Khảo sát khả năng sinh tổng hợp nisin của một số chủng vi khuẩn lactic ứng dụng trong bảo quản thực phẩm

N QUẢN L KHU N NG NGHI P TRUN T MN N ỨU V P NG NGH T TR ỂN N N N O TP HCM P N N O BÁO CÁO NGHI M THU KHẢO SÁT KHẢ NĂN SN TỔNG HỢP NISIN CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN LACTIC ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẨM KS Phạm Thị Thì CN Nguyễn Văn Lượng Th nh ph Ch Minh, h ng 01/2017 BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHI P CÔNG NGH CAO TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHI P CÔNG NGH CAO BÁO CÁO NGHI M THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đ ng nghiệm thu) KHẢO SÁT KHẢ NĂN SN TỔNG HỢP NISIN CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN LACTIC ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẨM Ơ QU N Ủ TRÌ (Ký tên, đóng dấu xác nhận) Th nh ph CHỦ NHI M ĐỀ TÀI (Ký tên) Ch Minh, h ng 01/2017 TÓM TẮT ĐỀ T Đề tài khảo sát khả sinh tổng hợp nisin 06 chủng vi khuẩn lactic Lactococcus lactis spp lactis, Lactobacillus casei, Lactobacillus garvieae, Lactobacillus acidophilus, LTD 003, LTD 005 Kết cho thấy, hai chủng vi khuẩn LTD 003, LTD 005 nhận diện với cặp mồi 27F 1492R giải trình tự gen 16S rRNA, so sánh với gen 16S rRNA vi khuẩn GenBank chƣơng trình BLAST N chủng LTD 003 có tỷ lệ tƣơng đồng 99% với dịng Lactobacillus fermentum, chủng LTD 005 có tỷ lệ tƣơng đồng 97% với dịng Lactobacillus brevis Mơi trƣờng MRS thích hợp cho sinh trƣởng dịch thô vi khuẩn lactic sau ni cấy, dịch tăng sinh hai chủng vi khuẩn Lactobacillus fermentum Lactobacillus acidophilus có khả kháng vi khuẩn thị Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, Lactobacillus plantarum cao Ở thời gian nuôi cấy dịch thô 36 pH 6,5 chủng vi khuẩn Lactobacillus fermentum Lactobacillus acidophilus có khả kháng khuẩn tốt Dịch thô sau nuôi cấy kết tủa phƣơng pháp ammonium sulphate chủng vi khuẩn Lactobacillus fermentum với hàm lƣợng nisin thô đạt 20,83 µg/ml (833,2 IU/ml) chủng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus không phát hàm lƣợng nisin thô Trang 3/130 BM20-QT.QLKH MỤC LỤC Trang TÓM TẮT ĐỀ TÀI DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH SÁCH BẢNG, ĐỒ THỊ .8 DANH SÁCH HÌNH 10 TH NG TIN ĐỀ TÀI 11 MỞ ĐẦU 12 hƣơng TỔNG QUAN TÀI LI U 13 1.1 Tổng quan Bacteriocin 13 1.1.1 Bacteriocin 13 1.1.2 Sinh tổng hợp bacteriocin vi khuẩn lactic 14 1.1.3 Những bacteriocin quan trọng 15 1.1.3.1 Plantaricin 15 1.1.3.2 Plantaricins JK, EF 15 1.1.3.3 Plantaricin S Plantaricin W 15 1.1.3.4 Nisin 15 1.1.3.4.1 Vi sinh vật sinh tổng hợp nisin 16 1.1.3.4.2 Tính chất nisin 16 1.1.3.4.3 Cấu trúc phân tử nisin 17 1.1.3.4.4 Khả diệt khuẩn nisin 18 1.1.3.4.5 chế tác dụng nisin 19 1.1.4 Ứng dụng bacteriocin nisin 20 1.2 Tuyển chọn tinh bacteriocin 22 1.3 Sơ lƣợc Lactic acid bacteria 25 1.4 Phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp 25 1.5 Tình hình nghiên cứu nƣớc 27 1.5.1 Tình hình nghiên ngồi nƣớc 29 1.5.2 Tình hình nghiên cứu nƣớc 30 HƢƠNG NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 36 2.1 Nội dung 1: Tiếp nhận, sàng lọc chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính kháng Trang 4/130 BM20-QT.QLKH khuẩn 36 2.1.1 Thí nghiệm 1: Sơ nhận định chủng vi khuẩn lactic 36 2.1.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá sinh trƣởng khả sinh hợạt tính kháng khuẩn loại môi trƣờng 37 2.2 Nội dung 2: Khảo sát ảnh hƣởng điều kiện ni cấy hoạt tính dịch thơ thu nhận chủng vi khuẩn lactic 39 2.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu 40 hƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 3.1 Nội dung 1: Tiếp nhận, sàng lọc chủng vi khuẩn lactic có khả sinh hoạt tính kháng khuẩn 42 3.1.1 Thí nghiệm 1: Sơ nhận định chủng vi khuẩn lactic 42 3.1.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá khả sinh trƣởng khả sinh hoạt tính kháng khuẩn loại môi trƣờng 45 3.1.2.1 Khảo sát ảnh hƣởng loại mơi trƣờng ni cấy hoạt tính dịch thô thu nhận lên thử nghiệm đối kháng Escherichia coli 45 3.1.2.2 Khảo sát ảnh hƣởng loại môi trƣờng nuôi cấy hoạt tính dịch thơ thu nhận lên thử nghiệm đối kháng Salmonella typhimuriu 48 3.1.2.3 Khảo sát ảnh hƣởng loại môi trƣờng nuôi cấy hoạt tính dịch thơ thu nhận lên thử nghiệm đối kháng Listeria monocytogenes 50 3.1.2.4 Khảo sát ảnh hƣởng loại môi trƣờng nuôi cấy hoạt tính dịch thơ thu nhận lên thử nghiệm đối kháng Lactobacillus plantarum………………… 52 3.1.2.5 Khảo sát ảnh hƣởng loại môi trƣờng nuôi cấy hoạt tính dịch thơ thu nhận lên thử nghiệm đối kháng qua độ đục dịch canh trƣờng 53 3.1.2.6 Khảo sát ảnh hƣởng loại môi trƣờng nuôi cấy lên hàm lƣợng nisin phƣơng pháp HPL - MS 79 3.2 Nội dung 2: Khảo sát ảnh hƣởng pH thời gian nuôi cấy hoạt tính dịch thơ thu nhận chủng vi khuẩn lactic 62 3.2.1 Khảo sát ảnh hƣởng pH thời gian cấy hoạt tính dịch thơ thu nhận lên thử nghiệm đối kháng Escherichia coli 81 Trang 5/130 BM20-QT.QLKH 3.2.2 Khảo sát ảnh hƣởng pH thời gian cấy hoạt tính dịch thơ thu nhận lên thử nghiệm đối kháng Samonella typhimuium 83 3.2.3 Khảo sát ảnh hƣởng pH thời gian cấy hoạt tính dịch thơ thu nhận lên thử nghiệm đối kháng Listeria monocytogenes 85 3.2.4 Khảo sát ảnh hƣởng pH thời gian cấy hoạt tính dịch thô thu nhận lên thử nghiệm đối kháng Lactobacillus plantarum 86 3.2.5 Khảo sát ảnh hƣởng pH thời gian cấy hoạt tính dịch thơ thu nhận lên thử nghiệm đối kháng qua độ đục dịch canh trƣờng 87 3.2.6 Khảo sát ảnh hƣởng pH thời gian lên hàm lƣợng nisin phƣơng pháp HPL - MS 93 hƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 95 4.1 Kết luận 95 4.2 Đề nghị 95 PHỤ LỤC 1: TÀI LI U THAM KHẢO 102 PHỤ LỤC 2: THÀNH PHẦN CÁC LOẠI M I TRƢỜNG .90 PHỤ LỤC 3: XỬ LÝ SỐ LI U VÀ SÁ K ĐỒ 114 PHỤ LỤC 4: Á H ĐỔI HÀM LƢỢNG NISIN THEO TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 10637:2015.……………… ……………………………………………… 130 Trang 6/130 BM20-QT.QLKH D N S Ữ V ẾT TẮT Viết tắt Thuật ngữ tiếng viết ctv Cộng tác viên CT Cải thiện Đ Đối chứng HPLC High Performance Liquid Chromatography LAB Lactic Acid Bacteria TN Thí nghiệm TSA Tryptic Soy Agar TSB Tryptic Soy Broth Trang 7/130 BM20-QT.QLKH D N Số 1.1 2.1 2.2 3.1 S BẢN , ĐỒ T Ị Tên bảng Trang Phƣơng pháp tinh bacteriocins từ Lactic acid bacteria vi sinh vật liên quan Ảnh hƣởng loại mơi trƣờng ni cấy cấy hoạt tính dịch thô thu nhận Ảnh hƣởng pH thời gian cấy hoạt tính dịch thơ thu nhận Ảnh hƣởng loại môi trƣờng nuôi cấy hoạt tính dịch thơ thu nhận lên thử nghiệm đối kháng Escherichia coli 21 31 34 39 Ảnh hƣởng loại môi trƣờng nuôi cấy hoạt tính 3.2 dịch thơ thu nhận lên thử nghiệm đối kháng Salmonella 42 typhimurium Ảnh hƣởng loại môi trƣờng ni cấy hoạt tính 3.3 dịch thơ thu nhận lên thử nghiệm đối kháng Listeria 43 monocytogenes Ảnh hƣởng loại môi trƣờng nuôi cấy hoạt tính 3.4 dịch thơ thu nhận lên thử nghiệm đối kháng Lactobacillus 45 plantarum Ảnh hƣởng loại mơi trƣờng ni cấy hoạt tính 3.5 dịch thô thu nhận lên thử nghiệm đối kháng qua độ đục dịch 46 canh trƣờng 3.6 3.7 Định lƣợng hoạt tính bacteriocin phƣơng pháp HPL - MS Ảnh hƣởng pH thời gian nuôi cấy hoạt tính dịch 48 50 Trang 8/130 BM20-QT.QLKH thơ thu nhận lên thử nghiệm đối kháng Escherichia coli Ảnh hƣởng pH thời gian ni cấy hoạt tính dịch 3.8 thô thu nhận lên thử nghiệm đối kháng Salmonella 51 typhimurium Ảnh hƣởng pH thời gian ni cấy hoạt tính dịch 3.9 thơ thu nhận lên thử nghiệm đối kháng Listeria 52 monocytogenes Ảnh hƣởng pH thời gian nuôi cấy hoạt tính dịch 3.10 thơ thu nhận lên thử nghiệm đối kháng Lactobacillus 54 plantarum Ảnh hƣởng pH thời gian ni cấy hoạt tính dịch 3.11 thô thu nhận lên thử nghiệm đối kháng qua độ đục dịch canh 55 trƣờng 3.12 Định lƣợng hàm lƣợng nisin phƣơng pháp HPL - MS 57 3.13 Định lƣợng hàm lƣợng nisin phƣơng pháp HPL - MS 58 3.1 Biểu đồ hàm lƣợng nisin phƣơng pháp HPL - MS 51 Trang 9/130 BM20-QT.QLKH DANH SÁCH HÌNH Tên hình ảnh Số 3.1 Hình thái chủng vi khuẩn lactic Trang 38 Ảnh hƣởng loại môi trƣờng ni cấy hoạt 3.2 tính dịch thơ thu nhận lên thử nghiệm đối kháng Escherichia 41 coli 3.3 Ảnh hƣởng pH thời gian nuôi cấy hoạt tính dịch thơ thu nhận lên thử nghiệm đối kháng Escherichia coli 51 Ảnh hƣởng pH thời gian ni cấy hoạt tính 3.4 dịch thô thu nhận lên thử nghiệm đối kháng Listeria 54 monocytogenes Trang 10/130 BM20-QT.QLKH Lactobacillus brevis môi trƣờng TSB Trang 137/130 BM20-QT.QLKH Lactobacillus fermentum môi trƣờng MRS Trang 138/130 BM20-QT.QLKH # RT [min] Area 11.6 6969441 Library Height Area Frac % 56278 100.0 Lactobacillus brevis môi trƣờng MRS Trang 139/130 BM20-QT.QLKH # RT [min] Area 11.1 655582 Library Height Area Frac % 7341 100.0 Lactobacillus casei môi trƣờng MRS Trang 140/130 BM20-QT.QLKH # RT [min] Area 11.2 1561203 Library Height Area Frac % 12294 100.0 Lactococcus lactis spp lactis môi trƣờng MRS Trang 141/130 BM20-QT.QLKH # RT [min] Area 10.1 Library Height Area Frac % 10132972 176060 81.9 10.6 1279395 5185 10.3 10.9 962392 9775 7.8 Lactobacillus acidophilus môi trƣờng MRS # RT [min] Area 10.4 4360667 Library Height Area Frac % 30461 100 Trang 142/130 BM20-QT.QLKH # RT [min] Area 10.4 4360667 Library Height Area Frac % 30461 100 Trang 143/130 BM20-QT.QLKH PHỤ LỤ 4: ĐỔ M LƢỢNG NISIN THEO TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 10637:2015 PHỤ GIA THỰC PHẨM - NISIN Food additives - Nisin Lời nói đầu T VN 10637:2015 đƣợc xây dựng dựa sở JECFA (2013), Nisin; TCVN 10637:2015 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F4 Gia vị phụ gia thực phẩm biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lƣờng Chất lƣợng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố PHỤ GIA THỰC PHẨM - NISIN Food additives - Nisin Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn áp dụng cho hợp chất nisin đƣợc sử dụng làm phụ gia thực phẩm Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm công bố áp dụng phiên đƣợc nêu Đối với tài liệu viện dẫn khơng ghi năm cơng bố áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi, bổ sung (nếu có) TCVN 6469:2010, Phụ gia thực phẩm - Phương pháp đánh giá ngoại quan xác định tiêu vật lý TCVN 8900-2:2012, Phụ gia thực phẩm - Xác định thành phần vô - Phần 2: Hao hụt khối lượng sấy, hàm lượng tro, chất không tan nước chất không tan axit TCVN 8900-6:2012, Phụ gia thực phẩm - Xác định thành phần vô - Phần 6: Định lượng antimon, bari, cadimi, crom, đồng, chì kẽm đo phổ hấp thụ nguyên tử lửa TCVN 8900-8:2012, Phụ gia thực phẩm - Xác định thành phần vơ - Phần 8: Định lượng chì cadimi đo phổ hấp thụ nguyên tử dùng lò graphit JECFA 2006, Combined compendium of food additive specifications, Volume 4: Analytical methods, test procedures and laboratory solutions used by and referenced in the food additive Trang 144/130 BM20-QT.QLKH specifications (Tuyển tập quy định kỹ thuật phụ gia thực phẩm, Tập 4: Các phương pháp phân tích, quy trình thử nghiệm dung dịch phịng thử nghiệm sử dụng viện dẫn yêu cầu kỹ thuật phụ gia thực phẩm) Mô tả 3.1 Thuật ngữ định nghĩa 3.1.1 Nisin (nisin) Hỗn hợp polypeptit tƣơng tự có tính kháng khuẩn đƣợc hình thành chủng vi khuẩn Lactococcus lactis subsp lactis điều kiện lên men thích hợp Polypeptit chủ yếu có đƣợc từ q trình lên men nisin A Nisin đƣợc tạo thành môi trƣờng tiệt trùng bao gồm sữa bột không béo sản phẩm lên men không chứa sữa nhƣ chất chiết nấm men chất khô cacbohydrat Thời gian pH trình lên men đƣợc kiểm sốt đạt đƣợc lƣợng nisin tối ƣu Từ môi trƣờng lên men, nisin đƣợc cô đặc, thu hồi tinh phƣơng pháp khác nhƣ hút vô trùng, lọc màng, axit hóa, tách chiết muối, siêu lọc sấy phun Nisin tinh đƣợc tiêu chuẩn hóa natri clorua để đạt đƣợc hoạt độ mong muốn chế phẩm nisin Nisin ổn định khơng khí đƣợc gia nhiệt điều kiện axit (cho đến pH = 3) Chế phẩm nisin thƣơng mại chứa hàm lƣợng nisin 2,5 % (khối lƣợng) hàm lƣợng natri clorua lớn 50 %, thành phần cịn lại chế phẩm chất khơ sữa sản phẩm lên men bao gồm protein cacbohydrat 3.1.2 Hoạt độ nisin (activity of nisin) Lƣợng nisin cần để kìm hãm phát triển tế bào vi khuẩn ml canh thang Hoạt độ nisin đƣợc biểu thị đơn vị quốc tế (IU) IU nisin tƣơng đƣơng với 0,025 µg 3.2 Kí hiệu INS (mã số quốc tế phụ gia thực phẩm): C.A.S (mã số hóa chất): 234 1414-45-5 3.3 Cơng thức hóa học: C143H230O37N42S7 3.4 Cơng thức cấu tạo (xem Hình 1) Trang 145/130 BM20-QT.QLKH CHÚ DẪN: Abu: axit alpha-aminobutyric, Dha: dehydroalanin, Dhb: dehydrobutyrin Hình - Cơng thức cấu tạo nisin 3.5 Khối lƣợng phân tử: Khoảng 3354 3.6 Chức sử dụng: Chất bảo quản kháng vi sinh vật HÚ THÍ H: Lƣợng ăn vào hàng ngày chấp nhận đƣợc (ADI) nisin từ mg/kg thể trọng đến mg/kg thể trọng Các yêu cầu 4.1 Nhận biết 4.1.1 Ngoại quan Bột mịn, màu trắng đến màu nâu sáng 4.1.2 Độ hòa tan Tan đƣợc nƣớc không tan dung môi không phân cực CHÚ THÍCH: Theo TCVN 6469:2010, chất đƣợc coi “tan đƣợc” cần từ 10 đến dƣới 30 phần dung mơi để hịa tan phần chất tan, chất “không tan” cần từ 10000 phần dung mơi trở lên để hịa tan phần chất tan 4.1.3 Phân biệt với chất kháng khuẩn khác Phải có phản ứng đặc trƣng khác biệt với chất kháng khuẩn khác 4.1.4 Hoạt độ nisin Mẫu thử có hoạt tính nisin Trang 146/130 BM20-QT.QLKH 4.2 Các tiêu lí - hóa Các tiêu lí - hóa nisin theo quy định Bảng Bảng - Chỉ tiêu lí - hóa nisin Tên tiêu Mức Hoạt độ nisin, IU/mg, không nhỏ 900 a) Hao hụt khối lƣợng sau sấy 1050C h, % khối lƣợng, 3,0 không lớn Hàm lƣợng natri clorua, % khối lƣợng, khơng nhỏ 50 Hàm lƣợng chì, mg/kg, không lớn 1,0 a) Tƣơng đƣơng với hàm lƣợng nisin 22,5 μg/mg 4.3 Các tiêu vi sinh Các tiêu vi sinh nisin theo quy định Bảng Bảng - Chỉ tiêu vi sinh nisin Tên tiêu Giới hạn Salmonella Không đƣợc có 25 g mẫu Coliform tổng số Khơng lớn 30 FU g mẫu Escherichia coli Khơng đƣợc có 25 g mẫu Phƣơng pháp thử 5.1 Xác định độ hòa tan, theo 3.7 TCVN 6469:2010 5.2 Phép thử phân biệt với chất kháng khuẩn khác 5.2.1 Độ bền môi trƣờng axit Cho g mẫu thử vào lít dung dịch axit clohydric (H l) 0,02 N để thu đƣợc dung dịch 1000 IU/ml Pha loãng dung dịch 1000 IU/ml axit clohydric 0,02 N đến nồng độ 50 IU/ml Đun sôi dung dịch xác định hoạt độ nisin theo 5.3 Trang 147/130 BM20-QT.QLKH Nồng độ nisin tính đƣợc mẫu đun sơi phải đạt 100 % (± %) giá trị định lƣợng cho biết hoạt độ tổn thất không đáng kể sau trình xử lí nhiệt 5.2.2 Độ khơng bền môi trƣờng kiềm Chỉnh pH dung dịch nisin đến 11 cách thêm dung dịch natri hydroxit (NaOH) N Gia nhiệt dung dịch 65o 30 min, sau để nguội Chỉnh pH đến cách nhỏ giọt dung dịch axit clohydric Xác định lại hoạt độ nisin theo 5.3 Hoạt tính kháng khuẩn nisin hồn tồn sau q trình xử lý 5.2.3 Khả tồn vi khuẩn Lactococcus lactis mơi trƣờng có nồng độ nisin cao Chuẩn bị chủng Lactococcus lactis (ATCC 11454, NCIMB 8586) sữa tách chất béo tiệt trùng (chất béo sữa < %) ủ ấm 18 h, nhiệt độ 300C Chuẩn bị nhiều bình nón chứa 100 ml sữa quỳ (litmus milk), tiệt trùng nhiệt độ 1210C 15 Cho 0,1 g mẫu vào sữa quỳ đƣợc tiệt trùng để nhiệt độ phịng h Thêm vào 0,1 ml mơi trƣờng L lactis ủ 300C 24 h Vi khuẩn L lactis phát triển dịch mẫu có nồng độ khoảng 1000 IU/ml; nhiên, vi khuẩn L lactis không phát triển nồng độ tƣơng tự chất kháng khuẩn khác Phép thử không phân biệt đƣợc nisin subtilin 5.3 Xác định hoạt độ nisin 5.3.1 Thuốc thử vật liệu thử 5.3.1.1 Chuẩn bị vi khuẩn thử Dùng que cấy chuyển Lactococcus lactis subsp cremoris (ATCC 14365, NCDO 495) đƣợc nuôi cấy hàng ngày sữa tách chất béo tiệt trùng vào lọ McCartney có chứa sữa quỳ ủ 300C Chuẩn bị sữa chứa vi khuẩn cho phép thử cách cấy % dịch nuôi vi khuẩn 24 h vào lƣợng tỷ lệ phù hợp sữa tách béo tiệt trùng, đặt vào nồi cách thủy 30 90 Sau đem dùng 5.3.1.2 Dung dịch chuẩn gốc Cân xác lƣợng chuẩn nisin, hòa tan dung dịch axit clohydric 0,02 N để tạo thành dung dịch 5000 IU/ml Ngay trƣớc dùng, pha loãng dung dịch axit clohydric 0,02 N để thu đƣợc dung dịch 50 IU/ml Trang 148/130 BM20-QT.QLKH CHÚ THÍCH: Chế phẩm nisin hãng Sigma, St Louis, USA Fluka, Buchs, Thụy Sĩ chứa hàm lƣợng nisin 2,5 % khối lƣợng với hoạt độ tối thiểu 106 IU/g ũng sử dụng chế phẩm Nisaplin DuPont Nutrition iosciences, openhagen, Đan Mạch chứa hoạt độ tối thiểu x 106 IU/g làm dung dịch chuẩn gốc 5.3.1.3 Dung dịch resazurin, 0,0125 % (khối lƣợng/thể tích) Chuẩn bị dung dịch nƣớc trƣớc dùng 5.3.2 Chuẩn bị dung dịch mẫu thử Cân lƣợng mẫu đủ để đảm bảo ống tƣơng ứng mẫu phù hợp với dãy dung dịch chuẩn, nghĩa với giới hạn chặt chẽ, hàm lƣợng nisin mẫu chuẩn nhƣ Pha loãng dung dịch mẫu dung dịch axit clohydric 0,02 N đến hoạt độ nisin 50 IU/ml 5.3.3 Cách tiến hành Dùng pipet lấy thể tích (0,60; 0,55; 050; 0,45; 0,41; 0,38; 0,34; 0,31; 0,28; 0,26 ml) dung dịch mẫu 50 IU/ml (5.3.2) dung dịch chuẩn (5.3.1.2) cho vào hai hàng 10 ống nghiệm vi sinh đƣợc làm khơ, kích thƣớc ống inch x 5/8 inch1) Bổ sung 4,6 ml sữa cấy vi khuẩn (5.3.1.1) vào ống thiết bị pipet tự động Việc bổ sung sữa cấy vi khuẩn phải thực vào hàng ống có nồng độ mà khơng theo hàng có 10 ống Đặt ống vào nồi cách thủy nhiệt độ 300 15 min, sau làm nguội bể nƣớc đá thêm vào ml dung dịch resazurin (5.3.1.3) cho ống, theo thứ tự nhƣ bổ sung sữa cấy vi khuẩn, sử dụng pipet tự động Lắc ống Tiếp tục ủ thêm từ đến nhiệt độ 300C nồi cách thủy Kiểm tra ống dung dịch chuẩn dung dịch thử ánh sáng huỳnh quang buồng tối Ống mẫu có nồng độ cao phân biệt rõ trƣớc tiên thơng qua màu sắc (ví dụ: chuyển từ màu xanh sang màu hoa cà) đƣợc so sánh với ống dãy chuẩn để tìm đƣợc đồng màu Tìm phù hợp hai nồng độ thấp mẫu chuẩn Nội suy phù hợp bƣớc pha loãng nửa Thu đƣợc số đọc nồng độ dung dịch thử tính giá trị trung bình Tính hoạt độ nisin mẫu thử từ hoạt độ nisin chuẩn Chuyển đổi hoạt độ nisin từ IU sang microgam nisin theo hệ số chuyển đổi IU = 0,025 μg 5.4 Xác định hao hụt khối lƣợng sau sấy, theo 5.1 TCVN 8900-2:2012 1) in (1 inch) = 2,54 cm Trang 149/130 BM20-QT.QLKH 5.5 Xác định hàm lƣợng natri clorua 5.5.1 Thuốc thử 5.5.1.1 xit nitric đặc 5.5.1.2 Nitrobenzen 5.5.1.3 Dung dịch bạc nitrat, 0,1 N 5.5.1.4 Thuốc thử sắt (III) amoni sulfat [FeNH4(SO4)2.12H2O] nƣớc, % (khối lƣợng/thể tích) 5.5.1.5 Dung dịch amoni thiocyanat, 0,1 N 5.5.1.6 Nƣớc cất nƣớc có chất lƣợng tƣơng đƣơng 5.5.2 Thiết bị, dụng cụ 5.5.2.1 Cân phân tích, cân xác đến 0,1 mg 5.5.2.2 Pipet 5.5.2.3 Buret 5.5.3 Cách tiến hành Cân khoảng 200 mg mẫu thử, xác đến 0,1 mg, cho vào bình thủy tinh có nắp đậy, chứa sẵn 50 ml nƣớc Khuấy để hòa tan mẫu đồng thời thêm ml axit nitric (5.5.1.1), ml nitrobenzen (5.5.1.2), 50,0 ml dung dịch bạc nitrat 0,1 N (5.5.1.3) chuẩn hóa ml thuốc thử sắt (III) amoni sulfat (5.5.1.4) Khuấy dung dịch chuẩn độ lƣợng bạc nitrat dƣ dung dịch amoni thiocyanat 0,1 N (5.5.1.5) Kết thúc chuẩn độ xuất màu đỏ 5.5.4 Tính kết Hàm lƣợng natri clorua có mẫu thử, X, biểu thị theo phần trăm khối lƣợng, đƣợc tính theo cơng thức sau: X 58,44  50  CA  V  CB   100 w Trong đó: 58,44 khối lƣợng mol natri clorua, tính gam mol (g/mol); Trang 150/130 BM20-QT.QLKH 50 thể tích dung dịch bạc nitrat, tính mililit (ml); CA nồng độ dung dịch bạc nitrat; V thể tích dung dịch amoni thiocyanat, tính mililit (ml); CB nồng độ dung dịch amoni thiocyanat; w khối lƣợng mẫu thử, tính miligam (mg) 5.6 Xác định hàm lƣợng chì, theo TCVN 8900-6:2012 TCVN 8900-8:2012 5.7 Xác định Salmonella, theo JECFA 2006, Volume 5.8 Xác định coliform tổng số, theo JECFA 2006, Volume 5.9 Xác định Escherichia coli, theo JECFA 2006, Volume Trang 151/130 BM20-QT.QLKH