Nghiên cứu tạo chế phẩm nisin từ các chủng vi khuẩn lactic làm phụ gia bảo quản thực phẩm

SỞ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM CƠNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO NGHIỆM THU NHIỆM VỤ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ Tên nhiệm vụ: NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM NISIN TỪ CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTIC LÀM PHỤ GIA BẢO QUẢN THỰC PHẨM Đơn vị chủ trì nhiệm vụ: Tổ CNSH Thực Phẩm Chủ nhiệm nhiệm vụ: ThS Nguyễn Thị Dung Cán tham gia: ThS Nguyễn Đặng Hải Đăng KS Lê Thị Huyền Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2017 MỤC LỤC TÓM TẮT PHẦN THÔNG TIN CHUNG PHẦN NỘI DUNG KHOA HỌC I VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Các chủng vi sinh vật Phương pháp nghiên cứu 2.1 Phân lập, tuyển chọn chủng có hoạt tính sinh tổng hợp bacteriocin .5 2.1.1 Đối tượng lấy mẫu phương pháp lấy mẫu .5 2.1.2 Phương pháp phân lập 2.1.3 Phương pháp xác định mật độ tế bào vi khuẩn 2.1.4 Phương pháp xác định đặc điểm hình thái sinh hóa 2.1.5 Phương pháp khảo sát khả kháng khuẩn 2.1.6 Phương pháp tách DNA tổng số 2.1.7 Phương pháp PCR định danh xác định tên chủng 2.2 Phương pháp xác định khả sinh tổng hợp bacteriocin, xác định hoạt tính Nisin 2.3 Khảo sát điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp bacteriocin chủng lactic 2.3.1 Khảo sát ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp bacteriocin 2.3.2 Ảnh hưởng thời gian nhiệt độ nuôi cấy đến sinh tổng hợp bacteriocin 2.3.3 Ảnh hưởng pH môi trường đến sinh tổng hợp bacteriocin 10 2.4 Phương pháp thu nhận sản phẩm bacteriocin ………………………… 10 2.5 Phương pháp điện di Tricine SDS page ………………………………….10 2.6 Phương pháp khảo sát tính chất bacteriocin thu nhận 11 2.6.1 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến độ bền hoạt tính bacteriocin 11 2.6.2 Khảo sát ảnh hưởng pH đến độ bền hoạt tính bacteriocin .12 2.6.2.1 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố pH nhiệt độ đến độ bền hoạt tính bacteriocin 12 2.6.3 Phương pháp đánh giá hiệu chế phẩm mẫu thực phẩm 12 2.7 Phương pháp xử lý số liệu 13 II KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 13 Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lactic 13 Đánh giá khả đối kháng với số vi khuẩn thị chủng lactic phân lập 16 Kết định danh, giải trình tự 17 Kết dựng đường chuẩn để tính hoạt tính Nisin .18 Khảo sát điều kiện ảnh hưởng đến sinh tổng hợp Nisin .18 5.1 Khảo sát điều kiện môi trường đến sinh tổng hợp Bacteriocin .18 5.2 Ảnh hưởng thời gian nhiệt độ nuôi cấy đến sinh tổng hợp bacteriocin 20 5.3 Ảnh hưởng pH đến sinh tổng hợp bacteriocin 21 5.4 Kết điện di Tricine-SDS PAGE 23 5.5 Kết thu hồi bacteriocin 23 5.6 Quy trình thu nhận bacteriocin 25 5.7 Khảo sát tính chất bacteriocin thu 27 5.7.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến độ bền bacteriocin 27 5.7.2 Ảnh hưởng pH đến độ bền bacteriocin 29 5.7.3 Ảnh hưởng pH nhiệt độ đến độ bền bacteriocin 29 5.8 Kết thử nghiệm hiệu bacteriocin thu nhận thực phẩm ………………………………………………………………………….30 5.8.1 Kết thử nghiệm hiệu bacteriocin thu nhận thịt 30 5.8.2 tươi Kết thử nghiệm hiệu Bacteriocin thu nhận sữa 31 III ĐÁNH GIÁ CHUNG 33 IV ĐỀ NGHỊ .34 PHẦN SẢN PHẨM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 34 PHẦN TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 I TIẾNG VIỆT 35 II TIẾNG ANH 35 ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT WHO: Tổ chức y tế giới VSV: vi sinh vật TN: Thí nghiệm ĐC: Đối chứng Bp: Base pairs Kb: Kilobase kDa: Kilodalton CFU: Colony form unit SDS Sodium dodecyl sulphate TEMED: N, N, N’,N’- tetramethyl ethylendiamine NĐTP: Ngộ độc thực phẩm APS: Ammonium persulphate PCR: Polymerase Chain Reaction TSA: Môi trường Tryptic Soy Agar MRS: DE MAN, ROGOSA, SHARPE TSB: Môi trường Tryptic Soy Broth CM: Complex medium iii DANH SÁCH HÌNH Hình Kết điện di gel Agarose 1% sản phẩm PCR vùng 16S rRNA 17 Hình Đường chuẩn hoạt tính Nisin 18 Hình Mối tương quan mơi trường đến hoạt tính tổng hợp bacteriocin OD 19 Hình Đường kính vịng kháng khuẩn chủng khảo sát môi trường khác 20 Hình Ảnh hưởng thời gian nhiệt độ ni cấy đến hoạt tính bacteriocin 20 Hình Ảnh hưởng pH đến hoạt tính bacteriocin 22 Hình Đường kính vịng kháng khuẩn chủng Lactococcus lactic đĩa thạch giá trị pH 6,8; 7,5 8,5 22 Hình Sản phẩm điện di Tricine-SDS page bacteriocin từ chủng nghiên cứu 23 Hình Vịng kháng khuẩn bacteriocin từ chủng khảo sát tỉ lệ tủa ethanol 24 Hình 10 Quy trình thu hồi bacteriocin 25 Hình 11 Hình ảnh bảo bì sản phẩm bacteriocin 27 Hình 12 Vịng kháng khuẩn sản phẩm bacteriocin thơ 27 Hình 13 Hoạt tính bacteriocin cịn lại nhiệt độ xử lý ………………………………28 Hình 14 Đồ thị tương quan mật độ VSV hiếu khí thời gian thử nghiệm thịt 31 Hình 15 Mật độ tổng vi khuẩn hiếu khí đĩa pettri NT thử nghiệm thịt 31 Hình 16 Đồ thị tương quan mật độ VSV hiếu khí thời gian thử nghiệm sữa 32 Hình 17 Mật độ tổng vi khuẩn hiếu khí đĩa pettri NT thử nghiệm sữa 32 iv DANH SÁCH BẢNG Bảng Một số phản ứng sinh hóa chủng vi khuẩn lactic Bảng Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng môi trường Bảng Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng nhiệt độ thời gian nuôi cấy Bảng Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng pH 10 Bảng Đặc điểm hình thái chủng lactic phân lập 13 Bảng Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 10 chủng nghi ngờ vi khuẩn Lactococcus lactic 15 Bảng Khả kháng lại số chủng thị dịch nuôi cấy chủng lactic phân lập 16 Bảng Ảnh hưởng môi trường đến khả kháng khuẩn chủng khảo sát 19 Bảng Ảnh hưởng pH mơi trường ni cấy đến đường kính vịng kháng khuẩn 21 Bảng 10 Hoạt tính Nisin thu nhận tỉ lệ tủa ethanol 24 Bảng 11 Độ bền nhiệt bacterioicin từ chủng HT235 27 Bảng 12 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính bacteriocin thu từ chủng HT235 29 Bảng 13 Ảnh hưởng pH nhiệt độ đến hoạt tính bacteriocin 30 v TĨM TẮT Bacteriocin có nhiều ứng dụng bảo quản thực phẩm, điển hình Nisin Bước đầu, đề tài tiến hành phân lập, tuyển chọn chủng lactic từ nguồn mẫu thực phẩm lên men Đã định danh hai chủng vi khuẩn Lactococcus lactic hai chủng Enterococcus spp có khả sinh tổng hợp bacteriocin Đề tài khảo sát lựa chọn chủng HT235 với điều kiện nuôi cấy môi trường CM, thời gian nuôi cấy 24 giờ, nhiệt độ 30oC pH 6,8 điều kiện thích hợp cho q trình sinh tổng hợp Nisin Kết khảo sát điều kiện thu nhận Nisin, lựa chọn tỉ lệ tủa 70% ethanol: 30% dịch (dịch nuôi cấy sau ly tâm) chủng HT235 có hoạt tính Nisin cao nhất, đạt 1574,74 IU/ml Bacteriocin thu bền với nhiệt độ, gần không bị phá hủy nhiệt độ 70oC, bị giảm gần 40% hoạt tính xử lý nhiệt độ 121oC thời gian 15 phút có dải pH hoạt động rộng từ pH 37 Kết phân tích điện di Tricine –SDS page cho thấy, kích thước Nisin thu khoảng 3,4 kDa tương đồng với kích thước Nisin chuẩn Kết thử nghiệm hiệu Nisin sữa thịt nhận thấy, bổ sung Nisin thu nhận từ chủng HT235 với nồng độ 800IU/ml vào mẫu sữa thịt, Nisin có khả ức chế, kìm hãm phát triển VSV gây hư hỏng thực phẩm Điều cho thấy Nisin thu nhận từ chủng HT235 có khả ứng dụng làm phụ gia bảo quản thực phẩm PHẦN THÔNG TIN CHUNG Tên nhiệm vụ: “Nghiên cứu tạo chế phẩm Nisin từ chủng vi khuẩn lactic làm phụ gia bảo quản thực phẩm”, (Mã số: TP01/15-16) Đơn vị chủ trì: Tổ CNSH Thực phẩm – Trung Tâm Công nghệ Sinh học TP HCM Chủ nhiệm nhiệm vụ: ThS Nguyễn Thị Dung Cán tham gia thực hiện: ThS Nguyễn Đặng Hải Đăng, KS Lê Thị Huyền Thời gian thực hiện: 24 tháng (từ tháng 1/2015 đến 12/2016) Kinh phí: - Tổng dự tốn: 350.000.000 đồng - Kinh phí sử dụng: 327.500.000 đồng Mục tiêu nhiệm vụ: Mục tiêu tổng quát: Nghiên cứu thu nhận Nisin ứng dụng làm phụ gia bảo quản thực phẩm Nghiên cứu lựa chọn điều kiện thích hợp cho q trình sinh tổng hợp Nisin Mục tiêu cụ thể:  Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả sinh tổng hợp Nisin có hoạt tính cao  Khảo sát điều kiện ni cấy ảnh hưởng đến q trình sinh trưởng sinh tổng hợp Nisin chủng vi khuẩn lactic  Xây dựng quy trình thu nhận hợp chất Nisin thô  Đánh giá hiệu chế phẩm mẫu thực phẩm Các nội dung công việc thực so với đăng ký Thời gian STT Nội dung đăng ký Thực Đánh giá Đã phân lập định danh chủng vi khuẩn lactic có khả kháng khuẩn, có chủng Lactococcus lactis subsp lactis HT235 DT248, chủng Enterococcus spp SB07 LN23 Các chủng có khả đối kháng với chủng gây hư hỏng thực phẩm S aureus B.cereus Đúng tiến độ (bắt đầu – kết thúc) Nội dung 1: Phân lập, 2/2015tuyển chọn chủng 6/2015 lactic khả kháng khuẩn 2 Nội dung 2: Khảo sát 7/2015môi trường điều 12/2015 kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến trình sinh trưởng sinh tổng hợp Nisin chủng lactic phân lập Đã khảo sát lựa chọn chủng HT235 với điều kiện nuôi cấy môi trường CM, thời gian nuôi cấy 24 giờ, nhiệt độ 30oC, giá trị pH ban đầu 6,8 điều kiện thích hợp cho sinh tổng hợp Nisin Hoạt tính Nisin theo khảo sát đạt 1338,8 IU/ml Đúng tiến độ Nội dung 3: Thu nhận 1/2016Nisin 4/2016 Đã khảo sát, lựa chọn phương pháp tủa ethanol với tỉ lệ tủa 7:3 (70% ethanol: 30% dịch nổi) chủng HT235 cho hoạt tính thu nhận Nisin cao nhất, đạt 1574.74 IU/ml Đúng tiến độ Nội dung 4: Định tính 4/2006Nisin 7/2016 Đã định tính Nisin thu nhận phương pháp phân tích điện di Tricine –SDS page Đúng tiến độ Nội dung 5: Khảo sát 7/2016tính chất bacteriocin 10/2016 thu nhận Đã khảo sát độ bền bacteriocin từ chủng HT235 Kết cho thấy, bacteriocin bền với nhiệt độ, gần không bị phá hủy 70oC, bị giảm gần 40% hoạt tính xử lý nhiệt độ 121oC thời gian 15 phút có dải hoạt động rộng từ pH 3-7, hoạt tính nisin thu cịn lại cao Đúng tiến độ Nội dung 6: Bước đầu đánh giá hiệu chế phẩm mẫu thực phẩm Đã bước đầu thử nghiệm hiệu Nisin thu mẫu sữa thịt Kết cho thấy Nisin thu nhận từ chủng HT235 có ức chế, kìm hãm phát triển VSV gây hư hỏng thực phẩm Đúng tiến độ 10/201612/2016 PHẦN NỘI DUNG KHOA HỌC Trong năm năm (2015-2016) nhóm đề tài thực nội dung sau: STT Nội dung Công việc thực Nội dung 1: Phân lập, tuyển chọn chủng lactic có khả kháng khuẩn - Thu mẫu từ nhà máy, chợ, siêu thị Xử lý mẫu Pha lỗng, phân lập, thí nghiệm sinh hóa tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả kháng khuẩn Thuần giống, bảo quản Thử hoạt tính kháng khuẩn với chủng thị: S aureus, B.cereus, L.plantarum Xác định hoạt tính bacteriocin Nội dung 2: Khảo sát môi trường điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến trình sinh trưởng sinh tổng hợp bacteriocin chủng lactic phân lập Khảo sát môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến trình sinh trưởng sinh tổng hợp bacteriocin chủng lactic phân lập Khảo sát điều kiện ni cấy ảnh hưởng đến q trình sinh trưởng sinh tổng hợp bacteriocin chủng lactic phân lập được:  Nhiệt độ thời gian nuôi cấy  pH môi trường Nội dung 3: Thu nhận bacteriocin - Khảo sát tỉ lệ tủa dung môi ethanol để thu nhận sản phẩm bacteriocin Xây dựng quy trình thu nhận bacteriocin thơ Thử nghiệm tạo sản phẩm bacteriocin quy mơ phịng TN Nội dung 4: Định tính bacteriocin Điện di Tricine SDS page Nội dung 5: Khảo sát tính chất bacteriocin thu nhận - Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến độ bền hoạt tính bacteriocin Khảo sát ảnh hưởng pH đến độ bền hoạt tính bacteriocin Khảo sát ảnh hưởng kết hợp yếu tố pH nhiệt độ đến độ bền hoạt tính bacteriocin - Bảng 10 Hoạt tính bacteriocin thu nhận tỉ lệ tủa ethanol Chủng Đường kính vịng kháng khuẩn (mm) L lactic Hoạt tính (IU/ml) Bacteriocin 5:5 (P1) 6:4 (P2) 7:3 (P3) 5:5 (P1) 6:04 (P2) 7:03 (P3) ATTCC 11454 (S1) 10,50±0,2d 12,17±0,1c 16,58±0,1a 204,91 325,52 1108,47 HT235 (S2) 11,50±0,2cd 13,67±0,6b 17,83±0,1a 270,5 494,11 1572,74 CV%=3,81 LSD=0,95 Mức ý nghĩa thống kê: F(S)= 25,76**; F(P)=222,18**; F(S*P)= 0,34ns; F(SP)= 94.16** (mức ý nghĩa: * tức α= 0,05; ** tức α= 0,01; ns tức α> 0,05) (các chữ a, b, c, d, e biểu thị sai khác có ý nghĩa thống kê, Ducan’s test ( P< 0,01)) Hình Vòng kháng khuẩn bacteriocin từ chủng khảo sát tỉ lệ tủa ethanol 24 5.6 Quy trình thu nhận bacteriocin Giống vi khuẩn L.lactic HT235 Nhân giống 30oC, 24h, pH ban đầu 6,8 Lên men Ly tâm tách sinh khối, thu dịch Bổ sung dung môi Ủ -20oC, qua đêm Tỉ lệ dich nuôi cấy: Ethanol = : Ly tâm thu kết tủa 13000v/p Bổ sung đệm photphat, pH=6.4 Thu dịch Nisin thô Bổ sung chất độn (Bột skimmilk, NaCl) Sấy to=550C - 60oC (độ ẩm đạt < 10%) Kiểm tra hoạt tính Nisin Đóng gói bao bì kín chai lọ Bảo quản nơi thống mát, to