PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1 Kho¸ luËn tèt nghiÖp PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1 1 Đặt vấn đề Là một nước nông nghiệp đang phát triển như nước ta, các nông sản và các sản phẩm từ chăn nuôi đóng một vai trò rất quan trọng Lạc và[.]
Kho¸ ln tèt nghiƯp PHẦN - MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Là nước nông nghiệp phát triển nước ta, nông sản sản phẩm từ chăn ni đóng vai trị quan trọng Lạc ngơ hai nơng sản, ngồi việc sử dụng làm thực phẩm, chúng chủ yếu làm thức ăn chăn ni Với điều kiện khí hậu nóng ẩm nước ta lạc ngơ lại nguồn chất lí tưởng cho nấm mốc phát triển Khi phát triển ngô, lạc nấm mốc sử dụng chất dinh dưỡng, gây tổn thất lượng chất hạt Không thế, số loài nấm mốc phát triển chúng sinh loại độc tố khác gọi chung mycotoxin Nguy hiểm hơn, độc tố có khả theo thức ăn vào thể, gây độc cho người động vật kinh tế Việc sử dụng biện phòng trừ độc tố nấm mốc khuyến cáo sử dụng Tuy nhiên, nhiễm nấm mốc độc tố nấm mốc nói chung nhiễm aflatoxin ngơ lạc mức độ cao giới hạn cho phép tránh Chính cần phải có biện pháp khử nhiễm độc tố nấm mốc, đặc biệt aflatoxin độc tính nguy gây ung thư Trên giới nay, việc nghiên cứu để tìm pháp làm giảm lượng độc tố aflatoxin lương thực nói chung ngơ, lạc nói riêng nhà khoa học quan tâm Ở nước ta, từ năm 1970 Nguyễn Phùng Tiến cộng [9] nghiên cứu mức nhiễm nấm mốc thóc kho bảo quản lương thực miền Bắc Việt Nam số lương thực đậu, đỗ, lạc , Đặng Hồng Miên [5] nghiên cứu nhiễm nấm mốc aflatoxin trờn lc Nguyễn Thị Minh Châu lớp: 04-02 Khoa CNSH Kho¸ ln tèt nghiƯp Nguyễn Thùy Châu cộng [1] nghiên cứu tình hình nhiễm độc tố nấm mốc ngô gạo biện pháp phịng trừ Một số cơng trình Đậu Ngọc Hào nhiễm nấm mốc aflatoxin thức ăn gia súc biện pháp khử độc tố aflatoxin NH4OH nghiên cứu công bố [7] Nguyễn Thùy Châu cộng [1] nghiên cứu khử aflatoxin ngô NH3 Ca(OH)2, kết cho thấy tác dụng khử aflatoxin hai hóa chất rõ rệt hiệu cao Tuy nhiên, việc khử nhiễm aflatoxin hóa chất NH3 có giá thành cao để lại mùi khó chịu cho nông sản bị xử lý Để khắc phục nhược điểm này, năm qua, nhiều cơng trình nghiên cứu khử nhiễm aflatoxin biện pháp sinh học nhiều nhà khoa học tập trung nghiên cứu thu số kết hứa hẹn Để góp phần vào việc nghiên cứu khử nhiễm aflatoxin biện pháp sinh học, tiến hành nghiên cứu đề tài : “Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn vi nấm có khả khử aflatoxin nhiễm ngơ lạc mức độ cao” Ngun ThÞ Minh Châu lớp: 04-02 Khoa CNSH Khoá luận tốt nghiÖp 1.2 Mục tiêu nội dung nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu Tìm số chủng Flavobacterium aurantiacum Rhizopus delemar có hoạt tính khử nhiễm aflatoxin mức độ cao khả ứng dụng chúng khử nhiễm aflatoxin ngô lạc 1.2.2 Nội dung nghiên cứu - Phân lập số chủng Flavobacterium aurantiacum từ số mẫu đất thu thập số tỉnh miền Bắc Việt Nam - Phân lập số chủng Rhizopus delemar từ số mẫu nông sản, thực phẩm quýt, xoài, gạo mốc, bánh men thuốc bắc - Xác định hoạt tính khử aflatoxin chủng Flavobacterium aurantiacum phân lập - Xác định hoạt tính khử aflatoxin chủng Rhizopus delemar phân lp c Nguyễn Thị Minh Châu lớp: 04-02 Khoa CNSH Kho¸ ln tèt nghiƯp PHẦN - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đại cương độc tố nấm mốc Độ tố nấm mốc (hay gọi mycotoxin) nhóm hợp chất có cấu trúc đa dạng, có khối lượng phân tử nhỏ, tạo trao đổi thứ cấp nấm mốc gây ngộ độc với động vật có vú, cá gia cầm [14] Ngồi tự nhiên có nhiêu lồi nấm khác phát triển sản phẩm ngũ cốc, hạt bông, lúa mì nhiều loại hợp chất hữu Tuy nhiên, có vài lồi nấm sinh độc tố ảnh hưởng đến gia súc, gia cầm người Sự sản sinh độc tố nấm mốc kết tác động qua lại kiểu gen (genotype) điều kiện phát triển nấm mốc Độc tố nấm sản phẩm chuyển hóa thứ cấp trình phát triển nấm mốc [6] Quá trình trao đổi thứ cấp hiểu q trình tạo thành chất mà vai trị sinh lý chúng chưa rõ,chưa thật cần thiết cho tồn tế bào Sự chuyển hóa thứ cấp thường xảy cuối giai đoạn phát triển tế bào nấm mốc Tính độc loài nấm lớn định biết đến từ lâu, đến năm 1960 Bệnh độc tố nấm mốc nghiên cứu sâu Khi đó, giới bàng hoàng 100 000 gà tây nước Anh chết bệnh X ăn lạc bị nhiễm nấm mốc Aspergillus flavus Những số liệu có giá trị mycotoxin bệnh mycotoxin thu nhận từ lĩnh vực thú y học Nghiên cứu động vật thực nghiệm cho thấy tính độc mycotoxin lớn Bệnh nấm mốc người động vật khơng có khả lây lan chúng tác nhân độc tố (hóa học ) gây ra.Tuy nhiên, tất sản phẩm thực vật chất cho phát triển nấm mốc tạo Nguyễn Thị Minh Châu lớp: 04-02 Khoa CNSH Khoá ln tèt nghiƯp mycotoxin tiếp theo, có khả nhiễm trực tiếp cho thực phẩm người Khi gia súc ăn thức ăn có nhiễm mycotoxin, chúng không chịu tác dụng trực tiếp mà nguồn mang mycotoxin vào sữa, thịt, tạo nhiễm mycotoxin cho người Độc tố nấm mốc thu hút quan tâm toàn cầu chúng đe dọa đến sức khỏe người động vật thiệt hại nghiêm trọng kinh tế [8] Điều chứng tỏ nhiều hội nghị, hội thảo quốc tế , tạp chí nghiên cứu dành cho vấn đề có tính cấp thiết Cho đến có 300 loại độc tố nấm phát nghiên cứu Nhưng có 20 loại mycotoxin có thực phẩm mức độ nghiêm trọng thường liên quan đến an toàn thực phẩm 2.2 Độc tố aflatoxin Năm 1961, Butler người xác định loài nấm Aspergillus flavus tiết độc tố gây bệnh X gà tây ông đặt tên aflatoxin viết tắt Afla toxin Trong mycotoxin aflatoxin phát sớm nghiên cứu đầy đủ phương diện Các aflatoxin gồm bốn hợp chất nhóm bis-furanocaumarin, sản phẩm trao đổi chất, tạo nấm Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus đặt tên B1, B2, G1, G2 Các aflatoxin thường nhiễm sản phẩm thực vật Các công thức cấu tạo số aflatoxin chất trao đổi liên quan đến aflatoxin B1, G1 aflatoxin B2, G2 dẫn xuất dihydro hợp chất mẹ Các aflatoxin M1 M2 chất trao đổi hydroxylat hóa B B2 theo thứ tự, chúng có cơng thức cấu tạo nh sau: Nguyễn Thị Minh Châu lớp: 04-02 Khoa CNSH Kho¸ ln tèt nghiƯp O O O O O O O OCH3 O O Aflatoxin B1 O O O O O OH OH OCH3 O O O Aflatoxin M2 O O O OCH3 O Aflatoxin M1 O OCH3 Aflatoxin B2 O O O O O O O O OCH3 O O OCH3 Aflatoxin G2 Aflatoxin G1 Bốn chất phân biệt sở màu phát quang chúng B chữ viết tắt Blue (màu xanh nước biển), G chữ viết tắt Green (màu xanh cây) Aflatoxin B1 B2 sữa bò chuyển hóa gọi aflatoxin M1 aflatoxin M2 (M chữ viết tắt Milk) Trong bốn loại aflatoxin, aflatoxin, aflatoxin B1 tìm thấy nồng độ cao nhất, sau G1, cịn B2 G2 tồn nồng độ thấp Các aflatoxin phát quang mạnh ánh sáng cực tím sóng dài Điều cho phép phát hợp chất nồng độ thấp(0,5 ng hay thấp vết sắc kí mỏng) Nó cung cấp điểm mặt thực hành cho tất phương pháp hóa lý cho việc phát định lượng Aflatoxin M1 nồng độ 0,22mg/l phát sữa lỏng Các aflatoxin hịa tan dung mơi phân cực nhẹ cloroform metanol, đặc biệt tan nhiều dimetylsulfoxit (dung mụi thng Nguyễn Thị Minh Châu lớp: 04-02 Khoa CNSH Kho¸ ln tèt nghiƯp sử dụng phương tiện việc áp dụng aflatoxin động vật thực nghiệm) Tính tan aflatoxin nước giao động từ 10 -20 mg/l Các aflatoxin bền nhiệt độ cao, làm nóng khơng khí Tuy nhiên tương đối khơng bền để khơng khí tia cực tím phiến sắc kí mỏng đặc biệt hịa tan dung mơi có độ phân cực cao Các aflatoxin không bị phân hủy phá hủy điều kiện nấu bình thường làm nóng trùng Tuy nhiên, lạc rang làm giảm đặc biệt lượng aflatoxin aflatoxin bị phá hủy hồn tồn với việc xử lí mạnh amoniac hay hypochlorit Sự có mặt vịng lacton phân tử aflatoxin làm chúng cảm với việc thủy phân môi trường kiềm Đặc tính quan trọng q trình chế biến thực phẩm q trình xử lí kiềm làm giảm nhiễm aflatoxin sản phẩm Tuy nhiên, xử lí kiềm nhẹ việc axit hóa làm phản ứng ngược trở lại để tạo aflatoxin ban đầu Moreau cộng nghiên cứu tính chất aflatoxin đưa kết sau: Nguyễn Thị Minh Châu lớp: 04-02 Khoa CNSH Kho¸ ln tèt nghiƯp Bảng 2.1 Tính chất hóa lý số aflatoxin Công Trọng thức phân lượng tử phân tử * ** B1 C17H12O6 312 268-269 265-270 252-266 Xanh lam B2 C17H14O6 314 286-289 305-309 280-283 Xanh lam G1 C17H12O7 328 244-246 247-250 246-247 Xanh lục G2 C17H14O7 330 229-231 237-240 Xanh lục M1 C17H12O7 328 299 Xanh lam tím M2 C17H14O7 320 293 Tím Aflatoxin Nhiệt độ nóng chảy *** Huỳnh quang Ghi chú: * Kết Townsend ** Kết Stubblefield cộng *** Kết Beljaars 2.2.1 Sự tạo thành aflatoxin nấm mốc Sự tạo thành aflatoxin chủ yếu thấy hai chủng A.flavus A.parasiticus Các chủng tạo aflatoxin A.flavus phổ biến thường phân lập từ nguồn khác lạc, hạt bông, hạt gạo, lúa Theo số liệu Schoroder Boller (1976), có từ 20-98% chủng phân lập A.flavus có khả tạo aflatoxin Ngồi hai lồi A.flavus A.parasiticus cịn có số lồi khác có khả sinh aflatoxin yếu A.nominus (Samson 2001, Varga etall 2003) A.bombycis (Varga et all 2003) Sản lượng aflatoxin thường tỉ lệ với trọng lượng với hệ sợi nấm tạo thành nuôi cấy: số lượng hệ sợi nấm đạt giá trị tối ưu sản lượng aflatoxin lớn nhất, giảm sút nhanh chóng lúc hệ sợi nấm tự phân giải Sự sản sinh aflatoxin điều kiện nuôi cy thụng thng bt u Nguyễn Thị Minh Châu líp: 04-02 Khoa CNSH Kho¸ ln tèt nghiƯp từ lúc hình thành quan mang bào tử đính A.flavus, tăng dần đến giai đoạn sinh bào tử mạnh mẽ Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh độc tố aflatoxin chủng nấm mốc, nhiệt độ, hoạt độ nước, yếu tố môi trường… Các nhiệt độ cực tiểu, tối thích, cực đại cho tạo aflatoxin 12 oC, 27oC 40 – 42oC theo thứ tự Một số chủng nấm mốc bị hoạt tính sau nhiều lần cấy chuyển liên tiếp mơi trường khơng thích hợp, khả sinh độc tố tăng chủng nấm mốc cấy chuyển mơi trường thích hợp Mơi trường có bổ sung nấm men pepton axit amin với điều kiện pH, nhiệt độ thích hợp (pH=5 – 5,4; nhiệt độ 26 – 28oC) điều kiện tốt cho tạo thành độc tố aflatoxin 2.2.2 Sự nhiễm aflatoxin ngô lạc Cho tới nay, có mặt aflatoxin phát nhiều loại nông sản, thực phẩm 50 nước hầu hết châu lục Aflatoxin làm thiệt hại kinh tế cho nghành trồng trọt chăn nuôi lớn [9] Theo đánh giá FAO, ước lượng có khoảng 25% tất loại ngũ cốc bị ảnh hưởng độc tố nấm mốc [10] Mặc dù aflatoxin tìm thấy nhiều loại lương thực, thực phẩm khác hầu hết nhiễm tập trung xác định lạc ngơ chủ yếu * Tình hình nhiễm aflatoxin ngô, lạc giới Những nghiên cứu Ablas K cộng [13] cho thấy nhiễm aflatoxin ngô nấm Aspergillus flavus gây nên vấn đề nghiêm trọng vùng trồng ngô đồng Missisipi Mỹ Trong năm nghiên cứu từ 2000 đến 2002, tác giả nghiên cứu mức nhiễm A.flavus ngô hạt năm 2000 dao động từ -100% (trung bình 15% hạt ngơ bị nhiễm), hàm lượng aflatoxin ngô dao động từ n 1590 ppb (trung bỡnh l Nguyễn Thị Minh Châu líp: 04-02 Khoa CNSH Kho¸ ln tèt nghiƯp 57ppb) Mức nhiễm aflatoxin phân bố ngẫu nhiên ngơ ngồi đồng không tương quan với với nhiễm A.flavus Tuy nhiên, 84% A.flavus phân lập từ hạt ngơ có khả tạo aflatoxin Ở Thái Lan, 35% mẫu ngô nhiễm aflatoxin B1 (mức trung bình 400μg/kg) 40% mẫu nhiễm aflatoxin B1 (mức trung bình 133μg/kg) tìm thấy Uganda 97% mẫu đảo Cebu, Philippin trung bình 213μg/kg [18] Theo Goto cộng [12], 80 -85% số mẫu ngô thu thập từ kho bảo quản mùa mưa 1984 – 1985 Thái Lan nhiễm aflatoxin B1 với liều lượng 6,30 – 1310 ppb Còn lạc, năm 1973, nghiên cứu lạc bóc vỏ nước Mĩ cho thấy 15% 361 mẫu có aflatoxin giới hạn từ vết đến 50μg/kg Stoloff, Krof Hald tìm thấy aflatoxin 86,5% 52 mẫu sản phẩm lạc nhập vào Đan Mạch làm thức ăn gia súc, mẫu có 3,465μg/kg Các aflatoxin tìm thấy 41% số mẫu tất cẩ mẫu bơ lạc kiểm tra năm 1967-1968, có aflatoxin với giá trì 155μg/kg giá trị trung bình 500μg/kg * Tình hình nhiễm aflatoxin ngô, lạc Việt Nam Ở nước ta có số tác giả nghiên cứu mức độ nhiễm aflatoxin ngô, lạc Nguyễn Thùy Châu cộng nghiên cứu thấy mức độ nhiễm aflatoxin ngô miền Nam miền Bắc Việt Nam tương đối cao, từ 73,3% đến 95,8% hàm lượng aflatoxin trung bình cao 63,8 ppb hàm lượng aflatoxin trung bình thấp 16,25% ppb tỉnh khác [3] Đậu Ngọc Hào [6] xác định tỉ lệ nhiễm aflatoxin B1 168 mẫu nguyên liệu sản xuất thức ăn chăn nuôi, tỉ lệ nhiễm ngô hạt 33%, ngô bột 74,2%, khô lạc 84,7% Theo kết nghiên cứu Viện y tế cộng đồng TPHCM gần 95% thức ăn gia súc có chứa aflatoxin B1, bên cạnh thực phẩm sử dụng cho người có chứa loại độc tố (68% mẫu lạc sản phẩm từ lạc) [8] Ngoài cịn có Đặng Hồng Miên nghiên cứu nhiễm nấm mc v aflatoxin trờn lc [5] Nguyễn Thị Minh Châu líp: 04-02 Khoa CNSH