dụng dung dịch đệm có pH 5,0
Các kết quả thu được cho thấy pH có ảnh hưởng đến hoạt tính enzym là do pH thay đổi có ảnh hưởng đến trạng thái ion hoá của các nhóm chức có khả năng ion hoá tham gia trong trung tâm hoạt động của enzym như nhóm –NH2, -OH,… cũng như trạng thái ion hoá của cơ chất và của phức chất trung gian
Khoảng pH thích hợp cho hoạt động của enzym ở chủng T1 là pH = 4,5-5,5 , chủng
Từ kết quả thí nghiệm, chúng tôi chọn pH tối ưu để thu enzym cellulase của 2 chủng Trichoderma lần lượt là pH = 4,5 (chủng T1), pH = 5,0 (chủng T2 ).
KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG LÊN HOẠT TÍNH ENZYM CELLULASE THU NHẬN TỪ
Thí nghiệm nhằm mục đích tìm hiểu ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của enzym cellulase và xác định nhiệt độ tối ưu của enzym cellulase ở từng chủng Chúng tôi tiến hành như sau:
-Nuôi cấy Trichoderma trên môi trường bán rắn với các điều kiện tối ưu được xác định ở IV.1
-Sử dụng dung dịch đệm có pH là pH tối ưu của enzym ở từng chủng đã được xác định tại mục IV.2.1 để chiết tách enzym từ môi trường nuôi cấy
-Tiến hành các phản ứng ở các nhiệt độ từ 30-80 0 C
Kết quả thu được như sau :
Bảng 9 : Aûnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzym cellulase của chủng T1
Theồ tớch dòch enzym (ml)
Hàm lượng glucose (àg/ml)
H oa ùt t ớn h c hu ng (ủ vh t/g ) Đồ thị 9 : Aûnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzym cellulase của chủng T1
Qua bảng 9 và đồ thị 9, chúng tôi nhận thấy nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính của enzym là từ 40-60 0 C, hoạt tính enzym đạt cực đại tại 50 0 C Trên 60 0 C, hoạt tính enzym giảm nhanh
Bảng 10 : Aûnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzym cellulase của chủng T2
Theồ tớch dòch enzym (ml)
Hàm lượng glucose (àg/ml)
H oa ùt t ớn h c hu ng (ủ vh t/g ) Đồ thị 10 : Aûnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzym cellulase của chủng T2
Từ bảng 10 và đồ thị 10, chúng tôi nhận thấy nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính của enzym là từ 40-60 0 C, hoạt tính enzym đạt cực đại tại 50 0 C Trên 60 0 C, hoạt tính enzym giảm nhanh
Nhiệt độ là một yếu tố vật lý quan trọng ảnh hưởng lớn đến hoạt tính enzym, chúng liên quan đến khả năng kết hợp giữ enzym va cơ chất, nâng cao aí lực giữa enzym và cơ chất Thông thường khi nhiệt độ tăng thi vận tốc phản ứng tăng Sau khi đạt giá trị cực đại, nếu tiếp tục tăng nhiệt độ thì một mặt vận tốc tăng theo qui luật, một mặt ở nhiệt độ cao thì phần protein của enzym bắt đầu bị biến tính , làm cho hoạt tính của enzym giảm mạnh Khi nhiệt độ quá cao, protein của enzym biến tính hoàn toàn thì lúc đó enzym sẽ bị mất hoạt tính
Kết quả chúng tôi thu được từ khảo sát hoạt tính của enzym cellulase hoàn toàn phù hợp với qui luật trên
2.3 Aûnh hưởng của thời gian thủy phân lên hoạt tính enzym cellulase của hai chuûng Trichoderm:
Mục đích: Khảo sát thời gian thủy phân của enzym cellulase ở từng chủng
Trichoderma và xác định thời gian thủy phân tốt nhất
-Nuôi cấy Trichoderma trên môi trường bán rắn với các điều kiện tối ưu được xác định ở IV.1
-Sử dụng dung dịch đệm có pH là pH tối ưu của enzym ở từng chủng đã được xác định tại mục IV.2.1 để chiết tách enzym từ môi trường nuôi cấy
-Tiến hành các phản ứng ở các nhiệt độ tối ưu của từng chủng trong thời gian 1 giờ,
Kết quả thu được như sau :
Bảng 11 : Aûnh hưởng của thời gian thủy phân lên hoạt tính enzym cellulase của chuûng T1
Theồ tớch dũch enzym (ml)
Hàm lượng glucose (àg/ml)
H oa ùt t ớn h c hu ng (ủ vh t/g ) Đồ thị 11 : Aûnh hưởng của thời gian thủy phân lên hoạt tính enzym cellulase của chuûng T1
Qua bảng 11 và đồ thị 11, chúng tôi thấy hoạt tính của enzym cellulase đạt cực đại khi thời gian thủy phân là 2giờ
Bảng 12 : Aûnh hưởng của thời gian thủy phân lên hoạt tính enzym cellulase của chuûng T2
Theồ tớch dũch enzym (ml)
Hàm lượng glucose (àg/ml)
H oa ùt t ớn h c hu ng (ủ vh t/g ) Đồ thị 12 : Aûnh hưởng của thời gian thủy phân lên hoạt tính enzym cellulase của chuûng T2
Qua bảng 12 và đồ thị 12, chúng tôi nhận thấy thời gian thủy phân tối ưu của enzym cellulase ở chủng T2 là 2giờ
Qua bảng 11 và 12, chúng tôi nhận thấy thời gian thích hợp để thủy phân là 2 giờ Lúc bắt đầu hoạt tính của enzym tăng dần, sau đó giảm dần do một số sản phẩm của quá trình thủy phân cellulose( glucose) trở thành tác nhân ức chế enzym cellulase Madels và cộng tác viên nhận thấy khi nồng độ glucose tăng từ 2- 3% sẽ xảy ra ức chế hoạt tính của enzym cellulase Theo Rubidge, sự có mặt của glucose vừa làm gián đoạn sự tiết cellulase vào môi trường, vừa ức chế hoạt tính enzym này.
SO SÁNH HOẠT TÍNH RIÊNG CỦA HAI CHỦNG
Mục đích : so sánh hoạt tính riêng của enzym cellulase ở hai chủng Trichoderma với nhau và với Trichoderma reesei để chọn ra chủng có hoạt tính cao nhất
-Nuôi cấy Trichoderma trên môi trường bán rắn với các điều kiện tối ưu được xác định ở IV.1
-Sử dụng dung dịch đệm có pH là pH tối ưu của enzym ở từng chủng đã được xác định tại mục IV.2.1 để chiết tách enzym từ môi trường nuôi cấy
-Tiến hành phản ứng thủy phân ở các nhiệt độ tối ưu của từng chủng trong 2 giờ để xác định hoạt tính chung
- Xác định hàm lượng protein
Hoạt tính riêng của enzym được tính như sau
Hoat tớnh rieõng (ủvht/mg protein)
Bảng 13 : Hoạt tính riêng của enzym cellulase của hai chủng Trichoderma
Theồ tớch dũch enzym (ml) 100 100
Hàm lượng glucose (àg/ml) 72 80
Hàm lượng protein (mg protein/g) 1,6 2,7
Hoạt tính riêng (đvht/mg protein) 2239 1474
Qua bảng 13, chúng tôi nhận thấy hoạt tính của enzym cellulase do chủng T2 tổng hợp cao hơn enzym cellulase của chủng T1 nhưng hoạt tính riêng của enzym cellulase của chủng T1 lại cao hơn của chủng T2
Từ kết quả thí nghiệm chúng tôi so sánh vớiù hoạt tính riêng của enzym cellulase
Trichoderma reesei ( Huỳnh Anh (2001), Sinh tổng hợp enzym cellulase reesei bằng nuôi cấy bề mặt,Luận văn cử nhân sinh học, Đại học Khoa học Tự Nhiên Tp HCM )
Hoạt tính chung (đvht/g) Hàm lượng protein(mg protein/ g)
Bảng 14 So sánh hoạt tính riêng của enzym cellulase ở chủng T1 và T2 với
Chủng Hoạt tính riêng (đvht/mg protein)
Chủng T1 là chủng có hoạt tính riêng của enzym cellulase cao nhất
Chủng T1 và Trichoderma reesei có hoạt tính riêng gần bằng nhau.
KHẢO SÁT TÁC NHÂN TỦA ENZYM CELLULASE CỦA CHUÛNG T 1
Mục đích : Khảo sát các tác nhân tủa enzym cellulase của chủng T1 nhằm tìm ra tác nhân tủa thích hợp cho chủng T1
Để thu được enzyme cellulase, chủng T1 được nuôi cấy trong môi trường bán rắn tối ưu Sau thời gian nuôi cấy thích hợp, dung dịch đệm được sử dụng để tách enzyme cellulase Dung dịch enzym thô thu được sau đó trải qua quá trình tủa với các tác nhân và tỷ lệ khác nhau để tinh sạch enzyme.
4.1 Tác nhân tủa là dung môi hữu cơ :
4.1.1 Tác nhân tủa là ethanol 96 0 :
Bảng 14: Hoạt tính enzym cellulase được tủa bằng ethanol 96 0
Tổ leọ dung dũch enzym/ethanol
Qua bảng 14, chúng ta thấy rằng khi enzym cellulase được kết tủa bằng ethanol với các tỉ lệ thể tích 1:1, 1:2,1:3,1:4 thì khối lượng chế phẩm enzym thu được tỷ lệ thuận với thể tích ethanol dùng để tủa Hoạt tính của enzym cũng tăng khi thể tích ethanol tăng và đạt cao nhất tại tỉ lệ thể tích 1:3, khi thể tích ethanol cao hơn mức này hoạt tính enzym giảm
4.1.2 Tác nhân tủa là acetone:
Bảng 15: Hoạt tính enzym cellulase được tủa bằng acetone
Tổ leọ dung dòch enzym/ acetone
Từ bảng 15, chúng tôi thấy rằng khi thể tích acetone dùng để tủa enzym cellulase tăng thì khối lượng chế phẩm thu được cũng tăng theo nhưng hoạt tính của enzym chỉ tăng từ tỉ lệ 1:1 đến tỉ lệ 1:2 và đạt giá trị cao nhất tại tỉ lệ 1:2, quá tỉ lệ này thì hoạt tính của enzym cellulase giảm
4.2 Tác nhân tủa là muối Sulfatamon:
Bảng 16 : Hoạt tính của enzym cellulase được tủa bằng dung dịch muối Sulfatamon
Qua bảng 16, chúng tôi nhận thấy khi nồng độ muối sulfat amon tăng từ 10% -80% thì khối lượng chế phẩm enzym cellulase và hoạt tính của enzym tăng nhưng hoạt tính của enzym đạt giá trị cao nhất tại nồng độ muối 70%, khi nồng độ muối cao hơn thì hoạt tính giảm
Enzym có bản chất là protein, chúng có những đầu háo nước nên dễ dàng liên kết với nước Khi ta cho dung môi ưa nước hoặc muối có khả năng hoà tan cao trong nước vào, lúc này enzym không có đủ nước để hoà tan sẽ liên kết với nhau và tủa xuống Từ kết quả thí nghiệm, cho thấy nồng độ dung môi hoặc muối càng cao thì lượng tủa càng nhiều nhưng nếu nồng độ của dung môi hoặc muối quá cao thì sẽ làm enzym mất hoạt tính bởi nồng độ cao dễ làm protein của enzym biến tính
Trong các tác nhân dùng để tuả enzym cellulase của chủng T1 thì khối lượng enzym thu được do tủa bằng cồn > tủa bằng muối > tủa bằng acetone nhưng hoạt tính riêng Thì tuả bằng muối > tủa bằng cồn > tủa bằng acetol Điều này chứng tỏ enzym cellulase kết tủa bằng dung môi hữu cơ là cồn hoặc acetone dễ bi biến tính hơn so với muối
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
PHUẽ LUẽC
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Dựa vào những kết quả thí nghiệm có thể rút ra những kết luận sau
- pH của môi trường nuôi cấy tối ưu với chủng T1 là 5,0 và chủng T2 là 6,0
- Lượng nước thêm vào môi trường nuôi cấy đối với chủng T1 là 50% và chủng
- Thờ gian thu nhận enzym cellulase đạt hoạt tính cao nhất đối với chủng T1 là 2 ngày và chủng T2 là 3 ngày
- pH tối ưu để thu nhận enzym cellulase đạt hoạt tính cao nhất đối với chủng T1 là 4,5 và chủng T2 là 5,0
- Nhiệt độ tối ưu để enzym cellulase có hoạt tính cao nhất đối với chủng T1 và T2 là 50 0 C
- Thời gian thuỷ phân tối ưu để enzym cellulase có hoạt tính cao nhất đối với 2 chủng là 2 giờ
- Tác nhân tủa thích hợp nhất đối với enzym cellulase của chủng T1 là muối sufat amon 70%
Do thời gian thực hiện thí nghiệm có hạn, điều kiện thực hiện thí nghiệm còn khó khăn nên chúng tôi chỉ có thể thu được một số kết quả bước đầu, đồng thời đề xuất một số vấn đề cần nghiên cứu chuyên sâu hơn trong tương lai.
_ Tiến hành định danh hai chủng Trichoderma T1 và T2
- Khảo sát điều kiện nhiệt độ và thành phần dinh dưỡng môi trường nuôi cấy hai chủng để thu nhận enzym cellulase có hoạt tính cao nhất
- Khảo sát các hệ enzym khác mà chủng Trichoderma T1 và T2 có khả năng tổng hợp
01 Huỳnh Anh (2001), Sinh tổng hợp enzym cellulase của Trichoderma Reesei bằng nuôi cấy bề mặt, Luận văn cử nhân sinh học, Trường Đại học Khoa Học
Tự Nhiên , Tp Hồ Chí Minh
02 Lâm Thị Kim Châu, Nguyễn Thượng Lệnh, Văn Đức Chín (2000), Thực tập lớn Sinh Hoá, Tủ sách Đại học Khoa Học Tự Nhiên , Tp Hồ Chí Minh
03 Tô Minh Châu, Phan Hữu Nghiã (2001), Giáo trình thực tập vi sinh cơ sở, Đại Học Mở Bán Công, Tp Hồ Chí Minh
04 Văn Đức Chín, Lâm thị Kim Châu, Nguyễn Thượng Lệnh (2000-2001), Thực tập chuyên ngành Sinh Hoá, Tủ sách Đại học Khoa Học Tự Nhiên , Tp Hồ
05 Nguyễn Lân Dũng (1983), Một số sản phẩm của vi nấm, Nxb Khoa học và
06 Nguyễn Thị Lý (2003), Nghiên cứu hệ enzym cellulase của nấm mốc Trichoderma reesei, Luận văn cử nhân sinh học, Trường Đại học Dân Lập
Vaên Lang, Tp Hoà Chí Minh
07 Nguyễn Đức Lượng (1996), Nghiên cứu tính chất một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulase cao và ứng dụng trong công nghiệp xử lý chất thải hữu cơ, Luận án Phó Tiến Sĩ khoa học
08 Nguyễn Đức Lượng (2002), Công nghệ vi sinh tập 2, Nxb Đại học quốc gia ,
Tài liệu "Công nghệ enzyn" của Nguyễn Đức Lượng, Cao Cường, Nguyễn Anh Tuyết, Lê Thị Thủy Tiên, Huỳnh Ngọc Oanh, Nguyễn Thúy Hương, Phan Thị Huyền, Tạ Thu Hằng (2004) do Nhà xuất bản Đại học Quốc gia tại Tp Hồ Chí Minh phát hành là nguồn tham khảo hữu ích về công nghệ enzyn.
10 Mạc Thị Hồng Thắm (2004), Nghiên cứu một số chủnh vi sinh vật phân giải cellulose và ứng dụng trong thức ăn gia súc, Trường Đại học Khoa Học Tự
Nhieân , Tp Hoà Chí Minh
11 Đồng Thị Thanh Thu (2003), Sinh hoá ứng dụng, Nxb Đại học quốc gia, Tp Hoà Chí Minh
12 Đồng Thị Thanh Thu (2002), Giáo trình sinh hoá cơ bản, Tủ sách Đại học
Khoa Học Tự Nhiên , Tp Hồ Chí Minh
13 Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Phạm Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng (1982),
Enzym vi sinh vật tập 2, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội
14 Nguyễn Ngọc Tú, Nguyễn Đăng Diệp (1998), Nghiên cứu qui trình công nghệ sản xuất phân bón vi sinh Tricho, Tuyển tập các công trình nghiên cứu khoa học (1993-1998), Nxb Nông nghiệp, Tp Hồ Chí Minh
2 TÀI LIỆU TIẾNG NƯỚC NGOÀI :
15 Dubordieu et al (1985), Investigations of an industrial β-D-glucanse from Trichoderma harzianum, Carbohyar Res
16 G C Papavizas (1985), Trichoderma & Gliocladium : Biology, ecology and potent for biocontrol, Ann Ver Phytopathol
17 Galante et al (1993), New applications of enzymes in wine making and olive oil production, Italian Biochem Soc Trans
18 G E Harman & C P Kubicek (1998), Trichoderma & Gliocladium Vol 2,
Taylor & Francis Ltd, London, UK
19 Hesselman et al (1982), Influence of insreasing level of β-glucanase on the productive value of barley diets for broiler chickens, Aninial Feed Sci and
20 M R El-Geweky (1993), Biotechnology annual review, Vol 2
21 Oksanen et al (1985), Microbial cellulase for improveing filtrability of wort and beer, Pro Eur Chem., Helsinki
3 TÀI LIỆU TRÊN MẠNG INTERNET :
24 http:/www.worthington-biochem.com/defaut.html
Nồng độ đường (àg/ml)
Nồng độ protein (àg/ml)
∆OD Đồ thị 13 : Đường chuẩn Glucose Đồ thị 14 : Đường chuẩn Albumin
Hình 6: Chuûng T1 treân Hình 7: Chuûng T2 môi trường PGA trên môi trường PGA
Hình 8: Chuûng T1 Hình 9: Chuûng T2 trên môi trường nhân giống trên môi trường nhân giống
Hình 10: Nuôi cấy bán rắn trên khay Hình 11: Nuôi cấy bán rắn trên khay chuûng T1 chuûng T2
Hình 12: Chuûng T1 Hình 13: Chuûng T2 sau khi được nuôi cấy bằng khay sau khi được nuôi cấy bằng khay
Hình 14: Dung dòch enzym cellulase Hình 15: Dung dòch enzym cellulase thô tách từ chủng T1 thô tách từ chủng T2
Hình 16:Tác nhân tủa là ethanol 96 0 Hình 17: Tác nhân tủa là acetone
Hình 18: Tác nhân tủa là sulfat amon
Một số sản phẩm trên thị trường có thành phần là Trichoderma hoặc enzym cellulase
Hình 19: Thuốc dành cho thú nuôi Hình 20 : Phân bón sinh học có già yếu có thành phần là enzym thành phần là Trichoderma cellulase