Phân lập và khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào cellulase ở một vài chủng vi khuẩn 2011

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC    BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: “Phân lập khảo sát khả sinh tổng hợp enzyme ngoại bào cellulase vài chủng vi khuẩn” HÀ NỘI – 2011 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC .ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH .vi TÓM TẮT vii PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề .1 1.2 Mục tiêu đề tài .1 1.2.1 Mục tiêu chung 1.2.2 Mục tiêu cụ thể .1 PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung cellulose cellulase 2.1.1 Giới thiệu cellulose 2.2.2 Giới thiệu cellulase 2.2 Vi sinh vật sản xuất cellulase 2.3 Các ứng dụng cellulase 2.3.1 Chất tẩy rửa công nghiệp dệt may 2.3.2 Công nghiệp giấy bột giấy 2.3.3 Trong công nghiệp thực phẩm 2.3.4 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi 2.3.5 Nhiên liệu sinh học 10 2.3.6 Trong công nghệ xử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh .11 2.4 Tình hình nghiên cứu 12 2.4.1 Nghiên cứu nước 12 2.4.2 Nghiên cứu giới 13 PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .14 3.1 Vật liệu 14 3.1.1 Đối tượng 14 3.1.2 Thiết bị 14 3.1.1 Hóa chất .15 i 3.2 Môi trường 16 3.3 Các phương pháp nghiên cứu 17 3.3.1 Phân lập vi khuẩn từ dịch nước thải nhà máy giấy 17 3.3.2 Đánh giá đặc điểm hình thái .17 3.3.3 Định tính cellulase phương pháp nhuộm Congo đỏ 18 3.3.4 Xác định hoạt độ enzyme theo phương pháp Miller 18 3.3.5 Thu nhận enzyme 20 3.3.6 Điện di SDS - PAGE 21 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 4.1 Phân lập vi khuẩn từ nguồn nước thải .23 4.2 Đặc điểm sinh học chủng PK – 26 4.3 Hoạt độ enzyme cellulase 27 4.4 Kết điện di SDS – PAGE 28 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 30 5.1 Kết luận .30 5.2 Đề nghị 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO 31 Tài liệu tiếng Việt 31 Tài liệu tiếng Anh .32 ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT APS Amonium persulphat Cellulase C1 Enzyme có hoạt tính exocellulase Cellulase Cx Enzyme có hoạt tính endocellulase CMC Carboxymethyl-cellulose CMCase Enzyme carboxymethyl cellulas Dhalo Đường kính vịng sáng DNSA 3,5-Dinitrosalicylic acid ĐC Đối chứng kDa Kilodalton OD Optical density pI Isoelectrics point SDS Sodium dodecyl sulfat SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis TEMED Tetramehtylethyenediamine U Unit V Thể tích w/v khối lượng/thể tích iii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Các vi sinh vật sử dụng sản xuất cellulose Bảng 3.1 Tên thiết bị dùng đề tài .14 Bảng 3.2 Các hóa chất sử dụng đề tài 15 Bảng 3.3 Thành phần môi trường 16 Bảng 3.4 Xây dựng đồ thị chuẩn 19 Bảng 3.5 Thành phần gel điện di SDS - PAGE 22 Bảng 4.1 Lượng đường khử sinh theo thời gian 24 Bảng 4.2 Hoạt tính cellulose ngoại bào chủng nghiên cứu .25 iv DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Một số hình ảnh cấu trúc cellulase Hình 2.2 Mơ hình enzym cellulase, sinh tổng hợp T fusca, (PDB 1JS4) Hình 2.3 Ba loại phản ứng xúc tác cellulase Hình 3.1 Thu nhận enzyme 21 Hình 4.1 Hình ảnh mẫu nước thải dịch nuôi cấy 23 Hình 4.2 Đồ thị thể lượng đường khử sinh theo thời gian 24 Hình 4.3 Hoạt tính cellulase chủng nghiên cứu .26 Hình 4.4 Hình ảnh chủng vi khuẩn PK – 27 Hình 4.5 Đồ thị chuẩn glucose 28 Hình 4.6 Hoạt tính cellulase 28 Hình 4.7 Kết điện di SDS – PAGE 29 v TÓM TẮT Từ nguồn nước thải nhà máy giấy Phong Khê, Bắc Ninh chủng vi khuẩn có khả phân hủy cellulose phân lập Hầu hết chủng phát triển tốt mơi trường chọn lọc có agar Khả sản xuất cellulase ngoại bào chủng vi khuẩn kiểm tra khuếch tán đĩa thạch nhuộm Congo đỏ Hoạt độ cellulase xác định phương pháp đường khử Trong số chủng phân lập, chúng tơi chọn chủng vi khuẩn có khả thủy phân cellulase hiệu (chủng PK – 9) Kiểm tra hoạt độ phương pháp khuếch tán đĩa thạch thu đường kính vịng sáng có kích thước 7mm Hoạt độ cellulase ngoại bào thu đạt 792,5218 U/ml dịch nuôi Enzyme ngoại bào thu cách kết tủa phân đoạn dịch nuôi cấy ethanol (80%) Kết điện di SDS-PAGE cho thấy, enzyme cellulase ngoại bào chủng vi khuẩn có kích thước khoảng 32 kDa Từ khóa: Nước thải nhà máy giấy, vi khuẩn phân hủy cellulose, hoạt tính cellulase vi PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Hằng năm có khoảng 230 tỉ chất hữu tạo từ trình quang hợp thực vật, có khoảng 70 tỉ (30%) cellulose có nguồn gốc từ sản xuất nông nghiệp, chất thải nhà máy giấy, đường dệt may Cellulose không tan nước bị thuỷ phân đun nóng với kiềm hay acid bị thủy phân enzyme cellulase (Trần Xuân Nghạch, 2005) Hiện nay, lượng phế, phụ phẩm nông nghiệp chất thải từ nhà máy gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi trường Để giải vấn đề trên, việc phân lập chủng vi sinh vật có hoạt tính phân huỷ cellulose có ý nghĩa quan trọng việc phát triển chế phẩm vi sinh vật để xử lý ô nhiễm môi trường Từ yêu cầu đó, đề tài nghiên cứu“Phân lập khảo sát khả sinh tổng hợp enzyme ngoại bào cellulase vài chủng vi khuẩn” tiến hành nhằm tạo nguồn vi sinh vật ban đầu cho nghiên cứu ứng dụng sau 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu chung Phân lập sàng lọc số chủng vi sinh vật có khả sinh enzyme celulase ngoại bào cao, tập trung vào đối tượng vi khuẩn 1.2.2 Mục tiêu cụ thể - Phân lập số chủng vi khuẩn có khả sản xuất cellulase ngoại bào - Mơ tả đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn phân lập - Đánh giá khả sản xuất enzyme ngoại bào kỹ thuật hóa sinh PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung cellulose cellulase 2.1.1 Giới thiệu cellulose Cellulose polymer hữu phổ biến tự nhiên Hằng năm lượng lớn sinh khối cellulose (1,5 x 1012 tấn) tạo thành chủ yếu từ trình quang hợp (Klemm D cộng sự, 2002) Cellulose cấu tạo từ gốc β-D glucopyranose liên kết với liên kết 1,4 glucoside Có cơng thức cấu tạo (C 6H10O5)n hay [C6H7O2(OH)3]n n nằm khoảng 5000-14000, thành phần chủ yếu cấu tạo nên vách tế bào thực vật (Đinh Văn Hùng, Trần Văn Chiến, 2007) Trong gỗ kim, cellulose chiếm khoảng 41-49%, gỗ rộng chiếm 43-52% thể tích Hình 2.1 Một số hình ảnh cấu trúc cellulase Các mắt xích β-D-Glucose cellulose Hình ảnh ba chiều hợp chất cao phân tử Cellulose: Màu nâu - carbon, màu đỏ -oxy, màu trắng – hydro 2.2.2 Giới thiệu cellulase Các chất thải có nguồn gốc cellulose vi sinh vật phân hủy nhiều enzyme khác Cellulase thủy phân cellulose (liên kết 1,4 – β- D – glucoside) tạo sản phẩm glucose, cellobiose cello-oligosaccharides Có loại enzyme cellulose chính: - Cellobiohydrolase (CBH 1,4-β-D-glucan cellobioydrolase, EC 3.2.1.91): Enzym cắt đầu không khử chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose Khối lượng phân tử enzyme thuộc nhóm khoảng 53 - 75 kDa Các enzyme khơng có khả phân giải cellulose dạng kết tinh mà làm thay đổi tính chất hóa lý chúng - Endo-β-1,4-cellulase (EG endo-1,4-β-D-glucan 4-glucanohydrolase, EC 3.2.14) có khối lượng phân tử khoảng 42 – 49 kDa Chúng hoạt động nhiệt độ cao tham gia phân giải liên kết β-1,4 glucosid cellulose lichenin β-D-glucan Sản phẩm trình phân giải cellodextrin, cellobiose, glucose - β-glucosidase (BG-EC 3.2.1.21): có khả hoạt động pH rộng (pH 4,4 – 4,8), khối lượng phân tử khoảng 50 – 98 kDa, pI = 8,4 hoạt động nhiệt độ cao β-glucosidase tham gia phân hủy cellobiose, tạo thành glucose (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Enzyme thủy phân cellulose tách thành nhiều thành phần, chẳng hạn enzyme cellulase vi sinh vật bao gồm nhiều CBH, nhiều EG có β-glucosidase Hệ thống hoàn chỉnh bao gồm CBH celulase, EG BG phối hợp để chuyển đổi cellulose thành glucose Các enzyme exocellobiohydrolases endocellulases hoạt động để thủy phân cellulose thành đoạn ngắn oligosaccharides Các oligosaccharides (chủ yếu cellobiose) sau thủy phân để tạo glucose β-glucosidase (Bguin P Henrissat B, 1994) Celulase tổng hợp từ nhiều nguồn khác tự nhiên, chủ yếu có nguồn gốc từ vi sinh vật vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc số loại nấm men Do ưu điểm thời gian sinh trưởng, kích thước, hiệu suất sản sinh enzyme nên vi sinh vật thường sử dụng để sản xuất chế phẩm enzyme Cellulase sử dụng công nghiệp dệt (Gusakov AV cộng sự, 2000; Belghith H cộng sự, 2001), chất tẩy rửa (Maurer KH, 1997; Kottwitz B Schambil F, 2005), ngành công nghiệp giấy (Buchert J cộng sự, 1996), cải thiện thức ăn chăn nuôi (Lewis GE cộng sự, 1996), công nghiệp thực phẩm