- Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố như thành phần môi trường, thời gian nuôi cấy, độ ẩm ban đầu và nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của một số chủng nấm mốc Tricho
Giới thiệu sơ lược về cellulose
Cellulose là hợp chất sinh học phong phú vào bậc nhất và là thành phần cơ bản tạo nên thành tế bào thực vật Trong cuộc sống hàng ngày, chúng ta luôn gặp cellulose nhưng không phải ở dạng tinh khiết Nó thường tồn tại ở dạng liên kết với các polysaccharides như hemicellulose, pectin và lignin cellulose Tùy vào nguồn nguyên vật liệu mà nó chứa hàm lượng cellulose nhiều hay ít
Trong khai thác nguồn cellulose tự nhiên việc loại bỏ các cấu tử phi cellulose là rất cần thiết Điều này có thể thực hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau để tạo ra những sợi cellulose thích hợp cho các ứng dụng sau này
Hằng năm có khoảng 232 tỷ tấn chất hữu cơ được thực vật tổng hợp thành nhờ quá trình quang hợp Trong số này có 172 tỷ tấn được tạo thành ở trên đất liền và 60 tỷ tấn được tạo thành ở trong các đại dương (Bazilevit, 1971) Trong số này có đến 30% là màng tế bào thực vật mà thành phần chủ yếu là cellulose Cellulose chiếm đến 89% trong bông và 40-50% trong gỗ
Cellulose là 1 polysaccharides mạch thẳng phức tạp có cấu trúc cơ bản gồm các β-D-glucose, các gốc này liên kết nhau nhờ liên kết β-D-1.4-glucan Phân tử từ cellulose chứa từ 1400 đến 10000 gốc glucose Phân tử lượng của chúng từ các nguồn khác nhau có giới hạn khá rộng (5.104 - 1.106 và còn hơn thế nữa) Nhờ phương pháp phân tích bằng tia Rơnghen người ta biết rằng cellulose có cấu tạo dạng sợi Chiều dài của cellulose có thể lên đến 5mm Các sợi này lại gắn vào nhau nhờ liên kết hydro thành những bó nhỏ gọi là microfibril có cấu trúc không đồng nhất Chúng có những phần đặc (phần kết tinh) và những phần xốp hơn (phần vô định hình)
Cellulose là một trong những hợp chất tự nhiên khá bền vững Nó không tan trong nước mà chỉ có thể bị phồng lên do hấp thu nước, bị phân hủy khi đun nóng với acid hoặc kiềm ở nồng độ khá vào Cellulose bị thủy phân ở nhiệt độ
Nguyễn Ngọc Thái Trang 3 bình thường hoặc ở nhiệt độ 40 - 50 o C nhờ các enzym thủy phân cellulose – được gọi chung là cellulase
Trong tế bào thực vât, cellulose liên kết chặt chẽ với hemicellulose (chiếm 20-40% trọng lượng khô), đây là loại heteropolyme chứa nhiều loại monosaccharide như galactose, mannose, glucose, xylose, arabinose và các nhóm acetyl; do bản chất không kết tinh nên hemicellulose tương đối dễ bị thủy phân Cellulose còn liên kết chặt chẽ với lignin (10 - 25% trọng lượng khô) Đây là thành phần ảnh hưởng rất nhiều đến sự thủy phân cellulose của enzym Chỉ trong một số trường hợp (ví dụ trong sợi bông) cellulose tồn tại trong trạng thái một polyme gần tinh khiết
Việc sử dụng cơ chất lignocellulose để sản xuất các enzym thủy phân cơ chất này có tiềm năng ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp như hóa chất, nhiên liệu, thực phẩm, rượu và bia, thức ăn gia súc, vải sợi, bột giặt, giấy và bột giaáy…
Sơ lược về enzym
Enzym hay men là những chất hữu cơ (bản chất là protein và có thể thêm phần không phải protein – nhóm ngoại hay coenzym), có phân tử lượng lớn từ 20.000 -1.000.000, đóng vai trò xúc tác tất cả các phản ứng hóa sinh trong quá trình trao đổi chất ở các cơ thể
Các vi sinh vật rất phong phú enzym, bao gồm các enzym tổng hợp, enzym thủy phân, enzym oxy hoá - khử… ngày nay nhiều nước đã xây dựng được nền công nghiệp enzym bằng nuôi cấy vi sinh vật
Những enzym được tách ra ngoài tế bào và tham gia phân hủy thức ăn ở môi trường chung quanh gọi là enzym ngoại bào, những enzym chỉ đóng vai trò của mình trong tế bào gọi là enzym nội bào và những enzym này chỉ được tách ra sau khi đã phá hủy tế bào
Các enzym chia thành những nhóm sau:
− Enzym oxy hoá khử: các enzym này xúc tác những phản ứng trong quá trình hô hấp và lên men
− Enzym chuyển hoá: chuyển nhóm từ chất này sang chất khác
− Enzym thủy phân: xúc tác các phản ứng thủy phân hydrat cacbon, lipit, protein
− Liaza: xúc tác các phản ứng phân hủy không có nước tham gia
− Enzym đồng phân hoá: xúc tác các phản ứng đồng phân
− Enzym tổng hợp: xúc tác phản ứng kết hợp hai phân tử
Nói chung trong tế bào vi sinh vật có đủ mặt các enzym thuộc 6 nhóm trên, nhưng tùy thuộc vào chủng loại và cơ chất, số lượng enzym được hình thành để phục vụ cho nhu cầu sinh lý Có những enzym chỉ hình thành trong điều kiện có mặt một cơ chất nào đó.
Giới thiệu sơ lược về enzym cellulase
Vi sinh vật tổng hợp cellulase
Vi khuẩn sinh ra chủ yếu endoglucanase và β-glucosidase gần như không tạo ra exoglucanase
Vi khuẩn trong dạ cỏ: Ruminococcus albus (Berger, 1963; Curilov, 1971)
Vi khuẩn hiếu khí: Cellulomonas persica sp nov và Cellulomonas iranensissp.nov (Elberson, 2000)
Vi khuaồn kợ khớ: Clostridium thermocellum, Clostridium cellulovorans (Murashima,2002), Clostridium celluloliticus (Parsiegla,1998)
Nhiều loài xạ khuẩn thuộc giống Streptomyces được phát hiện có khả naêng sinh ra cellulase
Streptomyces antibioticus (Enger và Steeper,1956), Streptomyces thermoviolaceus var Pingenes (Fergus, 1969), Streptomyces cellulolyticus sp nov (Li, 1997)
Nhiều loại nấm sợi có khả năng sinh ra một lượng lớn cellulase thuộc gioáng Alteria, Trichoderma, Myrothecium, Aspergillus, Penicillium, Cladosporum… Trong đó hai giống nấm sợi Trichoderma và Aspergillus đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu để sản xuất cellulase (Bothast và Saha,1997)
Giống Trichoderma sinh tổng hợp một lượng tương đối lớn endoglucanase và exoglucanase, nhưng chỉ một lượng ít β-glucosidase, trong khi các chủng thuộc giống Aspergillus sinh ra một lượng tương đối lớn endoglucanase và β- glucosidase nhưng chỉ một lượng ít exoglucanase
Ứng dụng của enzym cellulase
Trong những năm gần đây, người ta đã bắt đầu dùng vi sinh vật để sản xuất enzym cellulase ở quy mô công nghiệp và ứng dụng rộng rãi các chế phẩm này vào mục đích khác nhau Ứng dụùng trong xử lý rỏc thải Hiện nay để xử lý rác thải khổng lồ thải ra mỗi ngày, ở một số nơi người ta dùng chế phẩm enzym cellulase để phân hủy chúng, hiệu suất khá cao, giải quyết được những loại rác thải mang bản chất cellulose và tạo ra phân hữu cơ giúp ích lại cho nông nghiệp
Tăng chất lượng sản phẩm thực phẩm và thức ăn gia súc Trong các thành phần cấu tạo nên vỏ tế bào thực vật thì cellulose là thành phần quan trọng nhất Các nguyên liệu có nguồn gốc từ thực vật nếu được gia công bằng chế phẩm cellulase thì sẽ mềm hơn, sẽ tăng hệ số đồng hoá và chất lượng sẽ tăng lên
Trong các ngành khoa học Cellulase được ứng dụng rọâng rãi trong việc phá vỡ thành tế bào của các tế bào thực vật Đặc biệt là trong nuôi cấy mô để tạo ra các tế bào trần, đây là nguyên liệu để thực hiện sự lai tạo giữa hai tế bào khác nhau để tạo ra những dòng tế bào có đặc tính của cả hai loại tế bào Hiện nay, việc sử dụng cellulase trở nên rất phổ biến trong công tác nghiên cứu chọn giống thực vật
Tăng hiệu suất trích ly các chất khác nhau từ nguyên liệu thực vật
Các acid amin, protein, vitamin từ đậu tương, thạch từ rong, chất thơm cùng các chất khác nhau trong sản xuất trà và cà phê
Thủy phân gỗ và các phế liệu gỗ Các phế liệu này rẻ tiền, chúng ta có thể dùng chế phẩm cellulase để phân hủy chúng thành đường đơn giản trong chế biến thức ăn gia súc
Cellulase được coi là có triển vọng rất lớn cho việc sản xuất glucose dùng làm thực phẩm con người, dùng làm nguyên liệu trong sản xuất công nghiệp hoặc dùng để nuôi cấy nấm men trộn vào thức ăn cho gia súc
Trong công nghệ dệt vải: giúp vải sợi mềm hơn, đồng thời làm cho thuốc nhuộm tác động dễ dàng vào vải hơn.
Toồng quan veà naỏm moỏc
Naám moác
Nấm (Mycota hoặc Fungi) là một nhóm thực vật hạ đẳng rất lớn và đa dạng Chúng không có diệp lục (chlorophill), do vậy chúng không thể tự tổng hợp được các chất hữu cơ từ khí cacbonic (CO2) Chúng cần có sẵn các chất hữu cơ trong môi trường và không khí để phát triển và hoạt động sống
Nấm có thể chia làm hai nhóm: macrophyte (nấm lớn) và microphyte (nấm hiển vi hoặc vi nấm) Nấm mốc thuộc vi nấm Chúng thường phát triển trên bề mặt cơ chất thành các dạng lông tơ mạng nhện hoặc sợi bông, một số tạo thành màng hoặc lớp mỏng Nhiều loài có ý nghĩa công nghiệp, được dùng trong sản xuất axit hữu cơ, enzym, chất kháng sinh, vitamin, một số dạng thực phẩm như tương, chao, nước chấm, phomat
Nhiều nấm mốc làm hỏng thực phẩm và hàng công nghiệp Một số gây bệnh cho người, động vật, thực vật.
Cấu tạo nấm mốc
Nấm mốc là loại thực vật không có chất diệp lục nên chúng chỉ sống được nhờ có hệ sợi bám vào các chất hữu cơ Hệ sợi của nấm mốc có một số ăn sâu vào cơ chất gọi là khuẩn ty cơ chất hay khuẩn ty dinh dưỡng, một số mọc ra
Nguyễn Ngọc Thái Trang 10 ngoài bề mặt cơ chất gọi là khuẩn ty khí sinh Những khuẩn ty khí sinh là những lông tơ màu trắng, mọc thành một lớp sợi mềm và dần dần sẽ có một vài sợi phát triển thành cơ quan sinh sản đặc biệt mang bào tử Màu sắc của bào tử sẽ đặc trưng cho màu sắc của nấm mốc khi già
Phần lớn các loài nấm mốc các hệ sợi có vách ngăn Vì vậy, chúng là loại sinh vật có cấu tạo đa bào, ở một số loài nấm bậc thấp hẹâ sợi không có vách ngăn, toàn bộ sợi khuẩn ty như một tế bào phân nhánh ( ta thấy ở các giống Mucor, Rhizopus, Absidia…)
Trong tế bào chất thường tạo thành một số khoang – Vakuol (không bào), chứa đầy dịch bào Sự tạo thành các không bào gắn liền với mức độ của chất keo protein trong tế bào chất và làm giảm khả năng giữ nước ở trạng thái liên kết Các không bào trong tế bào vi sinh vật còn có tác dụng lưu giữ các sản phẩm trao đổi có tính độc đối với tế bào mà không tách ra ngoài được vì một nguyên nhân nào đó
Nấm mốc phổ biến trong tự nhiên Chúng mọc trên cơ chất dinh dưỡng và tạo thành lớp lông mượt có màu sắc khác nhau, làm thay đổi rất nhiều thành phần hóa học của cơ chất và thải ra sản phẩm trao đổi chất Ngoài ra, cơ chất còn mang mùi khó chịu và đôi khi sản phẩm trao đổi chất của nấm mốc là những chất Mycotoxin đối với người cũng như động vật.
Sinh sản của nấm mốc
Nấm có khả năng sinh sản vô tính hay sinh sản hữu tính bằng nhiều cách khác nhau Trong sinh sản vô tính, cách đơn giản nhất là bằng mẩu sợi Một đoạn sợi nấm rơi vào cơ chất mới gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành hệ sợi nấm mới Trong nuôi cấy chìm sợi nấm bị chia thành từng mẩu ngắn và khi cấy chuyền vào dịch nuôi cấy mới thì những mẩu sợi này sẽ phát triển Người ta gọi các mẩu sợi trong nuôi cấy bề sâu (lên men chìm) là các bào tử chìm
Ngoài sinh sản mẩu sợi, nấm mốc còn sinh sản bằng bào tử đốt (Oidi), bào tử (Spora), bào tử đính (Conidia) Sinh sản bằng bào tử là một hình thức sinh sản vô tính phổ biến ở nấm mốc
Bào tử của nấm mốc là cơ quan sinh sản chứ không phải là dạng tồn tại bảo vệ như ở vi khuẩn Bào tử của nấm mốc hình thành theo nhiều cách Một trong những cách đó là bào tử hình thành trong các túi (gọi là bào tử nang), khi chín thì bào tử được giải phóng ra ngoài và theo gió bay đi rất xa, gặp điều kiện thuận lợi sẽ mọc thành khuẩn ty mới Một cách tạo thành bào tử tương đối phổ biến ở nấm mốc là một số khuẩn ty khí sinh hình thành một dạng tế bào đặc biệt hình chai, đầu các tế bào này sinh ra các bào tử (các bào tử kiểu này gọi là bào tử đính) Màu sắc của bào tử đính thường đặc trưng cho nấm mốc ở tuổi trưởng thành
Ngoài ra, nấm mốc còn có thể sinh sản theo kiểu hữu tính (có tính đực, cái) Hai đầu sợi nấm tiếp hợp với nhau rồi mọc lên một cơ thể mới.
Giới thiệu về chủng Trichoderma spp
Vị trí phân loại của Trichoderma
Trichoderma là chi nấm khá phổ biến trong tự nhiên, đặc biệt là trong môi trường đất Theo Gary J Samuels, Trichoderma ít tìm thấy trên thực vật sống và chúng không sống nội ký sinh với thực vật Ngày nay, hệ thống phân loại của nấm Trichoderma vẫn chưa rõ ràng và khá phức tạp, do đó có nhiều ý kiến khác nhau đưa ra khi phân loại giống nấm này
Theo Rifai (1969), Barnett H.L và Barry B Hunter (1972), Trichoderma spp thuộc lớp nấm bất toàn Deuteromycetes (fungi imperfect); thứ tự vị trí phân loại như sau:
Lớp: Deuteromycetes (nấm bất toàn)
Theo Agrios G.N (1997), Harman G.E (2002) haàu heát Trichoderma spp.có giai đoạn sinh sản vô tính (đây là lý do Trichoderma spp được phân loại thuộc nhóm nấm bất toàn Deutoromycetes, bộ Moniliales), tuy nhiên một vài loài Trichoderma spp cũng có khả năng sinh sản hữu tính nên được phân vào lớp nấm túi Ascomycetes, bộ Hypocreales, họ Hypocreacea, giống Hypocrea.
Đặc điểm hình thái và sinh lý
Khuẩn lạc Trichoderma spp có màu từ lục trắng đến lục, vàng xanh, lục đậm, giống này tăng trưởng rất mạnh: đường kính khuẩn lạc đạt 2 – 9 cm sau 4 ngày nuôi cấy ở 25 o C (Elisa Esposito và Manuela da Silva, 1998), khuẩn ty không màu sinh cuống mang bào tử Cuống bào tử này gọi là bào tử đính dạng hình cầu, hình elip hoặc hình thuôn, màu lục, liên kết nhau nhờ chất nhày Chúng phát triển trên nhiều loại cơ chất khác nhau (sáp, gỗ, các loài nấm khác), chúng cũng tồn tại khi nồng độ CO2 ở mức cao (10%) và sống được ở đất acid và bazô (pH = 3 – 8).
Đặc điểm sinh hóa
Trichoderma có thể sinh rất nhiều loại enzym ngoại bào như chitinase, glucanase, xylase, lipase, pectinase, cellulase, protease… để phân hủy nguồn xác bã thực vật và vách tế bào nấm bệnh trong đời sống hoại sinh và ký sinh của chúng Sau đây là một số hệ enzym điển hình ở Trichoderma
Công thức cấu tạo cellulase:
Cellulose là chất trùng hợp với tiểu đơn vị là D-glucose nối nhau bởi kiên kết β-1,4-glycosidic, cellulose được sử dụng như một nguồn năng lượng cacbon ở rất nhiều vi sinh vật tiết ra cellulase
Hệ enzym cellulase ở Trichoderma spp được phân thành 3 lớp: β-1,4-D-glucanase (cellobiohydrolase) giải phóng đơn vị cellobiosyl từ chuỗi cellulose
Endo-1,4-D-glucanase phaân caét lieân keát glucosidic beân trong caáu truùc cellulose β-1,4-D-glucanase phân cắt cello-oligosaccharide thành glucose khử
Quá trình thủy phân cellulose có sự phối hợp của ít nhất là hai enzym chlobiohydrolase, hai enzym endoglucanase và một enzym β-glucosidase (Hui et al 2001), T reesei RUT C30 được biết là chủng có khả năng tạo nhiều cellulase, T harzianum T3 cũng là một chủng rất hiệu quả khi sử dụng để kiểm soát đối với Pythium, chủng này được biết cũng tạo nhiều loại enzym cellulase
Chitin là polysaccharide có nhiều trong tự nhiên, chúng tham gia trong hầu hết cấu trúc polyme ở nấm và côn trùng, công thức hóa học: [C8H13NO5]n
Chitin có cấu tạo và chức năng gần giống với cellulose, trong tự nhiên, chitin là chất hữu cơ chiếm thứ hai sau cellulose về số lượng, chitin thay thế một phần hay toàn bộ cellulose trong thành tế bào của một số loài thực vật
Chitin là chất rắn vô định hình, không tan trong nước và hầu hết các acid, alcol, dung môi hữu cơ khác Tuy nhiên, chitin có thể bị thủy giải bởi acid vô cơ mạnh (HCl đậm đặc) hoặc bằng enzym vi sinh vật
Chitinase là enzyme thủy giải chitin, chitinase xúc tác cắt liên kết C1 và C4 của
2 đơn vị: β-1,4-N-acetylglucosamine (GlcNac) Hệ enzym chitinase được phân làm 3 lớp (Sahai và Manocha, 1993):
Chitobiosidase: enzym này giải phóng đơn vị diacetylchitobiose Endochitinase: phân cắt liên kết bên trong cấu trúc chitin ở vị trí bất kỳ, phóng thích các loại đường đa như chitotetraose, chitotriose, diacetylchitobiose; endochitinase được cho là có vai trò quan trọng trong quá trình kyù sinh naám β-1,4-N-acetylglucosaminidase phaân caét chitotetraose, chitotriose, diacetylchitobiose thành GlcNac monomer
Glucosamine là sản phẩm phân giải cuối cùng, glucosamine là một đường khử có nhóm amin tự do nên vừa có đặc tính của hexo monosaccharide vừa mang đặc tính của nhóm amino
Người ta đã tinh chế được rất nhiều enzym chitinase, trong đó phổ biến nhất là endochitinase có kích thước 42 kDa, sau đó là N-acetyl-b-D- glucosaminidase có kích thước 70 – 73 kDa Ngoài ra còn có endochitinase 37 kDa và 33 kDa (Cruz và cộng sự, 1992), chitobiosidase 40 kDa có thể hoạt động một mình hoặc kết hợp với enzym endochitinase 42 kDa (Harman và cộng sự,
1993), exochitinase 28 kDa (Dean và cộng sự, 1998), β-1,4-N- acetylglucosaminidase 102 kDa có vai trò duy nhất trong việc gây ra sự biểu hiện của các enzym thủy phân chitin khác nhưng chưa được tinh chế (Haran và cộng sự, 1995)
Enzym chitinase của Trichoderma spp được xem là enzym có hoạt tính thủy phân mạnh, hoạt động thủy phân của chitinase cũng kết hợp với các enzym khác như β-glucanase, sự phối hợp với các enzym phân giải chitin và glucan đã dẫn đến sự tăng cường hoạt động thủy phân Tuy nhiên, quan trọng hơn là chitinase làm tăng hiệu quả kháng nấm của các hợp chất không có bản chất enzym Theo báo cáo của của Lorito và các cộng sự (1994) cho biết có sự phối hợp hoạt động giữa các enzym thủy phân chitin với các hợp chất tự nhiên cũng như tổng hợp có ảnh hưởng lên màng tế bào (MAC)
2.5.3.3 Heọ enzym β-glucanase β-glucan trong vách tế bào nấm thường ở dạng β-1,3-glucan và phần nhánh là dạng β-1,6-glucan b-glucanase cũng là một hệ enzym quan trọng của
Trichoderma spp trong đặc tính ký sinh nấm, gồm 2 lớp enzym chính: β-1,3- glucanase và β-1,6-glucanase β-1,3-glucanase: là enzym phân cắt liên kế O-glycosidic của β-1,3-glucan nhờ 2 cơ chế:
Exo-β-1,3-glucanase phân cắt giải phóng glucose ở cuối chuỗi liên keát polyme
Endo-β-1,3-glucanase cắt liên kết b ở vị trí bất kỳ trong chuỗi polysaccharide, giải phóng oligosaccharide
Trichoderma spp phân giải β-1,3-glucan thường kết hợp giữa 2 hoạt tính exo và endo-β-1,3-glucanase, β-1,3-glucanase có vai trò chính trong quá trình hoại sinh và ký sinh nấm, ngoài ra β-1,3-glucanase giúp thực vật chống lại mầm beọnh
Các vách tế bào nấm bệnh khác nhau cho chất tạo ra những mức độ hoạt tính khác nhau của enzym β-glucanase, bằng chứng trực tiếp cho thấy sự liên quan của b-glucanase đối với sự vi ký sinh đã được chứng minh bởi Lorito et al
(1994), và đã tách chiết in vitro được một endo-β-1,3-glucanase 78 kDa có khả năng ức chế sự nẩy mầm của bào tử B.cinerea khi phối hợp với một GlcNAcase Ở một số chủng khác như chủng T-24, người ta cũng tách chiết được một endo β-1,3-glucanase có kích thước tương tự, có khả năng ức chế sự phát triển của Sclerotium rolfsii khi kết hợp với một endochitinase 43 kDa (El-Katatny và cộng sự, 2001) T harzianum CECT 2413 cho thấy có thể tạo ra ít nhất là 3 enzym β-1,3-glucanase ngoại bào, Lora et al (1995) đã tạo dòng gen và cDNA của một β-1,6-endoglucanase có kích thước 43 kDa, có thể ức chế sự phát triển của nhiều nấm bệnh khi phối hợp với các enzym thủy phân khác β-1,6-glucanase: trong điều kiện đặc biệt, Trichoderma spp tiết b-1,6- glucanase, enzym này phân cắt liên kết β-1,6-glucan trong vách tế bào nấm
Theo Delgado và Jarana (2000) khi khảo sát trên T harzianum đã xác định nhiều loại protease khác nhau tùy thuộc điều kiện môi trường có pH thấp và bổ sung chitin, glucose, amon… T.harzianum tiết ra protease acid như là tác nhân điều hòa, để đáp ứng nhu cầu phân hủy những protein ngoại bào như chitinase, glucanase, cellulase, ngược lại protease có tính baz hoặc trung tính được T harzianum sinh ra trong môi trường có nguồn C khó bị phân hủy như vách tế bào nấm
Người ta đã tách chiết được một protease 42 kDa không nhạy cảm với pepsatin có liên quan đến sự giảm sút enzym cellulase từ T reesei QM 9414 trong điều kiện tạo cellulase (Haab và cộng sự, 1990)
Trong một nghiên cứu khác của Dunaevesky và cộng sự (2000), một protease 73 kDa thuộc nhóm protease serin đã được tách chiết từ việc nuôi cấy T harzianum
Protease của Trichoderma spp có vai trò trong việc tấn công ký chủ bằng cách thủy phân protein vốn là một phần của bộ khung vách tế bào.
Những hoạt chất kháng nấm
Gliotoxin là chất kháng sinh từ nấm T viride, T lignorum, gliotoxin không bền và dễ bị phân hủy nhanh trong ánh sáng, phổ kháng sinh của gliotoxin bao gồm vi khuẩn (chủ yếu vi khuẩn Gram dương) và các nấm gây bệnh, hoạt tính kháng sinh của gliotoxin liên quan đến sự có mặt phân tử lưu huỳnh trong cấu tạo của chúng
Theo Dennis và Webster, T viride và T polysporum có khả năng tiết Trichodermin, T hamatum tạo ra các polypeptide có bản chất kháng sinh
Trichozianine là kháng sinh peptaibol có hoạt tính kháng nấm được phát hiện ở loài T.harzianum, Trichozianine kết hợp với những enzym thủy phân vách trong
Nguyễn Ngọc Thái Trang 18 quá trình ức chế sự nẩy mầm và kéo dài tơ nấm trong quá trình ký sinh nấm (Schirmbock, 1994)
Trichothecene từ T harzianum có hoạt tính kháng nấm (Corley et al
Tricholin là protein bất hoạt ribosome do T viride tiết ra, chúng làm giảm sự hình thành chuỗi polysome
Viridiofungin là hợp chất amonacyl alkyl citrate của T viride, kháng sinh này có phổ rất rộng
Claydon (1987) xác định được chất alkylpyrons dễ bay hơi do T harzianum ức chế nấm R solani gây bệnh héo rũ trên cải trong điều kiện invitro.
Các nghiên cứu ứng dụng Trichoderma spp
2.5.5.1 Trong lĩnh vực bảo vệ thực vật
Trichoderma spp hiện diện khắp nơi trong đất và trên các loại cây gỗ vừa bị đốn ngã là một bằng chứng thể hiện tính cạnh tranh mạnh mẽ của chúng, mặt khác nó là loài ký sinh tự nhiên đối với một số loại nấm gây bệnh thực vật, các nhà khoa học đã nghiên cứu và đưa ra những kết quả thuyết phục về khả năng kháng nấm của Trichoderma spp thông qua hoạt động ký sinh nấm
Trong một số bệnh do nấm gây ra có một số bệnh liên quan đến các bộ phận của cây dưới mặt đất (thân, rễ) rất khó trị bằng phương pháp hóa học truyền thống, vì không thể tác động toàn bộ hệ rễ bằng thuốc diệt nấm Việc khử trùng trước bằng các loại thuốc như Bromol methyl không những ít hiệu quả mà còn làm mất cân bằng vi sinh vật trong đất và gây ô nhiễm nước
Trichoderma spp là tác nhân đối kháng tự nhiên của các nấm gây bệnh trong đất và đã được ứng dụng là một tác nhân kiểm soát sinh học thành công trong nhà kính và trên ruộng, chúng là những ký sinh rất hữu hiệu trên nhiều
Nguyễn Ngọc Thái Trang 19 loại nấm gây bệnh khác nhau như: Phytophtora sp., Rhizoctonia solani, Pythium spp., Sclerotium rolfsii
Theo Emxep V.T (1898), Trichoderma spp không chỉ tiêu diệt nhiều loại nấm bệnh cây trồng trong đất mà còn có vai trò trong quá trình cải thiện cấu trúc và thành phần hóa học trong đất, đẩy mạnh sự phát triển các vi khuẩn nốt sần cố định đạm có ích trong đất và kích thích sinh trưởng và phát triển cây trồng Các sinh vật đối kháng này không chỉ ức chế các vi sinh vật gây bệnh trong vùng rễ mà những chất kháng sinh do chúng tiết ra (như trichodermin, gliotoxin) có thể xâm nhập vỏ mô tế bào cây, làm tăng tính chống chịu bệnh của cây trồng
Năm 1993, Harman và Hayes đã thử nghiệm dung hợp tế bào trần nhằm tạo ra chủng có khả năng kiểm soát bệnh hữu hiệu, một số nhà khoa học khác tập trung vào cải biến các tính trạng có liên quan đến các hoạt động đối kháng
Những loài Trichoderma spp được sử dụng phổ biến trong kiểm soát sinh học là T koningii, T harzianum, T viride, T hamatum T harzianum có thể dùng để kết hợp với những chủng Trichoderma khác hoặc đưa dưới dạng phân bón vi sinh Một số chế phẩm đã được thương mại hóa như:
− TRICHODEX (thành phần chính T harzianum)
− BINAB-T (bao gồm T harzianum và T polysporum) của Thụy Điển
− TRI 002, TRI 003 (chủng T harzianum) của Hà Lan
− T-22 Planter Box (chủng dung hợp protoblast T harzianum) của Hoa Kỳ
− Trichopel, Trichoject, Trichodowels, Trichoseal (T harzianum và T.viride) cuûa Australia
2.5.5.2 Trong lĩnh vực xử lý môi trường
Trichoderma còn có khả năng phân hủy các chất gây ô nhiễm trong đất: làm giảm bớt sự tập trung các hợp chất tự do như: 2,4,6-triclorophenol-4,5-
Nguyễn Ngọc Thái Trang 20 diclorophenol và AOX (các hợp chất halogen thấm nước, chất thải ở các nhà máy giấy) trong môi trường chứa muối khoáng
T harzianum 2023 (Khoa sinh lý thực vật Trường đại học California) có thể phân giải DDT, endosulfan, pentachloronitrobenzen, pentachlorophenol
T harzianum CCT-4790 phân giải 60% thuốc diệt cỏ Durion trong đất trong 24 giờ, đây là một tiềm năng tốt về xử lý sinh học các hóa chất ô nhiễm trong đất và trong đầm lầy.
Giới thiệu về chủng Aspergilus
Vị trí phân loại của Aspergillus
Một điều đáng chú ý về phân loại học chi Aspergillus là từ Fischer
(1897), Weher (1901), tiếp theo Thom và Church (1926), Thom và Raper (1945), Raper và Fennell (1965) đều giữ quan điểm: chỉ dùng một tên chi (tên
Aspergillus ) cho tất cả các loài tạo thành bộ máy mang bào tử trần có các đặc điểm của chi nấm này, dù các loài đó có hoặc không có giai đoạn tạo thành bào tử túi (giai đọan hữu tính) Chi Aspergillus như vậy có 2 vị trí phân loại:
Vị trí phân loại trong Nấm bất toàn (“Fungi imperfecti”):
Họ: Mucedinaceae Bộ: Hyphomycetes Lớp: Hyphomycetes
Vị trí phân loại trong lớp Nấm túi
Họ: Aspergillaceae Bộ: Plectascineae Lớp: Ascomycetes Một khuynh hướng khác không coi chi Aspergillus là một trường hợp ngoại lệ của Luật quốc tế về danh pháp thực vật như vậy, tên Aspergillus chỉ dùng cho các loài Nấm bất toàn, dù các loài đó có hay không tạo bào tử túi Mặt khác, những loài nấm có giai đoạn bào tử trần thuộc chi Aspergillus và tạo thành bào tử túi được tập hợp riêng trong các chi nấm túi Các chi nấm túi này được thành lập căn cứ chủ yếu vào các đặc điểm phân loại của bộ máy sinh bào tử túi (thể quả túi, các túi bào tử và các bào tử túi).
Đặc điểm hình thái và sinh lý
Khuẩn lạc thường phát triển nhanh, có màu từ trắng, vàng, vàng nâu, nâu cho đến đen hoặc xanh đen Hệ sợi nấm gồm các sợi ngăn vách, phân nhánh, không màu, màu nhạt hoặc trong một số trường hợp trở thành nâu hay màu sẫm ở các vùng nhất định của khuẩn lạc Bộ máy mang bào tử trần phát triển từ một tế bào có đường kính lớn hơn, màng dày hơn các đoạn lân cận của sợi nấm (tế bào chân – food cell) Giá bào tử trần phát triển từ tế bào chân, như là một nhánh của sợi nấm, gần thẳng góc với trục của tế bào chân và thường ở trên mặt
Nguyễn Ngọc Thái Trang 22 cơ chất Giá bào tử trần không có nhánh, không có hoặc có ít vách ngăn, có phần đỉnh to ra thành bọng hình chùy, hình elip, hình nửa cầu hoặc hình cầu Bọng hữu thụ này (bọng đỉnh giá) mang các thể bình Các thể bình này song song và họp thành cụm ở phần đỉnh bọng Thể bình hoặc chỉ có một tầng hoặc hai tầng Các bào tử trần được tạo thành nối tiếp nhau trong miệng thể bình, thành chuỗi hướng gốc (bào tử ở ngay miệng thể bình là bào tử non nhất, càng xa miệng thể bình càng già), không phân nhánh Bào tử trần không ngăn vách, thay đổi về hình dạng, kích thước, màu sắc, dấu vết ở mặt ngoài (nhẵn, có gai, có nốt sần) tùy từng loài Tất cả các chuỗi bào tử trần tạo thành từ các thể bình của một bọng đỉnh giá họp thành khối bào tử trần đỉnh bọng (conidial head) Khối bào tử trần đỉnh bọng có thể có các dạng hình cột (các chuỗi bào tử trần song song, sát nhau), hình cầu hoặc hình tia tỏa tròn Một số loài có bào tử túi (ascosporum) trong các thể quả kín (cleitothecium)
Ứng dụng
Một số loài được dùng trong công nghệ lên men, sản xuất enzym (amylase, protease), các acid hữu cơ (acid citric, acid glucomic),…
Aspergillus oryzae được dùng trong sản xuất tương và sản xuất rượu sake của Nhật.
Phương pháp xác định hoạt tính cellulase
Xác định hoạt tính exoglucanase (hoạt tính giấy lọc)
Theo Mandels (1975), hoạt tính giấy lọc được định nghĩa là lượng đường được tạo ra khi ủ giấy lọc Whatman No.1 (50mg) với 0,5ml dung dịch enzym ở pH 4,8 (đệm Na-citrate) trong một giờ với tổng thể tích 1,5ml
Vì phản ứng xác định hoạt tính FPU không tuyến tính, phản ứng tuyến tính là phản ứng mà sản phẩm tạo ra tỷ lệ thuận với lượng enzym trong mỗi phút của phản ứng , nên enzym phải được pha loãng đến nồng độ mà có thể thủy phân giấy lọc sinh ra 2 mg đường khử/ giờ.
Xác định hoạt tính endoglucanase
Các cơ chất là dẫn suất của cellulose hòa tan trong nước như CMC hoặc HEC được phổ biến rộng rãi Tuy nhiên, phương pháp này không xác định hoạt tính cellulase thực sự mong muốn mà chỉ xác định hoạt tính endoglucanase là chính
Phân tích hoạt tính endoglucanase bằng cách đo lượng đường khử tạo ra sau phản ứng thủy phân cơ chất CMC hay HEC bằng thuốc thử dinitrosalicylic acid hoặc thuốc thử Nelson – Somogy, hoặc sử dụng ferric cyanide theo phương pháp của Wood và McCrae (1972).
Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp Cellulase
Điều hoà sinh tổng hợp cellulase
Cellulase được sinh ra khi nấm sợi sinh trưởng trên môi trường chứa cellulose, dẫn xuất của cellulose và lactose; còn trên môi trường chứa glucose,
Nguyễn Ngọc Thái Trang 25 fructose hoặc glycerol thì cellulase không được sinh ra (Bisaria và Mishra, 1989; Béguin, 1990; Kubicek, 1993) Người ta cho rằng, các đoạn oligosacchoride ngắn được giải phóng từ cơ chất cellulose không tan, các phân tử này hoặc dẫn xuất của chúng được tế bào nấm sợi hấp thu và kích hoạt quá trình sinh tổng hợp cellulase Một trong các phân tử kích thích nấm sợi sinh tổng hợp cellulase có hiệu quả nhất là sophorose (Mandels et al., 1962 Nisizawa et al., 1971), chất này có nguồn gốc từ các phân tử celloligosaccharide Ở các loài nấm sợi có khả năng sinh ra cellulase thấp, trước tiên có lẽ do sự tấn công của cellulase vào cellulose tinh thể yếu, do đó giải phóng chất cảm ứng oligosaccharide cũng ít (Bisaria và Mishra, 1989; Kubicek, 1993) Mặt khác, sự ức chế sinh tổng hợp cellulase bởi glucose được theo dõi chi tiết trong quá trình sinh trưởng của Trichoderma trong môi trường chứa glucose, số lượng mRNA mã hóa cho cellulase thấp hơn ít nhất 1000 - 6000 lần so với các quan sát trong môi trường chứa cellulose (Penttila,1993) Tuy nhiên, khi hết glucose trong môi trường nuôi cấy, sự ức chế bởi glucose được giải phóng; hiện tượng này cũng được quan sát ở Penicillium chrysosporium Phức hợp cellulase từ chủng Aspergillus niger bị kìm hãm sinh tổng hợp khi trong môi trường có nồng độ glucose cao hoặc có glycerol ở bất kỳ nồng độ nào (Gokhale DV et al., 1991).
Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase 26 1 Nguoàn carbon
Theo lý thuyết sinh tổng hợp enzym cảm ứng, trong môi trường nuôi cấy các vi sinh vật sản sinh enzym cellulase nhất thiết phải có cellulose là chất cảm ứng và nguồn carbon
Những nguồn cellulose có thể là giấy lọc, bông, bột cellulose, lõi ngô, cám bổi, mùn cưa, bã củ cải, rơm, than bùn… Trichoderma lignorum và Trichoderma koningii được nuôi trên môi trường có nguồn carbon là giấy lọc cho
Nguyễn Ngọc Thái Trang 26 hoạt tính enzym cao nhất Kết quả cũng tương tự như vậy khi nuôi Myrothecium verrucaria trên môi trường có cơ chất là lõi ngô, bã củ cải
Chất cảm ứng enzym cellulase còn là cellobiozooctaacetat, cám mì, lactose, salixyl Đối với Stachybotris atra nguồn carbon tốt nhất để sinh tổng hợp cellulase là tinh bột (1%)
Các nguồn carbon khác (glucose, cellobiose, acetat, citrat, oxalate, succinat và những sản phẩm trung gian của chu trình Krebs) có tác dụng kìm hãm sinh tổng hợp cellulase Trong môi trường với nồng độ glucose thấp rất ít có tác dụng kích thích vi sinh vật sinh trưởng và phát triển, không cảm ứng tổng hợp enzym
Các nguồn nitơ vô cơ thích hợp nhất đối với vi sinh vật sinh cellulase là muối nitrate Đối với các giống của nấm bông (Hyphomycetales) nguồn nitơ tốt nhất lại là (NH4)2HPO4 Nói chung, các muối amon ít có tác dụng nâng cao hoạt lực enzym này thậm chí còn ức chế quá trình tổng hợp, vì trong môi trường nuôi cấy, các muối này làm acid hóa môi trường Do đó, ức chế quá trình sinh tổng hợp enzym và có thể làm mất hoạt tính enzym sau khi tạo thành
Natri nitrate làm cho môi trường kiềm hoá, tạo điều kiện thuận lợi cho sự tạo thành cellulase Các hợp chất nitơ hữu cơ có tác dụng khác nhau đến sinh tổng hợp cellulase Điều này phụ thuộc vào đặc tính sinh lý của từng chủng giống, vi dụ: cao ngô và cao nấm men có tác dụng nâng cao hoạt lực cellulase của víinh vật; nhưng với cao ngô, khả năng sinh tổng hợp exoglucanase và endoglucanase cao hơn so với cao nấm men
Nước chiết nấm men chủ yếu kích thích sự tạo thành endoglucanase Tác dụng kích thích của các hợp chất này là do sự có mặt các acid amin Các nguyên tố khoáng và những nhân tố sinh trưởng khác
Những nguyên tố khoáng như Fe, Mn, Zn, B, Mo, Cu có ảnh hưởng rõ đến khả năng tổng hợp cellulase của vi sinh vật Trong đó, Zn, Mn, Fe có tác dụng kích thích tạo thành enzym này ở nhiều chủng Nồng độ tối thích của Zn là 0,11 - 2,2 mg/l, Fe 2 –10 mg/l, Mn 3,4 - 27,2 mg/l
Biotin và thiamin trong môi trường dinh dưỡng không có ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzym này.
Phương pháp lên men bán rắn để thu nhận enzym
Trong phương pháp lên men bán rắn, vi sinh vật mọc trên bề mặt môi trường rắn (môi trường rắn trước khi nuôi cấy vi sinh vật cần làm ẩm trước) Các phụ phế phẩm nông nghiệp được xem là các cơ chất tốt nhất cho quá trình lên men bán rắn, do đó phương pháp lên men bán rắn được sử dụng để sản xuất enzym Một số cơ chất được sử dụng bao gồm: bã mía, cám mì, cám gạo, bột bắp, rơm, trấu, cây đậu nành, mạt cưa, cùi bắp, … Tuy nhiên, cám mì là cơ chất chủ yếu và được sử dụng phổ biến nhất Vi sinh vật khi phát triển sẽ lấy những chất dinh dưỡng trong môi trường và sử dụng O2 của không khí để hô hấp Để đảm bảo cho vi sinh vật mọc đều trên bề mặt môi trường cần phải mỏng, chiều dày của lớp môi trường chỉ vào khoảng 2 -5cm
Sau khi nuôi đủ thời gian để vi sinh vật tổng hợp enzym, thu lấy môi trường đem sấy nhẹ có quạt gió ở nhiệt độ 40 o C để đạt độ ẩm 8 - 12%, nghiền nhỏ, bảo quản trong bao nylong Chế phẩm này gọi là chế phẩm dạng rắn khô Muốn có chế phẩm tinh khiết phải qua giai đoạn tách và tinh chế
Phương pháp lên men bán rắn có nhiều ưu việt hơn so với phương pháp lên men chìm: môi trường lên men tương đối rẻ tiền, nồng độ enzym tạo thành ở
Nguyễn Ngọc Thái Trang 28 môi trường rắn cao hơn nhiều so với dịch nuôi cấy theo phương pháp chìm, canh trường lên men dễ dàng sấy khô và ít bị tổn hao hoạt tính enzym, không cần các thiết bị phức tạp, chủ yếu nuôi trên khay và buồng nuôi giữ ở nhiệt độ, độ ẩm thích hợp, quá trình sản xuất ít tiêu hao năng lượng.
Cơ chất dùng để cảm ứng nấm sợi sinh cellulase
Bã mía
Trên thế giới, lượng bã mía thải ra rất lớn khoảng 150 triệu tấn/năm, phần lớn chúng được sử dụng để tạo ra nhiệt điện, đốt lò hơi, phân bón hữu cơ, bột giấy, ván ép, làm chất mang trong lên men bán rắn sản xuất acid citric (Ấn Độ, Trung Quốc), hoặc trồng các loại nấm ăn…
Bã mía là phần xác của thân mía thải ra sau khi ép lấy nước mía để kết tinh đường Mỗi 100 tấn mía cây đưa vào nhà máy sẽ có 20 tấn bã thải Các nhà máy đường ở Việt Nam thường dùng bã mía để đốt lò hơi, một vài nhà máy dùng làm ván ép (nhà máy đường Hiệp Hòa ở Long An, nhà máy đường Lam
Sơn ở Thanh Hóa), phân bón hữu cơ Tuy nhiên, phần lớn không sử dụng hết đã gây ô nhiễm môi trường chung quanh
Bảng 2.2: Thành phần hóa học của bã mía (A.G.Keller, 1964)
Thành phần Bã mía (toàn bộ) Xơ bã mía
Tủy mía là một tế bào xốp như hải miên, có sức hút nước rất mạnh và khả năng giữ nước rất cao, trong bã mía còn có một lượng đường khoảng 0,5%.
Cám gạo
Cám gạo là phụ phẩm quan trọng nhất của thóc lúa, là nguồn thức ăn quan trọng trong chăn nuôi, cũng là nguồn nguyên liệu thường dùng để chế biến thức ăn tổng hợp Thóc bình quân có 10% cám, 20% trấu Năng lượng trao đổi của cám gạo 2.650 Kcal/kg, hàm lượng protein 12,5%, hàm lượng dầu 13,5%
Giá trị dinh dưỡng của cám gạo biến đổi tùy theo hàm lượng dầu và hàm lượng trấu lẫn trong cám Cám gạo rất ngon miệng khi còn tươi Cám gạo tươi không thể bảo quản lâu, dầu cám bị oxy hóa nhanh trong không khí, cám mất mùi thơm và biến chất dần Để tăng thời gian bảo quản cám gạo, người ta ép cám, tách bớt dầu (dầu cám là loại dầu thực phẩm tốt), hoặc phải sử dụng chất chống oxy hóa.
Cám mì
Cám mì là sản phẩm phụ của công nghiệp chế biến bột mì Cám mì là loại thức ăn tốt cho gia súc So với cám gạo, cám mì có hàm lượng protein cao hơn (bình quân 15,5%), ít dầu hơn (bình quân 4%), 8 – 10% xơ thô với độ ẩm từ
11 – 14%, năng lượng trao đổi bằng 2420 Kcal/kg cám mì thường có hai loại, loại màu vàng nâu nhạt hoàn toàn là vỏ cám; loại màu ngà trắng, ngoài vỏ cám còn lẫn cả tinh bột.
Rỉ đường
Rỉ đường là phụ phẩm của nhà máy đường Trong nhà máy, nước mía được cô đặc rồi kết tinh Sau ly tâm thu được đường kính và rỉ đường loại A Lặp lại quá trình đó thu được rỉ đường loại B Quá trình này lặp lại cho đến khi đường trong rỉ đường không kết tinh nữa và thu hồi được rỉ đường đen
Bảng 2.3: Bộ phận cấu thành rỉ đường (%) Đường tổng số Đường saccaroza Đườngkhử
Cứ 1 tấn mía cây thu hồi được 20 – 22kg rỉ đường đen Rỉ đường được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như
− Dùng làm nguyên liệu sản xuất cồn
− Dùng trong môi trường sản xuất men bánh mỳ, men thức ăn gia suùc, mì chính, lizin
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Vật liệu
Các chủng nấm sợi dùng trong thí nghiệm
Chuûng Trichoderma viride, Trichoderma longibranchiatum, Aspergillus ficuum, Aspergillus oryzae; các chủng nấm bệnh Sclerotium rolfsii, Pythium sp., Fusarium oxysporum được lấy từ Phòng các chất có hoạt tính sinh học của Viện sinh học nhiệt đới; được nuôi cấy trong ống nghiệm thạch nghiêng chứa môi trường PGA ở 30 o C trong 3 – 5 ngày, khi bào tử được hình thành đem bảo quản ở nhiệt độ 4 o C.
Cô chaát
Cám mì, cám gạo, trấu, bã đậu nành, vỏ cà phê, bã mía được mua ở chợ hoặc xin ở một số cơ sở, sau đó các nguyên liệu được chuẩn bị kỹ và được giữ tại Phòng các chất có hoạt tính sinh học của Viện sinh học nhiệt đới.
Dụng cụ thiết bị và hóa chất
Thuốc nhuộm lactophenol – coton để quan sát hình thái sợi nấm và bào tử nấm mốc
Thuốc thử Lugol dùng để nhuộm đĩa petri quan sát vòng phân giải
Các hóa chất dùng để chuẩn bị cho môi trường giữ giống và bổ sung vào môi trường lên men bán rắn gồm: saccharose, NaNO3, KH2PO4, MgSO4, FeSO4.7H2O, glucose, agar
Các hóa chất dùng để pha dung dịch đệm: CH3COONa.3H2O,
Các hóa chất dùng để xác định hoạt tính enzyme: glucose, CMC, giấy lọc, acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic (DNS) - lactose
Các hóa chất dùng để pha dung dịch DNS-lactose: lactose monohydrate, acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic, postassium sodium tartrate tetrahydrat, NaOH
Quang phoồ keỏ Hewlett Packard 8453 (Phaàn meàm HPUV – Vis Chemstation)
Nồi hấp TomMy-SS-325, Nhật Bản
Máy đo pH Presia, Thụy Sĩ
Caõn phaõn tớch Mettler Toledo, Thuùy Sú
Kính hiển vi quang học Olympus, Nhật Bản
Máy ly tâm Jouan CR 412, Pháp
Bộ ổn nhiệt, Memmert GmbH, Đức.
Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Phương pháp phòng ẩm quan sát cấu trúc hiển vi tơ nấm Đặt vào trong đĩa petri vô trùng 2 miếng lame, miếng này nằm lên miếng kia theo hình chữ thập Cắt một miếng thạch đã vô trùng đặt vào 2 đầu của miếng lam nằm trên Dùng que cấy cấy nấm mốc vào phần giữa của các miếng thạch Đặt lamelle vô trùng lên trên bề mặt miếng thạch vừa được cấy Đổ vào đáy đĩa petri một ít nước cất vô trùng để giữ ẩm cho đĩa petri, ủ ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ Sau khi ủ, dùng kẹp lấy lamelle có chứa tơ nấm đặt lên lame kính có chứa sẵn thuốc nhuộm
Quan sát dưới kính hiển vi cấu trúc tơ, cơ quan sinh sản của nấm mốc 3.2.2 Phương pháp xác định trực tiếp số lượng bào tử nấm sợi bằng buồng đếm hồng cầu
Buồng đếm hồng cầu dùng để đếm vi sinh vật có kích thước lớn (nấm men, bào tử nấm mốc)
Người ta dùng 2 loại buồng đếm hồng cầu: buồng đếm Thomas, và buồng đếm Goriep
Nguyên tắc cấu tạo của 2 loại buồng đếm này đều giống nhau Đó là một phiến kính hình chữ nhật, chia thành ba khoảng ngang Khoảng giữa chia thành 2 khoảng nhỏ Trên mỗi khoảng nhỏ này có kẻ một lưới đếm, gồm rất nhiều ô vuông Mỗi ô lớn có diện tích là 1/25 mm 2 lại được chia thành các ô vuông nhỏ (thường là 16 ô), mỗi ô nhỏ có diện tích là 1/400 mm 2 và chiều cao là 1/10 Như vậy, thể tích của một ô nhỏ là 1/400 mm 2 x 0,1 mm=1/4000 mm 2 hay 1/4000000 ml
Lắc đều ống nghiệm pha loãng mẫu Đậy lá kính lên lưới đếm
Dùng ống hút vô trùng lấy mẫu, cho một giọt vào mép lá kính, do sức mao dẫn, dịch mẫu dàn vào mặt trên lưới đếm Chú ý không để thành bọt khí trong lưới đếm hoặc tràn dịch mẫu xuống rãnh Đặt buồng đếm lên bàn kính hiển vi và để yên trong 3 – 5 phút, sau đó tiến hành đếm bào tử trong 5 ô lớn chéo nhau, chỉ đếm các bào tử nằm trong lòng ô con và những bào tử nằm trên 2 cạnh liên tiếp cùng chiều Đếm lần lượt từ ô con 1 đến ô con 16
Chú ý: nồng độ dịch huyền phù pha loãng sao cho mật độ trong mỗi ô nhỏ không quá 10 bào tử Số bào tử đếm được trong 5 ô lớn phải lớn hơn 200 mới bảo đảm được mức độ chính xác của phương pháp
Pha loãng mẫu: chuẩn bị một số ống nghiệm chứa 9 ml nước cất vô trùng và một số ống hút 1ml vô trùng
Cân 1 g bào tử nấm sợi cho vào ống nghiệm số 1 chứa 9 ml nước cất vô trùng, ta được độ pha loãng 1/10 hay 10 -1 Sau đó lại hút 1 ml ở ống nghiệm số 1 cho vào ống nghiệm 2, trộn đều, ta được độ pha loãng 1/100 hay 10 -2 và tiếp tục như vậy từ ống 2 sang ống 3, từ ống 3 sang ống 4… ta sẽ được các độ pha loãng tương ứng 10 -3 , 10 -4
Tính số lượng bào tử theo công thức:
N: Số lượng bào tử trong 1 ml dịch huyền phù a: Số lượng bào tử trong 5 ô lớn (80 ô con) b: Số ô con trong 5 ô lớn (16 ô x 5 = 80 ô con)
10 3 : Số chuyển mm 3 thành ml (1000 mm 3 = 1 ml) n: Độ pha loãng của mẫu
Chú ý: Sau khi sử dụng xong phải rửa ngay buồng đêùm và lau thật khô để bảo quản
3.2.3 Phương pháp xác định độ ẩm
Nguyên tắc: dựa trên nguyên lý làm khô mẫu đến trọng lượng không đổi Khối lượng mẫu mất đi khi sấy mẫu đến khối lượng không đổi là lượng nước có trong mẫu Phương pháp này loại trừ được các sai số do các phản ứng xảy ra khi sấy mẫu ở nhiệt độ cao
Cân chính xác 2 – 3 g mẫu trên cân phân tích cho vào chén đựng mẫu (được sấy khô đến khối lượng không đổi) Đặt chén đựng mẫu vào tủ sấy, mở nắp chén và sấy ở nhiệt độ cao cho đến khi khối lượng mẫu không đổi
Nguyễn Ngọc Thái Trang 35 Đậy nắp chén đã sấy khô và đưa vào bình hút ẩm để làm nguội dến nhiệt độ phòng (không dưới 1 giờ)
Cân chén đựng mẫu trên cân phân tích chính xác đến 0,001 g
Tính kết quả: Độ ẩm (%) = m1 – m2 * 100 m
Với: m1: khối lượng chén và khối lượng mẫu trước khi sấy (g) m2: khối lượng chén và khối lượng mẫu sau khi sấy (g) m : khối lượng mẫu phân tích (g)
3.2.4 Phương pháp định tính hoạt lực CMCase của một số chủng nấm moác
Pha môi trường CMC giống như trình bày ở phần phụ lục Sau khi hấp ở nhiệt độ 121 o C/15 phút, đổ vào các đĩa petri một lượng môi trường dày khoảng 2 – 5 mm Chờ cho môi trường trong thạch đĩa đông lại thì dùng dụng cụ đục lỗ để đục 1 lỗ ngay giữa đĩa môi trường Dùng pipetman hút 0,1 ml dịch huyền phù từ canh trường nuôi cấy Czapek-Dox cho vào ngay hố thạch trong đĩa Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong vòng 2 ngày, sau đó nhuộm màu bằng thuốc thử Lugol rồi quan sát vòng tròn phân giải CMC của nấm mốc
3.2.5 Phương pháp định tính hoạt lực chitinase của một số chủng nấm moác
Pha môi trường Chitin giống như trình bày ở phần phụ lục Sau khi hấp ở nhiệt độ 121 o C/15 phút, đổ vào các đĩa petri một lượng môi trường dày khoảng 2 – 5 mm Chờ cho môi trường đông lại thì dùng que cấy móc lấy một ít nấm mốc từ môi trường nuôi cấy PGA cấy vào ngay giữa đĩa thạch một điểm Ủ ở nhiệt độ
Nguyễn Ngọc Thái Trang 36 phòng trong 2 ngày, sau đó nhuộm màu bằng thuốc thử Lugol rồi quan sát vòng tròn phân giải chitin của nấm mốc
3.2.6 Phương pháp lên men bán rắn để thu nhận cellulase
Nấm sợi Trichoderma viride, Trichoderma longibranchiatum, Aspergillus ficuum, Aspergillus oryzae được nuôi cấy riêng biệt trong ống nghiệm thạch nghiêng chứa môi trường PGA ở 30 o C trong thời gian 3 ngày Sau đó cấy mỗi ống sang 1 bình môi trường Czapek-Dox lỏng có bổ sung CMC và lắc đều trong thời gian 2 ngày
Phối trộn 5 loại môi trường bán rắn sau:
− Môi trường 1: Cám mì : Cám gạo : trấu : bã đậu nành (tỷ lệ 15 : 15 : 3 : 1)
− Môi trường 2: vỏ cà phê + 5% rỉ đường
− Môi trường 3: vỏ cà phê : cám gạo (tỷ lệ 5 : 5)
− Môi trường 4: bã mía : cám mì (tỷ lệ 5 : 5)
− Môi trường 5: bã mía : cám gạo (tỷ lệ 5 : 5)
Làm ẩm bằng nước có bổ sung dung dịch dinh dưỡng Chuyển mỗi loại môi trường vào 4 bình tam giác có dung tích 250 ml, mỗi bình chứa 15g môi trường Hấp khử trùng môi trường ở 121 o C trong 15 phút, để nguội tự nhiên
Mỗi loại nấm được cấy vào 5 loại môi trường trên, mỗi loại 1 ml dịch nấm được hút từ bình môi trường lỏng Nuôi ủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian thích hợp Để xác định được các điều kiện tối ưu cũng như loại nấm sợi nào có khả năng sinh tổng hợp enzym cao nhất, ta tiến hành xác định hoạt tính enzym theo ngày và theo môi trường để chọn ra môi trường tối ưu và 2 loại nấm thuộc 2
Nguyễn Ngọc Thái Trang 37 dòng Trichoderma và Aspergillus Sau đó ta sẽ tiến hành xác định hoạt tính enzym theo độ ẩm và theo nhiệt độ
3.2.7 Phương pháp trích ly enzym cellulase
Cân 1 g môi trường bán rắn đã sấy khô và xay nhỏ, thêm 10 ml dung dịch đệm Na-acetate 50 mM pH 5, lắc trên máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 1 giờ, lọc thu dịch bằng giấy lọc Whatman No 1 Để làm giảm ảnh hưởng của đường tự do có trong canh trường lên men, đem tủa dịch lọc bằng cồn 96 o được làm lạnh trước Thu kết tủa và hòa lại bằng dung dịch đệm Na-acetate 50 mM pH 5
3.2.8 Xác định hoạt tính enzym carboxylmethyl cellulase (CMCase)
Phương pháp này dựa vào sự thủy phân cơ chất CMC bởi enzym carboxylmethul cellulase ở pH 5,0 và 40 o C lượng đường khử sinh ra được cho phản ứng với 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic acid, màu sinh ra sau phản ứng được xác định bằng phương pháp so màu trên máy quang phổ ở bước sóng 540 nm Một đơn vị hoạt tính CMCase là lượng enzym mà sẽ giải phóng đường khử (như glucose) khi thủy phõn CMC với vận tốc 1 àmol/phỳt dưới cỏc điều kiện phản ứng
