Đề cương khóa luận tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic và khảo sát điều kiện lên men sinh tổng hợp gamma aminobutyric acid

Tính cấp thiết của đề tài Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển không ngừng của khoa học kỹ thuật và nhu cầu cuộc sống ngày càng nâng cao, vấn đề sức khỏe đời sống con người ng

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

- -

ĐỀ CƯƠNG KHÓA LUẬN TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN LACTIC VÀ

GAMMA-AMINOBUTYRIC ACID

Hà Nội – Tháng 03/2023

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

- -

ĐỀ CƯƠNG KHÓA LUẬN : Phân viện Công nghệ sinh học Trung tâm Nhiệt đới Việt - Nga

THÔNG TIN VỀ SINH VIÊN THỰC HIỆN KHÓA LUẬN

1 Họ và tên sinh viên: Nguyễn Thị Mai Mã SV: 642546

2 Địa chỉ liên hệ: Ký túc xá C – Học Viện Nông nghiệp Việt Nam5 3 Chuyên ngành: Công nghệ hực phẩmt

5 Giáo viên hướng dẫn 1: TS Vũ Duy Nhàn Giáo viên hướng dẫn 2: TS Vũ Quỳnh Hương

6 Địa điểm thực tập: Phòng Sinh hóa Phân – viện Công nghệ sinh học – Trung tâm Nhiệt đới Việt - Nga

Sinh viên thực hiện

(Ký và ghi rõ họ tên)

Nguyễn Thị Mai

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv

I ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 2

1.2.1 Mục tiêu 2

1.2.2 Yêu cầu 2

II TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3

2.1 Giới thiệu về vi khuẩn lactic 3

2.2 Tổng quan về γ -Aminobutyric acid (GABA) 3

2.2.1 Giới thiệu về GABA 3

2.2.2 Hình dạng và cấu trúc của GABA 3

2.2.3 Chức năng của GABA 4

2.2.4 Sinh tổng hợp GABA 4

2.2.5 Các nguồn sinh tổng hợp GABA 5

2.2.6 Tình hình nghiên cứu về GABA 6

III ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

3.3 Nội dung nghiên cứu 9

3.4 Môi trường nghiên cứu 9

3.5.2 Phương pháp phân tích thí nghiệm 11

IV DỰ KIẾN KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC 144.1 Kết quả tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh tổng hợp GABA 14

4.2 Kết quả định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn bằng phương pháp sinh học phân tử 14

4.3 Kết quả khảo sát điều kiện lên men sinh tổng hợp GABA của chủng

tuyển chọn 14V KẾ HOẠCH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI 15

TÀI LIỆU THAM KHẢO 16

DANH MỤC CÁC T Ừ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Tiếng anh hoặc tên khoa học

I ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển không ngừng của khoa học kỹ thuật và nhu cầu cuộc sống ngày càng nâng cao, vấn đề sức khỏe đời sống con người ngày càng được chú trọng hơn cũng như nhu cầu sử dụng các thực phẩm chức năng ngày một tăng lên, iệc nghiên cứu và tìm ra các hợp chất có hoạt tính sinh học v quan trọng ứng dụng trong thực phẩm chức năng được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học Trong đó, Gamma-aminobutyric acid (GABA) là một hợp chất được nghiên cứu rất nhiều trong thời gian gần đây GABA là một amino acid có tác dụng giảm hoạt động của các neuron thần kinh và ức chế sự lan truyền của các tế bào dẫn truyền, từ đó giảm stress, căng thẳng, chứng mất ngủ và còn giảm thiểu nguy cơ mắc các bệnh về tim mạch, tiểu đường và cholesterol trong máu (Jin và cs., 2013 ).

GABA được tổng hợp từ nhiều nguồn khác nhau, trong đó nhiều nghiên cứu tập trung về sinh tổng hợp GABA từ vi sinh vật do chu trình phát triển ngắn, quá trình nuôi cấy dễ thực hiện, môi trường nuôi cấy rẻ và dễ kiếm, đặc biệt là từ vi khuẩn lactic (LAB) (Lê Thị Huyền Trang và Đỗ Thị Bích Thủy, 2020) LAB là nhóm vi sinh vật được ứng dụng nhiều trong sản xuất và bảo quản thực phẩm, đặc biệt trong các sản phẩm lên men truyền thống như lên men sữa, thịt (Dương Minh Khải, 2013) LAB không chỉ tạo ra acid lactic, ethanol, hợp chất thơm, bacteriocin (And và Hoover, 2003) mà hơn hết LAB đã được các nhà khoa học nghiên cứu ứng dụng để lên men và thu được hàm lượng lớn GABA Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới liên quan đến việc tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp GABA cao và tối ưu hóa điều kiện lên men sinh tổng hợp GABA (Li và cs., 2010)

Một số chủng LAB sinh tổng hợp GABA đã được nghiên cứu như Lactobacillus Lactococcus Lactobacillus Brevis, , … được phân lập từ nhiều loại thực phẩm lên men Chủng Lactococcus lactis subsp lactis được phân lập từ kim chi sinh tổng hợp GABA với nồng độ cao được xác định là 3,68 g/l trong môi trường MRS lỏng với 1% monosodium glutamate (MSG) (Lu và cs., 2008) Trong shochu của

Nhật Bản, các acid glutamic tự do có nồng độ 10,50 mM chuyển đổi thành GABA có nồng độ 10,18 mM bởi Lactobacillus brevis IFO-12005 (Yokoyama và cs., 2002) Chủng Lactobacillus brevis NCL 912 phân lập từ paocai Trung Quốc đã thu được nồng độ GABA trong dịch lên men tối ưu là 149,05 mM (Li và cs., 2008)

GABA được sản xuất từ LAB có hàm lượng cao, an toàn cho người sử dụng Bên cạnh LAB thì các yếu tố lên men khác nhau cũng ảnh hưởng đến tỷ lệ GABA được sinh tổng hợp khác nhau Trong đó các yếu tố phổ biến và cần thiết là pH, nhiệt độ, thời gian nuôi cấy, cơ chất tham gia tổng hợp GABA… (Dhakal và cs., 2012)

Mặc dù nhiều nghiên cứu về chủng vi khuẩn lactic được phân lập từ các nguồn thực phẩm và xác định là sinh tổng hợp GABA, tuy nhiên nghiên cứu thêm về các đặc tính sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn lactic cũng như điều ện sinh tổng hợp ki GABA là điều cần thiết vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài: , “Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic và khảo sát điều kiện lên men sinh tổng hợp gamma – aminobutyric acid”

1.2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 1.2.1 Mục tiêu

Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp được gamma aminobutyric acid (GABA) và xác định được các điều kiện lên men sinh tổng hợp GABA

1.2.2 Yêu cầu

- Tuyển chọn được các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp GABA; - Định danh được chủng vi sinh vật tuyển chọn;

- Khảo sát được các điều kiện lên men sinh tổng hợp GABA của chủng tuyển chọn

II TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

2.1 Gi i thiớệu về vi khu n lactic ẩ

Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, thường không di động, không kháng acid, không có cytochrome và catalase âm tính (ngoại trừ Fructobacillus) Các LAB bao gồm cả dạng cầu khuẩn và trực khuẩn LAB từ lâu đã được sử dụng như các chủng vi khuẩn khởi đầu cho quá trình lên men của nhiều loại thực phẩm và đồ uống nhờ vai trò của chúng trong việc tạo hương vị, phát triển mùi thơm và làm chậm sự hư hỏng (De Vuyst và Degeest, 1999) Trong y học, nhóm vi khuẩn lactic sản xuất ra các loại kháng sinh được dùng làm thuốc để chữa các bệnh về nhiễm khuẩn, nhiễm nấm… (Lahtinen và cs., 2011)

2.2 Tổng quan về γ -Aminobutyric acid (GABA)

2.2.1 Giới thiệu về GABA

GABA là một amino acid khá phổ biến trong tự nhiên GABA được biết đến đầu tiên như là một thành phần trong mô củ khoai tây, được phân bố rộng rãi trong tự nhiên, bao gồm động vật, thực vật và vi sinh vật GABA có vai trò quan trọng trong hệ thống thần kinh trung ương (Abe và cs., 1995) GABA cho thấy hiệu quả cải thiện rối loạn giấc ngủ liên quan đến việc dùng rượu GABA có thể hạ huyết áp, có tác dụng lợi tiểu, chống tiểu đường, có vai trò trong việc kiểm soát sự lo lắng, cơn đau của cơ thể, giảm hàm lượng lipid trong huyết thanh và ức chế sự tăng sinh tế bào ung thư, cải thiện trí nhớ và khả năng học tập (Dhakal và cs., 2012)

Năm 1883, GABA lần đầu tiên được tổng hợp và được biết đến như một sản phẩm trao đổi chất thực vật và vi khuẩn (Cooper và cs., 2003) Đến năm 1950, GABA được phát hiện là một phần không thể thiếu của hệ thần kinh trung ương của động vật có vú (Cooper và cs., 2003)

2.2.2 Hình dạng và cấu trúc của GABA

Gamma – aminobutyric acid là một amino acid không tham gia cấu tạo nên protein

Tên IUPAC: 4 – aminobutanoic acid Công thức phân tử: C4H NO92

Khối lượng phân tử: 103,12 g/mol Điểm nóng chảy: 203,7 ℃ (477 K, 399 ℉)

GABA là chất rắn, có khả năng hòa tan trong nước với độ tan khoảng 1300mg/ml ở 25℃

GABA có cấu trúc 4C, bao gồm nhóm amino (NH ) nhận proton và nhóm acid 2

cacboxylic (COOH) cho proton, và gốc R, chủ yếu được tìm thấy ở dạng lưỡng cực Trong trạng thái khí, GABA có dạng cuộn xoắn cao do lực tĩnh điện giữa hai nhóm chứng năng Trong trạng thái rắn, nó lại được tìm thấy ở dạng cấu trúc thẳng, cấu hình trans ở nhóm amino và cấu trúc cis ở cuối nhóm cacboxyl, đây là do tương tác với các phân tử lân cận Ở trạng thái lỏng, GABA tồn tại ở cả dạng gấp khúc và thẳng Điều này giúp GABA có thể thực hiện nhiều chức năng sinh học quan trọng (Nguyễn Thị Anh Đào, 2018)

2.2.3 Chức năng của GABA

GABA là một loại amino acid không thể thiếu cho cơ thể, cần thiết để duy trì sự hoạt động bình thường của não bộ, đặc biệt là các neuron thần kinh Chất này có khả năng ngăn chặn sự hoạt động thái quá của các neuron thần kinh tại hệ thống thần kinh trung ương và ức chế sự lan truyền của tế bào dẫn truyền để tăng cường cảm giác thư thái trong hệ thần kinh Đây là chất ức chế dẫn truyền tự nhiên được cơ thể sản sinh, có tác dụng giúp thư giãn thần kinh và có giấc ngủ ngon GABA cùng với niacinamide và inositol, có khả năng giảm bớt căng thẳng và lo âu tới vùng thần kinh trung ương bằng việc chiếm giữ các vùng tiếp nhận thông tin của các tế bào này, khống chế các vùng tiếp nhận tin Do đó, GABA giúp làm giảm căng thẳng, giúp ngủ ngon, giảm huyết áp và giúp an thần (Hayakawa và cs., 2004)

2.2.4 Sinh tổng hợp GABA

Con đường sinh tổng hợp GABA được mô tả như sau: L glutamate được tạo - ra từ alpha ketoglutarate bằng các phản ứng chuyển hóa và được xúc tác bởi enzym - glutamate dehydrogenase, sau đó diễn ra quá trình các cơ chất L glutamte dưới sự -

Sản xuất GABA bằng vi khuẩn lactic thì monosodium glutamate (MSG) được xem như một cơ chất quan trọng (Kook và cs., 2010) MSG là một dạng muối của glutamic acid MSG trong tự nhiên sinh ra từ amino acid mà được tìm thấy trong đa số các thực phẩm như phomai, sữa, thịt, cá và nhiều loại rau khác nhau

Cơ chất chính trong quá trình hình thành GABA chính là glutamate, sau đó GABA sinh ra sẽ được chuyển hóa tiếp tạo thành succinic semialdehyde và cuối cùng tạo thành sản phẩm GHB (ở dịch tế bào) và succinate (ty thể lạp) Ngoài ra ta cũng có thể thu được glutamate từ con đường dị hóa lysine (Bouché và cs., 2004) 2.2.5 Các nguồn sinh tổng hợp GABA

2.2.5.1 Tách chiết từ tự nhiên

Trong tự nhiên, GABA được phân bố rộng rãi, đặc biệt là trong não của các động vật có vú Ngoài ra, các thụ thể GABA còn được tìm thấy ở con người trong nhiều cơ quan và mô, bao gồm não, hệ thống thần kinh trung ương, phổi, gan, đường tiêu hóa, tinh trùng, tinh hoàn, tuyến vú và các tế bào khối u gan Một số loại thực vật và ngũ cốc cũng chứa một lượng nhỏ GABA như mầm cám gạo, giá đỗ, đậu tương, cà chua, chuối, rau bina, lá chè xanh… GABA cũng được tìm thấy ở một số vi sinh vật như vi khuẩn lactic, nấm men, nấm mốc (Kim và cs., 2009)

Mặc dù GABA được tìm thấy với hàm lượng lớn trong não của động vật có vú, nhưng không thể sử dụng những nguồn này để sản xuất GABA Hàm lượng GABA sinh tổng hợp được tìm thấy trong thực vật lại thấp Vì vậy, sử dụng vi sinh vật để sản xuất GABA đem lại nhiều ưu điểm hơn cả.

2.2.5.2 Sinh tổng hợp GABA từ vi khuẩn

GABA ch yủ ếu được hình thành b ng phằ ản ứng 𝛼 – decarboxylation không nghịch đảo của axit L – glutamic hoặc muối của nó, được xúc tác bởi enzyme glutamic acid decarboxylase (GAD) Enzyme này được tìm thấy ở vi khuẩn như Lactobacillus (Bertoldi và cs., 1999), Escherichia (Rice và cs., 1993), Streptococcus, Aspergillus (Kato và cs., 2002) và Neurospora (Kubicek và cs., 1979 Tuy nhiên vi khuẩn Lactobacillus là loại phổ biến nhất để sản xuất GABA vì vi khuẩn lactic có những hoạt tính sinh lý đặc biệt và có thể xem như khá an toàn trong quá trình sử dụng vào

mục đích chăm sóc sức khỏe cho con người

GABA được sản xuất từ vi khuẩn lactic có bản chất từ tự nhiên và an toàn cho sức khỏe Nhiều sản phẩm được làm tăng hàm lượng GABA bằng sử dụng GABA sản xuất từ vi khuẩn lactic được phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống như kim chi, pho mai, sữa chua (Kim và cs., 2009; Li và cs., 2008) Tiềm năng sản xuất GABA của LAB được nhiều nghiên cứu như sữa chua, pho mai (Park và Oh, 2007; Rizzello và cs., 2008), kim chi (Park và Oh, 2007) và paocai (Li và cs., 2008) Việc sàng lọc vi khuẩn lactic dựa vào khả năng tổng hợp GABA có thể đem lại triển vọng mới cho quá trình sản xuất GABA

2.2.6 Tình hình nghiên cứu về GABA

2.2.6.1 Tình hình nghiên cứu về GABA trên thế giới

Tại Hàn Quốc, nhóm tác giả Lee (2013) đã nghiên cứu quá trình sản xuất GABA bằng cố định GAD Các tác giả đã phát triển công nghệ sản xuất GABA bằng cách cố định GAD phân lập từ Escherichia coli Thông qua việc nghiên cứu hoạt động của enzyme cụ thể và đặc tính phản ứng, acid glutamic được ưu tiên chọn hơn monosodium glutamate (MSG) để làm cơ chất chính cho GAD cố định

Nhóm tác giả Lacroix và cộng sự (2013) đã nghiên cứu khả năng sản xuất GABA của các chủng Lactococcus được phân lập từ phô mai Họ đã phát hiện ra 9 chủng trong tổng số 50 chủng riêng biệt trong hai mẫu phô mai có khả năng sản xuất GABA Trong đó, ULAAC – A13 và ULAAC – A23 có khả năng sản xuất GABA lên đến 50 mg/300 ml sữa lên men Nghiên cứu này cho thấy các chủng vi sinh vật sản xuất GABA trong phô mai cứng và phô mai mềm dưới những điều kiện sản xuất GABA phổ biến

Nhóm tác giả Jannoey (2010) ở Thái Lan cũng đã nghiên cứu quá trình tích lũy GABA ở gạo trong suốt thời gian nảy mầm T eo các tác giả, dù các giống gạo h có hàm lượng axit glutamic khác nhau, nhưng hàm lượng GABA trong gạo không có

nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất GABA 2.2.6.2 Tình hình nghiên cứu về GABA ở Việt Nam

Đề tài nghiên cứu của Trịnh Tất Cường (201 ) về nghiên cứu quy trình sản 2 xuất GABA từ dịch lên men cám gạo bằng Lactobacillus để ứng dụng làm thực phẩm chức năng đã thu được những thành công nhất định Đề tài đã xây dựng được quy trình sản xuất GABA từ lên men dịch cám gạo bằng Lactobacillus plantarum KLEPT Hàm lượng GABA thu được tương đối cao, đạt tới 660mM

Quách Thị Việt và cộng sự (2013) đã có nghiên cứu trên chủng vi khuẩn Lactobacillus brevis NCTH24 có khả năng sinh tổng hợp GABA ứng dụng trong Bio-yogurt Chủng vi khuẩn này được đánh giá là có khả năng chuyển hóa glutamate thành GABA cũng như có các tính chất probiotic như khả năng sống sót trong môi trường dạ dày và dịch ruột nhân tạo

Theo nghiên cứu của Cung Thị Tố Quỳnh và cộng sự (2012) về xây dựng quy trình sản xuất gạo mầm (gạo GABA) từ gạo lứt nảy mầm Kết quả nghiên cứu cho thấy có thể sản xuất được gạo GABA từ nguồn nguyên liệu gạo lứt Huyết Rồng và Jacmine của Việt Nam Hàm lượng GABA từ gạo mầm thu được khá lớn, gấp 5 lần (140 ppm) so với gạo lứt nguyên liệu Đề tài đã mở ra một hướng ứng dụng cho việc sản xuất các loại gạo dinh dưỡng có giá trị kinh tế cao tại Việt Nam

III ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng nghiên cứu

3.1.1 Nguyên liệu

Các chủng vi khuẩn lactic trong bộ sưu tập giống tại Phân viện Công nghệ sinh học – Trung tâm Nhiệt đới Việt Nga-

3.1.2 Hoá chất, thiết bị và dụng cụ

3.1.2.1 Hóa chất

Các hóa chất sử dụng trong quá trình nuôi cấy, định lượng, được sản xuất từ các hãng lớn và tinh khiết như: Merck, Sigma, Himedia…

3.1.2.2 Thiết bị

Các thiết bị máy móc tại Phân viện Công nghệ sinh học bao gồm: - Máy lắc ổn nhiệt (Tây Ban Nha)

- Cân điện tử (Trung Quốc) - Nồi hấp khử trùng (Sanyo, Nhật) - Tủ sấy (Sanyo, Nhật)

- Tủ cấy (Sanyo, Nhật) - Máy li tâm (Đức)

- Kính hiển vi quang học BX51 (Olympus, Nhật) - Máy đo quang phổ (Mỹ)

Cùng các thiết bị liên quan khác

3.1.2.3 Dụng cụ

Đĩa petri, pipette các loại, ống eppendorf, đèn cồn, bình tam giác các loại, ống nghiệm, bình định mức, que cấy…

3.2 Phạm vi nghiên cứu