Nghiên cứu tạo chế phẩm interferon α tái tổ hợp ứng dụng trong phòng và trị bệnh do virus trên heo nuôi

SỞ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM CƠNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO NGHIỆM THU ĐỀ TÀI CƠ SỞ CẤP TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM INTERFERON-α TÁI TỔ HỢP ỨNG DỤNG TRONG PHÒNG VÀ TRỊ BỆNH DO VIRUS TRÊN HEO NI Mã số: YD03/15-17 Đơn vị chủ trì nhiệm vụ: Phòng CNSH Ydược Chủ nhiệm nhiệm vụ: TS Phạm Thị Kim Trâm Cán tham gia: TS Phạm Thị Kim Trâm ThS Đỗ Thị Việt Phương TS Nguyễn Đăng Quân CN Phạm Bùi Hồng Anh Thành phố Hồ Chí Minh, tháng năm 2018 MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG BIỂU TÓM TẮT PHẦN THÔNG TIN CHUNG PHẦN NỘI DUNG KHOA HỌC ĐẶT VẤN ĐỀ I I.1 Tính cấp thiết đề tài I.1 Ý nghĩa tính khoa học thực tiễn 10 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 10 II II.1 Interferon alpha 10 I.2 Hệ thống biểu P pastoris 15 I.3 Quá trình lên men P pastoris 21 I.4 Tình hình nghiên cứu biểu PoIFN nước 27 VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 II II.1 Vật liệu 29 II.2 Thiết bị 30 II.3 Phương pháp 32 III KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 41 III.1 Tạo dòng chủng nấm men P pastoris GS115:PoIFNα biểu PoIFNα 41 III.2 Biểu PoIFNα P pastoris nuôi cấy lắc 45 III.3 Khảo sát điều kiện biểu PoIFNα quy mô nuôi cấy lắc 47 III.4 Thiết lập quy trình biểu PoIFNα hệ thống bồn lên men 51 III.5 Tinh PoIFNα cột sắc ký lực Ni2+ 57 III.6 Hoạt tính kháng virus in vitro PoIFNα độ an toàn chung, độ vô trùng, độ ẩm nội độc tố chế phẩm PoIFNα 60 IV KẾT LUẬN 62 IV.1 V Nhận xét đánh giá kết đạt so với yêu cầu 62 KIẾN NGHỊ 63 PHẦN TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 I II TIẾNG VIỆT 63 TIẾNG ANH 64 PHỤ LỤC 70 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT AOX BMGY BSM BSMYP DHAS DO IFN MPYG PoIFNα SF FMDV PRRSV MDBK VSV CPE ChIFN MHC PRRs TLR RIG-I GBP TP MIP HPLC Alcohol oxidase Buffered Glycerol-complex Medium Basal salt medium Basal salt medium Yeast extract Peroxisomal enzyme dihydroxyacetone synthase Dissolved oxygen Interferon Mineral Peptone Yeast extract Glycerol Porcine Interferon α shake-flask Foot-and-mouth disease virus Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Madin-Darby bovine kidney Vesicular Stomatitis Virus cytopathic effect Chicken interferon Major Histocompatibility Complex pattern recognition receptors Toll-like receptor retinoic acid-inducible gen I glycerol batch phase transition phase methanol inductionphase high performence liquid chromatography DANH MỤC HÌNH Hình Các đường cảm ứng sản xuất IFN đường truyền tín hiệu IFN loại 13 Hình 2.Con đường biến dưỡng methanol P pastoris20 Hình Kết cắt giới hạn plasmid mang gen mã hóa PoIFNα NotI EcoRI 41 Hình Sơ đồ vector biểu pPIC9K 42 Hình Kết kiểm tra diện vector biểu pPIC9k mang gen mã hóa PoIFNα E coli enzyme cắt giới hạn BamHI/SalI 42 Hình Sàng lọc chủng biểu PoIFNα đĩa MM 44 Hình Kết PCR kiểm tra plasmid pPIC9K-PoIFNα sát nhập vào genome nấm men 44 Hình Kết SDS – PAGE Western blot dịch biểu chủng GS115 mang gen mã hóa PoIFNα (GS115:poIFNa) 46 Hình Kết phân tích nồng độ poIFN dịch biểu thời điểm 0, 24, 48, 72 96 ImageJ 46 Hình 10 Biểu đồ tăng trưởng nấm men theo thời gian điều kiện nhiệt độ methanol cảm ứng khác (n=3) 48 Hình 11 Kết phân tích SDS-PAGE dịch biểu PoIFNα điều kiện cảm ứng 20oC 25oC, nồng độ methanol cảm ứng 0,5; 1; 1,5; 2% mốc thời điểm 48, 72, 96 49 Hình 12 Kết nồng độ PoIFNα điều kiện cảm ứng biểu 20oC 25oC, nồng độ methanol cảm ứng 0,5; 1; 1,5; 2%, thời điểm 48, 72, 96 49 Hình 13 Kết biểu theo quy trình cải tiến quy trình dành cho chủng Mut+ 51 Hình 14 Khối lượng sinh khối ướt thu nuôi cấy môi trường BSM 52 Hình 15 Kết phân tích SDS – PAGE dịch lên men sau cảm ứng thời điểm 24, 48 72 sử dụng môi trường BSM bồn lên men 52 Hình 16 Giản đồ theo dõi sinh khối ướt nấm men môi trường FM22, MPGY, BSMYP; Thời điểm cảm ứng 21, 22, 18 nuôi cấy 53 Hình 17 Kết phân tích SDS-PAGE dịch lên men môi trường nuôi cấy FM22, MPGY, BSMYP sau cảm ứng methanol bồn lên men 54 Hình 18 Kết SDS-PAGE Western blot với kháng thể đặc hiệu cho mẫu dịch lên men sau cảm ứng 54 Hình 19 Giản đồ theo dõi sinh khối ướt nấm men môi trường BSMYP với tốc độ cánh khuấy 500rpm 600rpm 56 Hình 20 Giản đồ theo dõi số oxy hòa tan (DO) 56 Hình 21 Kết phân tích SDS-PAGE dịch lên men điều kiện thiết lập tốc độ cánh khuấy 500rpm 600rpm 57 Hình 22 Kết tinh PoIFNα từ dịch lên men cột sắc ký Histrap Excel 5ml 58 Hình 23 Kết xử lý cắt bỏ nhóm glycosyl PoIFNα 59 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng Chủng P pastoris 17 Bảng Thông số kỹ thuật cột Histrap excel 5ml GE 29 Bảng Thông số quy trình lên men PoIFNα hệ thống bồn lên men 57 Bảng Số liệu phân tích hiệu suất tinh PoIFNα 58 Bảng Xác định hoạt tính kháng virus in vitro PoIFNα VSV dòng tế bào MDBK 61 Bảng Giá trị K cơng thức tính giới hạn nội độc tố 61 Bảng Kết đánh giá độ ẩm tồn dư, độ vơ trùng, độ an tồn, nội độc tố chế phẩm PoIFNα 62 Bảng Thành phần môi trường LB 70 Bảng Thành phần môi trường YPD (Yeast extract Peptone Dextrose) 70 Bảng 10.Thành phần môi trường BMGY (Buffered Glycerol-complex) 70 Bảng 11.Thành phần môi trường BMMY (Buffered Methanol-complex) 70 Bảng 12: Thành phần môi trường BSM 70 Bảng 13: Thành phần môi trường FM22 70 Bảng 14: Thành phần môi trường BSMYP 71 Bảng 15: Thành phần môi trường MPGY medium 71 Bảng 16: Thành phần mơi trường khống PTM1 71 Bảng 17 Dung dịch dùng cho điện di protein 72 Bảng 18 Dung dịch nhuộm bạc 72 Bảng 19 Dung dịch dùng cho lai Western Blot 10X 73 Bảng 20 Dung dịch T.TBS 1X 73 Bảng 21 Dung dịch khóa màng 73 Bảng 22 Buffer đông khô 73 Bảng 23 Các stock 73 TÓM TẮT Trong nhiều năm qua, ngành chăn nuôi gia súc, gia cầm Việt Nam thường xuyên bị thiệt hại nghiêm trọng bệnh gây virus cúm, Gumboro, Newcastle…trên gia cầm đặc biệt gà số bệnh virus thường gặp heo như: bệnh dịch tả, bệnh lở mồm long móng (LMLM) Do vậy, việc phát triển chế phẩm sinh học giúp phòng trị bệnh virus gia cầm gia súc cần thiết Đến năm 2016, Trung tâm CNSH nghiên cứu thành cơng chế phẩm interferon gà (Chicken interferon - ChIFN) trì hoạt tính sinh học sau tháng bảo quản 4oC chế phẩm an toàn, không gây tác động xấu cho gà nuôi, với hiệu bảo hộ gà kháng lại virus gây bệnh đạt tỷ lệ 70 – 80% Tiếp nối thành cơng đó, nhóm nghiên cứu tiếp tục thực nghiên cứu tạo interferon heo (Porcine Interferon α - PoIFNα) tế bào nấm men Pichia pastoris kỹ thuật DNA tái tổ hợp Kết hàm lượng PoIFNα thu hệ thống bồn lên men đạt 140 mg/L PoIFNα tinh sắc kí lực Ni2+ đạt hiệu suất 5,83% với độ tinh 88% Hoạt tính kháng virus in vitro tế bào Madin-Darby bovine kidney (MDBK) gây nhiễm với Vesicular Stomatitis Virus (VSV) dịch lên men biểu PoIFNα mẫu tinh đạt 4,9 x 107 IU/mg x 107 IU/mg, tương ứng PHẦN THÔNG TIN CHUNG Tên nhiệm vụ: Nghiên cứu tạo chế phẩm interferon-α tái tổ hợp ứng dụng phòng trị bệnh virus heo nuôi (Mã số: YD03/15-17) Đơn vị chủ trì: Phịng CNSH Y Dược Đơn vị phối hợp chính: Viện Vắc-xin Sinh phẩm Y tế Nha Trang (IVAC) Chủ nhiệm nhiệm vụ: TS Phạm Thị Kim Trâm Cán tham gia thực hiện: ThS Đỗ Thị Việt Phương Thành viên TS Nguyễn Đăng Quân Thành viên CN Phạm Bùi Hoàng Anh Thành viên Thời gian thực hiện: 35 tháng (Từ tháng 2/2015 đến 12/2017) Kinh phí: - Tổng dự tốn: 700.000.000 VNĐ - Kinh phí sử dụng: 700.000.000 VNĐ Mục tiêu nhiệm vụ: Tạo chế phẩm PoIFNα có hoạt tính kháng virus tiến tới ứng dụng phòng điều trị bệnh virus heo nuôi Các nội dung công việc thực so với đăng ký STT Nội dung đăng ký Thực Nội dung 1: Tạo Đã tạo dòng nấm dòng nấm men men biểu Pichia pastoris có PoIFNα khả biểu PoIFNα Nội dung 2: Biểu Đã biểu tinh quy mô nuôi cấy lắc PoIFNα hệ thống lên men tinh PoIFNα thành cơng cột sắc kí lực Ni2+ Nội dung 3: Tối ưu Đã tối ưu điều kiện hóa quy trình lên biểu PoIFNα men P pastoris biểu quy mô nuôi cấy lắc PoIFNα Nội dung 4: Kiểm tra Đã đánh giá hoạt hoạt tính sinh học tính kháng virus in PoIFNα in vitro vitro PoIFNα Đánh giá Đạt Đạt Đạt Đạt I I.1 Nội dung 5: Kiểm tra độ an tồn chung, độ vơ trùng, độ ẩm nội độc tố (endotoxin) chế phẩm Đã đánh giá nội độc tố, độ an tồn chung, độ vơ trùng cho chế phẩm đông khô Đạt PHẦN NỘI DUNG KHOA HỌC ĐẶT VẤN ĐỀ Tính cấp thiết đề tài Ngành chăn ni nói chung chăn ni sản xuất heo thương phẩm nói riêng đóng vai trị quan trọng kinh tế Việt Nam Tuy nhiên, bệnh truyền nhiễm vius heo thử thách to lớn Những bệnh virus thường gặp heo như: bệnh dịch tả, bệnh lở mồm long móng (LMLM), bệnh tai xanh bệnh truyền nhiễm cấp tính, lây lan nhanh, gây hậu nghiêm trọng kinh tế, xã hội mơi trường Năm 2010, có hai đợt dịch heo tai xanh lớn Đợt xảy vào tháng 3/2010 Hải Dương Tính đến hết tháng 6/2010, toàn quốc ghi nhận tổng số heo mắc bệnh 146.051 số tiêu hủy 65.911 Trong đợt dịch thứ từ tháng đến tháng 10/2010, toàn quốc ghi nhận ổ dịch tai xanh 38.115 hộ chăn nuôi 1443 xã, phường, thị trấn thuộc 195 quận, huyện 32 tỉnh, thành phố Tổng số heo đàn mắc bệnh 926.333 con, số mắc bệnh 621.086 con, số chết tiêu hủy 336.975 (theo báo cáo phòng Dịch tễ - Cục thú y Trung ương, Bộ NN&PTNN năm 2010) Và nước xảy 13 ổ dịch LMLM vào năm 2017 (theo báo cáo chuyên đề Bộ NN&PTNN năm 2017) Cho đến nay, phương pháp phòng bệnh virus sử dụng vaccine Tuy nhiên, việc sử dụng vaccine nhiều hạn chế như: tỷ lệ tiêm phịng vaccine đàn cịn thấp; bên cạnh đó, virus có đặc tính biến đổi nhanh làm giảm hiệu vaccine, đồng thời phổ hoạt động vaccine cịn hẹp chưa có vaccine cho số loại virus Đồng thời, chưa có thuốc điều trị bệnh virus heo nuôi Việt Nam nên xuất dịch bệnh, phương pháp xử lý cách ly tiêu hủy đàn Ngày nay, interferon alpha (IFNα) sử dụng để điều trị viêm gan C cấp mãn tính; viêm gan B mãn tính; HIV… người Interferon (IFN) cytokine có hoạt tính kháng virus, hỗ trợ hệ miễn dịch làm tăng cường sức đề kháng thể vật chủ nhiều loại virus có hiệu nhiều chủng virus Vì vậy, IFN tác nhân hỗ trợ cho vaccine kiểm soát dịch bệnh chăn ni Ngồi ra, IFN có đặc tính chun biệt lồi quy mơ ngành chăn ni heo nước tình hình dịch bệnh lưu hành, thấy nhu cầu cho interferon heo (PoIFN) cần thiết Trên thị trường Việt Nam có sản phẩm IFN dùng thú y sản xuất nước (thuốc Navet-Interferon Công ty cổ phần thuốc thú y Trung ương Navetco) Trước nhu cầu thực tế IFN sử dụng cho heo, để đa dạng hóa sản phẩm cho thị trường theo gợi ý hợp tác doanh nghiệp Vemedim, Phòng CNSH Y Dược đề xuất thực đề tài “Nghiên cứu tạo chế phẩm interferon-α tái tổ hợp ứng dụng phòng trị bệnh virus heo ni” I.1 Ý nghĩa tính khoa học thực tiễn - Tính mới: Hướng nghiên cứu chế phẩm IFN dùng cho động vật chưa trọng nhiều, số đề tài nghiên cứu chế phẩm IFN dùng cho động vật thực Việt Nam Tiếp nối thành công phát triển chế phẩm ChIFN giai đoạn 2012 - 2014, Trung tâm CNSH Tp.HCM đề xuất nghiên cứu tạo chế phẩm PoIFN biểu hệ thống nấm men Pichia pastoris Theo chúng tơi tìm hiểu, tới chưa có báo cáo PoIFN biểu từ P pastoris công bố Việt Nam - Ý nghĩa thực tiễn: Sản phẩm nghiên cứu đề tài PoIFNα ứng dụng phòng ngừa điều trị bệnh virus gây heo, đáp ứng nhu cầu ngành chăn ni, mang lại hiệu kinh tế cho xã hội Ngồi ra, đề tài thiết lập quy trình lên men nấm men P partoris sản xuất PoIFNα quy mơ phịng thí nghiệm Quy trình tiền đề từ mở rộng thành quy mơ pilot quy mơ sản xuất chế phẩm PoIFNα có giá thành hợp lý, phục vụ cho ngành chăn nuôi heo - Ý nghĩa khoa học: Đây nghiên cứu biểu protein PoIFNα tái tổ hợp hệ thống P pastoris Việt Nam Đề tài nghiên cứu đóng góp sở khoa học làm rõ tiềm ứng dụng nấm men P pastoris việc biểu PoIFNα có hoạt tính sinh học tốt để sử dụng chăn nuôi II TỔNG QUAN TÀI LIỆU II.1 Interferon alpha II.1.1 Giới thiệu interferon alpha Interferon (IFN) glycoprotein sản xuất hầu hết tế bào động vật có xương sống để đáp ứng lại xâm nhiễm tác nhân sinh vật gây bệnh (vi rút, vi khuẩn, nấm ký sinh trùng), tế bào khối u IFN sản xuất tế bào hệ thống miễn dịch bẩm sinh thích ứng tế bào không thuộc hệ miễn dịch nguyên bào sợi tế bào biểu mô (Müller and Kräusslich, 2009) Ở động vật có vú, IFN chia thành thành ba loại (loại I, II III) dựa phân bố nhiễm sắc thể, cấu trúc gen độ tương đồng trình tự gen thụ thể liên quan tế bào đích để phân biệt tín hiệu IFN (Sang, Bergkamp, & Blecha, 2014) 10 PHỤ LỤC THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG VÀ DUNG DỊCH Bảng Thành phần môi trường LB LB (LAB169) 10g Nước cất đủ 150ml (đối với môi trường thạch, bổ sung 1,5% agar) Bảng Thành phần môi trường YPD (Yeast extract Peptone Dextrose) Cao nấm men 1% Peptone 2% D-Glucose 2% (đối với môi trường thạch, bổ sung 1,5% agar) Bảng 10.Thành phần môi trường BMGY (Buffered Glycerol-complex) Cao nấm men Peptone YNB Potassium Phosphate buffer 10X Biotin 500X Glycerol 10X 1% 2% 1,34% 10% 0,2% 10% Bảng 11.Thành phần môi trường BMMY (Buffered Methanol-complex) Cao nấm men 1% Peptone 2% YNB 1,34% Potassium Phosphate buffer 10X 10% Biotin 500X 0,2% Methanol 10X 10% Bảng 12: Thành phần môi trường BSM Thành phần môi trường BSM CaSO4 K2SO4 MgSO4.7H2O KOH H3PO4 85% Glycerol PTM1 g/L 0.93 18.2 14.9 4.13 26.7 40.0 4.35 mL/L Bảng 13: Thành phần môi trường FM22 Thành phần môi trường FM22 g/L KH2PO4 42.9 70 (NH4)2SO4 CaSO4·2H2O K2SO4 MgSO4·7H2O Glycerol PTM1 14.3 11.7 40 mL/L Bảng 14: Thành BSMYP Thành phần môi trường BSMYP Yeast extract Peptone KH2PO4 CaCl2.2H2O (NH4)2SO4 MgSO4.7H2O Glycerol PTM1 g/L 20 10 0.22 20 mL/L Bảng 15: Thành phần môi trường MPGY medium Thành phần môi trường MPGY medium Yeast extract Peptone KH2PO4 CaCl2.2H2O (NH4)2SO4 MgSO4.7H2O EDTA Glycerol PTM1 Bảng 16: Thành phần môi trường khoáng PTM1 Thành phần khoáng PTM1 CuSO4.5H2O NaI MnSO4 Na2MoO4.2H2O H3BO3 CoCl2 ZnCl2 FeSO4.7H2O Biotin H2SO4 98% phần môi trường g/L 40 10 0.22 10 0.4 20 mL/L g/L 0.08 0.2 0.02 0.5 20 65 0.2 5.0 mL/L 71 Bảng 17 Dung dịch dùng cho điện di protein Gel phân tách 15% dH2O 40% Acrylamide 1,5M Tris HCl (pH 8.8) 1% SDS 40%APS TEMED Gel gom dH2O 40%Acrylamide 1,5M Tris HCl (pH 6.8) 1%SDS 40%APS TEMED Đệm điện di SDS – PAGE 10X Tris-HCl (kiềm) Glycine công nghiệp SDS Nước cất đủ - Đệm nạp mẫu 5X (biến tính) β-Mercaptoethanol Bromophenol blue Glycerol SDS Tris-Cl Bảng 18 Dung dịch nhuộm bạc Fixer Ethanol Acid acetic dH2O Sensitizer Na2S2O3 Dung dịch bạc nitrate AgNO3 Formaldehyde 2,19ml 3,175ml 2,065ml 0,825ml 12,5µl 12,5µl 1,94ml 0,385ml 0,375ml 0,3ml 7,5ul 7,5ul 30g 144g 10g lít 5% 0.02% 30% 10% 250 mM, pH 6.8 40% 10% 50%l 0,02% 0,1% 0,02% 72 Developer Na2CO3 3% Formaldehyde 0,05% Stopper Acid acetic 5% Bảng 19 Dung dịch dùng cho lai Western Blot 10X Tris-HCl (kiềm) 30g Glycine công nghiệp 144g Nước cất đủ lít Methanol (thêm vào trước sử dụng) 10% Bảng 20 Dung dịch T.TBS 1X Tris – base 6.05 g NaCl 8.76 g Tween 20 0,1% Nước cất đủ lít Bảng 21 Dung dịch khóa màng Sữa gầy 1g Dung dịch T.TBS 20ml Bảng 22 Buffer đông khô Succinic acid 0,27mg/ml Di-sodium succinate 0,73mg/ml D-manitol 40mg/ml Polysorbate 80 0,1mg/ml Bảng 23 Các stock Biotin 500X (0,02%) Methanol 10X: 5%; 10%; 15% Glycerol 10X: 10% 1M Potassium Phosphate buffer (10X) pH 1M K2HPO4 132ml 1M KH2PO4 868ml PHỤ LỤC KIỂM TRA ĐỘ VÔ TRÙNG Nguyên tắc -Cấy trực tiếp vào môi trường Thioglycolate TSB (Tryp Soyabean Broth) 73 Quy định chung - Thử nghiệm vô trùng phải thực điều kiện hốt Biosafety Cabinet class II đạt cấp độ A, phòng cấp độ B Phòng phải kiểm soát áp suất, nhiệt độ, độ ẩm, tốc độ trao đổi khí giám sát vi sinh Nhân viên thực thử nghiệm vô khuẩn phải người đào tạo, có hiểu biết kinh nghiệm thực hành, trang bị phương tiện bảo hộ vô trùng tuân thủ quy trình vào khu vực Thiết bị, nguyên vật liệu chính, mẫu 3.1 Thiết bị, ngun vật liệu - Phịng vơ trùng cấp độ B - Tủ cấy vô trùng - Tủ ấm 30-35oC - Tủ mát 20-25oC - Pipet Aid - Quần áo, mũ, trang, tất vải, găng tay, gạc vô trùng - Pipét Pasteur vô trùng - Môi trường Thioglycolate TSB - Cồn 70o 3.2 Mẫu - Số lượng mẫu: 20 ống - Nước muối sinh lý: 20 ống (nếu mẫu thử cần hoàn nguyên) Các bước thưc Mẫu thử cần khử trùng sơ bên ngồi ethanol 70 0C lọc vơ trùng, trước chuyển vào phòng Ngay trước thực thao tác cấy vô trùng, mẫu thử cần khử trùng lại Với vắc xin sinh phẩm đóng ống, phải dùng cưa, gạc vô trùng để cưa bẻ ống mẫu thử Với vắc xin, sinh phẩm vắc xin đông khô phải hồi chỉnh với dung dịch kèm trước cấy vào môi trường Riêng mẫu vắc xin vắc xin phòng lao (BCG), bột đông khô (dạng ampoule) trước khử trùng sơ bộ, cần kiểm tra độ chân không để loại bỏ ống không đạt tiêu chuẩn Với sinh phẩm vắc xin phối hợp gồm nhiều thành phần (ví dụ: DTP- HB- IPV DTP- HB- IPV – Hib) để kiểm tra tính vơ khuẩn sinh phẩm phải hỗn hợp thành phần vắc xin lại với trước cấy vào môi trường Sau cấy, cần kiểm chứng lại dung dịch nước muối sinh lý nước cất cách lấy ml, cấy ml vào ống thioglycolate ống TSB Các ống Thioglycolate kiểm chứng ủ nhiệt độ 30 0C – 35 0C, ống TSB ủ nhiệt độ 20 – 25 0C với môi trường cấy mẫu kiểm tra Cách cấy: Lắc kỹ mẫu thử trước cấy vào môi trường, dùng bóp cao su pippét air có cắm pipét Pasteur vơ trùng để hút mẫu thử Đẩy hết khí thừa đầu pipét Đưa pipét xuống tận đáy ống môi trường, vừa phối hợp động tác bơm mẫu thử vừa kéo pipét khỏi môi trường thử 74 Mỗi loạt môi trường pha chế dùng thử nghiệm vô khuẩn phải kiểm tra chất lượng môi trường tính vơ trùng, tính tăng sinh, khả trung hịa chất ức chế Lượng mẫu cấy vào môi trường: Lượng VX-SP có lọ Lượng VX- SP lấy để cấy Lượng VX- SP cấy vào ống MT Toàn Toàn Từ ml đến < ml ml ml Từ ml đến < ml ½ thể tích ml Ít ml Từ ≥ ml đến < 20 ml ml ml Lưu ý: Thể tích mơi trường phải phù hợp để đảm bảo có mặt mẫu thử không ảnh hưởng đến dinh dưỡng môi trường Cấy chuyển: Đối với sản phẩm không làm đục môi trường (globulin miễn dịch, dị nguyên gây bệnh không gây bệnh, kháng nguyên, dung dịch hồi chỉnh v.v.), ống môi trường theo dõi hàng ngày vòng 14 ngày Đối với sản phẩm làm đục mơi trường ni cấy (những sản phẩm có chất hấp phụ, sinh khối chứa tế bào não) sau cấy – ngày phải cấy chuyển ml sang ống môi trường tương ứng theo thứ tự ủ tiếp nhiệt độ quy định Hàng ngày theo dõi ghi chép Đọc kết cuối vào ngày thứ 14 Đánh giá kết Khi gặp trường hợp sau thí nghiệm khơng tính lần làm: - Lô môi trường sử dụng không đạt tiêu chuẩn vô trùng, độ nhạy - Chứng âm không đạt yêu cầu - Nhiệt độ nuôi cấy không đạt yêu cầu Lô vắc xin đạt u cầu vơ khuẩn khi: - Thử nghiệm có giá trị - Khơng có phát triển vi sinh vật ống môi trường sau 14 ngày theo dõi Khi có phát triển vi sinh vật: - Kiểm tra lần hai: Số lượng mẫu gấp đôi số lượng mẫu lần đầu Nếu sau 14 ngày theo dõi khơng có dấu hiệu tạp nhiễm lơ vắc xin đạt u cầu vơ trùng Nếu trình theo dõi phát tạp nhiễm tiến hành nhuộm Gram so sánh với vi sinh vật nhiễm lần đầu, kết so sánh giống lơ vắc xin khơng đạt u cầu vô trùng Trong trường hợp kết so sánh khác tiến hành kiểm tra lần - Kiểm tra lần ba: Số lượng mẫu gấp đôi số lượng mẫu lần đầu Nếu sau 14 ngày theo dõi khơng có tạp nhiễm lơ vắc xin đạt u cầu vơ trùng Nếu phát có phát triển vi sinh vật dù ống, lơ vắc xin khơng đạt u cầu vơ trùng Tiêu chuẩn chất lượng 75 Sản phẩm coi vơ khuẩn khơng có phát triển vi sinh vật ống môi trương sau 14 ngày theo dõi PHỤ LỤC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NỘI ĐỘC TỐ ENDOTOXIN (GEL CLOT) Nguyên tắc: Lysate hoạt chất trích ly từ máu sam biển (Horseshoe crab) Endotoxin làm hoạt hóa proenzyme có lysate, hoạt hóa xác định có mặt nồng độ endotoxin phản ứng Enzyme hoạt hóa (coagulase) liên kết làm đơng protein (Coagulogen) có lysate Khi có hoạt hóa xảy làm cho lysate đông lại (gelation) Endotoxin Proenzyme Coagulase Coagulase Coagulagen Coagulin Đơn vị endotoxin tính theo đơn vị quốc tế (EU/ml) Nguyên vật liệu thiết bị: 2.1 Thiết bị dụng cụ: - Máy lắc ống nghiệm - Tủ ấm 37oC - Micro pipette 200 l - Multichannel 10-300 l - ống nghiệm nhựa 1,8 ml - Pipet nhựa ml - Pipet nhựa ml 2.2 Dung dịch đệm sinh phẩm chuẩn: - Nước cất pha tiêm - Endotoxin chuẩn - Lysate - Brommothymol Blue 0.25% Các bước thực hiện: 3.2 Xác định endotoxin vắc xin: - Pha endotoxin chuẩn 1EU/ml: dùng tube có 50l endotoxin 20 EU/ml sau thêm vào 950 l nước cất, lắc máy lắc - Pha endotoxin chứng spike 2.5 EU/ml: dùng tube có 50l endotoxin 20 EU/ml sau thêm vào 350 l nước cất, lắc máy lắc 76 - Pha lõang mẫu thử phiến nhựa 96 giếng: Dùng micropipet hút 20l mẫu thử khơng có endotoxin cho vào tất giếng trừ hàng A Dùng micropipete thêm 40 µl mẫu thử vào giếng: Mẫu 1: A1 - A2 pha lõang bậc đến giếng H1 – H2 Mẫu 2: A3 – A4 pha lõang bậc đến giếng H3 – H4 Mẫu 3: A5 – A6 pha lõang bậc đến giếng H5 – H6 Mẫu 4: A7 – A8 pha lõang bậc đến giếng H7 – H8 Mẫu 5: A9 - A10 pha lõang bậc đến giếng H9 – H10 Dùng micropipete hút 40 µl endotoxin chuẩn EU/ml cho vào giếng A11-A12 Hút 20 µl từ hàng A11 & A12 cho vào hàng B11-B12 pha loãng đến hàng H11-H12 - Thêm vào tất giếng độ pha loãng 10 µl/giếng, endotoxin chứng spike 2.5 EU/ml - Dùng micropipet nhiều kênh cho vào tất giếng 20 µl lysate, tránh khơng để có bọt giếng ( lysate nhiệt độ 250C ) - Dùng băng keo dán phiến ủ thời gian 45 phút nhiệt độ 37oC Đọc tính kết quả: Đọc kết quả: - Dùng micropipete nhiều kênh cho vào tất giếng 10 µl dung dịch nhuộm màu Bromthymol blue 0.25% - Nhuộm gel nhiệt độ phòng thời gian phút - Dựng phiến nhựa theo vi trí thẳng đứng đèn neon để đọc kết - Phản ứng dương tính: Lysate tạo thành gel, nhuộm màu tạo thành hình trịn màu xanh dính đáy phiến - Tính kết quả: • Tính độ nhạy phản ứng: Số giếng Giếng Giếng Giếng Giếng Giếng Giếng Giếng Giếng Độ pha Endotoxin = EU 1:2 = 0.5 EU 1:4 = 0.25 EU 1:8 = 0.12 EU 1:16 = 0.06 EU 1:32 = 0.03 EU 1:64 = 0.015 EU 1:128 = 0.007 EU Kết Cột A11 + + + + + - Cột A 12 + + + + - Điểm dương tính cuối chứng dương (Endpoint) 77 Log 10 A 11 Log 10 A 12 Trung bình (TB) Anti Log 10 TB A 11= 0.06 EU/ml A 12= 0.12 EU/ml = -1.222 = -0.921 = -1.07 = 0.085 EU/ml • Cách tính kết endotoxin mẫu thử: Số giếng Giếng Giếng Giếng Giếng Giếng Giếng Giếng Giếng Độ pha Endotoxin = EU 1:2 = 0.5 EU 1:4 = 0.25 EU 1:8 = 0.12 EU 1:16 = 0.06 EU 1:32 = 0.03 EU 1:64 = 0.015 EU 1:128 = 0.007 EU Kết Cột A1 + + + - Cột A + + - Điểm dương tính cuối mẫu thử (Endpoint): Cột A1= dương tính đến độ pha 1/4 = 0.5 Cột A2= dương tính đến độ pha 1/2 = 0.25 Log 10 0.5 = -0.301 Log 10 0.25 = -0.602 Trung bình (TB) = - 0.45 Anti Log 10 TB = 0.354 = 1/2.82 Nồng độ endotoxin = Độ nhậy Lysate x điểm dương tính mẫu thử = 0.125 EU/ml x 2.82 = 0.352 EU/ml PHỤ LỤC KIỂM TRA AN TOÀN NGUN TẮC Thử nghiệm an tồn khơng đặc hiệu nhằm xác định có mặt thành phần độc khơng đặc hiệu có mặt vắcxin Thử độc tính khơng đặc hiệu phải thực lô vắcxin thành phẩm riêng biệt CHUẨN BỊ 2.1 Thiết bị STT Tên thiết bị Hãng SX Mã số Thiết bị Tình trạng hoạt động thiết 78 bị Tủ lạnh 40C SHARP MD/07 Hoạt động tốt Laminar Woerden Hà Lan MD/11 Hoạt động tốt Máy lắc Rescht Pháp MD/16 Hoạt động tốt 2.2 Dụng cụ Tên dụng cụ Lô hấp sấy (Lô hấp Số lượng sấy gần nhất) Hãng SX Pipet 10ml DIN (Đức) Bơm tiêm nhựa 1ml Vinahankook Chai thủy tinh 60ml Fisher 2.3 Súc vật thí nghiệm Loại chuột Phiếu yêu cầu Trọng lượng số Số lượng Ngày nhận (Ghi theo phiếu yêu cầu) Chuột nhắt (1722g) Chuột lang (250-350g 2.4 Mẫu thử - Mẫu thử vắcxin DPT, TT, Td…(liều đa), 20 liều/lọ: lọ, tương đương 80 liều - Mẫu thử TT, Td… ( liều đơn), 20 ống, tương đương 20 liều THỰC HIỆN 3.1 Yêu cầu - Lấy mẫu vắcxin cần thực phịng vơ trùng, laminar - Dụng cụ phải đảm bảo vô trùng Chuột lang có lượng 250-350g/chuột, 4-6 tuần tuổi, chuột nhắt 1722g/chuột, 5-7 tuần tuổi 79 - Tiêm chuột thực phịng chăn ni súc vật thí nghiệm 3.2 Tiến hành 3.2.1 Chuẩn bị mẫu thử - Để ấm mẫu nhiệt độ phòng, lắc kỹ mẫu thử Dùng pipet bơm kim tiêm hút số lượng mẫu thử lọ cho chung vào chai thủy tinh vơ trùng cho thể tích cuối khoảng 15 ml- 20ml 3.2.2 Tiêm chuột * Chuẩn bị chuột - Chuột khỏe mạnh không dùng cho thí nghiệm trước - Kiểm tra loại bỏ chuột không đạt yêu cầu: Bưới, ỉa chảy, xù lơng, ghẻ… Để chuột lang thích nghi với điều kiện mơi trường ngày trước thực thí nghiệm.2 chuột lang/mẫu nhốt lồng Cân trọng lượng chuột chuột nhắt trắng/mẫu nhốt chung lồng Cân trọng lượng chuột - Đánh dấu chuột - Gắn nhãn vào lồng chuột vừa chọn * Tiêm chuột - Tiêm chuột nhắt trắng trước - Lắc tube đựng vắcxin trước hút vắcxin vào bơm tiêm Tiêm 0.5 ml vắcxin vào ổ bụng cho chuột nhắt trắng Thay kim sau lần lấy vắcxin Sau tiêm chuột nhắt xong tiến hành tiêm cho chuột lang, cách tiến hành tương tự với tiêm chuột nhắt - Tiêm 0.5 ml vắcxin vào ổ bụng cho chuột lang * Theo dõi chuột Chuột phải quan sát kỹ đầu sau tiêm hàng ngày suốt ngày để phát lâm sàn ốm nhiễm độc - Ghi triệu chứng bất thường vào bảng theo dõi - Cân trọng lượng chuột trước tiêm, ngày thứ thứ sau tiêm TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG 4.1 Tiêu chuẩn chất lượng - Kết “ĐẠT” suốt thời gian theo dõi ngày: 80 o Tất chuột phải sống, khỏe mạnh o Khơng có chuột có dấu hiệu bị nhiễm độc 4.2 Lặp lại thí nghiệm Trong q trình thực xác định thí nghiệm bị ảnh hưởng yếu tố không đặc hiệu như: kỹ thuật, chất lượng chuột, môi trường hay nhiễm trùng, kết thử nghiệm không coi tin cậy phải loại bỏ Lần thử nghiệm tính làm lần đầu Nếu có chuột chết có dấu hiệu ốm nhiễm độc lần thử nghiệm thứ nhất, cần làm lại thử nghiệm với số lượng chuột gấp đôi, thử nghiệm lần thứ đạt yêu cầu khơng có chuột chết ốm nhiễm độc 4.3 Giải phẫu chuột Nếu có chuột ốm có dấu hiệu bất thường trình theo dõi, cần mổ chuột để xem xét xác định nguyên nhân gây bệnh Ghi chép vào biên giải phẫu chuột PHỤ LỤC XÁC ĐỊNH ĐỘ ẨM TỒN DƯ TRONG VẮC XIN ĐÔNG KHÔ Nguyên lý Sử dung phương pháp Karl Fischer để xác định độ ẩm tồn dư vắc xin đông khô theo nguyên lý chung dựa phản ứng toàn lượng nước với lưu huỳnh dioxyd iod có mặt alcohol chất base hữu thích hợp Hiện có nhiều thiết bị để đo độ ẩm tồn dư vắc xin, sinh phẩm đông khô, nhiên nguyên tắc thiết bị phải cấu tạo cho thao tác thuận tiện tránh ẩm Phương pháp tiến hành Tùy theo thiết bị hãng khác nên thao tác theo hướng dẫn vận hành hãng Phương pháp phổ biến để đo độ ẩm tồn dư vắc xin sinh phẩm đông khô phương pháp Karl Fischer Vận hành máy đo độ ẩm tồn dư theo hướng dẫn sử dụng Rót dung dịch chuẩn anod cathod vào khoang tương ứng đến mức quy định Cần lưu ý qua thời gian định, methanol dung dịch cathod thấm qua màng trao đổi ion cách thẩm thấu Để giảm bớt tình trạng khơng nên rót hóa chất đầy q mức quy định Bật máy cài đặt phương pháp lựa chọn Nếu máy đo độ ẩm tồn dư không hoạt động vịng tuần nên bật máy vài khoảng thời gian dù không tiến hành kiểm tra mẫu để nạp pin đảm bảo tất thơng tin chương trình 81 trì Cần đảm bảo trước nạp mẫu thử tỷ lệ % độ ẩm hình phải ổn định mức độ thấp để đủ đạt kết theo yêu cầu Cân xác trọng lượng tổng mẫu thử vật chứa mẫu Nhập trọng lượng tổng mẫu thử vật chứa mẫu vào máy, sau nhập trọng lượng vật chứa mẫu Đưa mẫu vào khoang bên qua đường bơm mẫu (nếu vận hành điều kiện độ ẩm cao sáng nên đóng kín nắp khoang chứa mẫu thử vận hành) Khi thực xong thử nghiệm, máy in tự động in kết độ ẩm tồn dư mẫu thử 82 PHỤ LỤC Quy trình biểu PoIFNα P pastoris quy mơ hệ thống lên men 7,5L • Chuẩn bị môi trường bồn lên men 2L môi trường lên men biểu PoIFNα chuẩn bị cho vào bồn lên men BioFlo/CelliGen 115 (New Brunswick Scientific Co, United State) dung tích 7.5L Bồn lên men chứa môi trường hấp khử trùng 121oC, 30 phút để nguội đến nhiệt độ phòng Thiết bị lên men trang bị đầu dò tự động để theo dõi kiểm sốt số oxy hồ tan DO (dissolve oxygen), nhiệt độ pH môi trường lên men Khi bắt đầu lên men, số DO hiệu chỉnh giá trị oxy tinh khiết nạp vào bồn lên 100%, pH điều chỉnh giá trị 5,0 dung dịch ammonia dung dịch acid phosphoric đặm đặc, Các thông số lên men như: DO, pH, nhiệt độ, tốc độ cánh khuấy, tốc độ bơm methanol theo dõi điều khiển phần mềm Biocommand thông qua máy tính • Chuẩn bị giống ban đầu Chủng P pastoris có khả biểu PoIFNα tốt (chủng IIa1) sàng lọc điều kiện nuôi cấy lắc (mục 2.6) sử dụng làm chủng giống cho nghiên cứu biểu bồn lên men 100 l chủng giống (trữ -80 oC) nuôi cấy tăng sinh 100 mL mơi trường BMGY bình erlen 500 mL 30 oC, lắc với tốc độ 250 rpm Sau 20 nuôi cấy, sinh khối ướt đạt khảng 1,5 – 2,5 g/L, sẵn sàng vào bồn lên men • Tăng sinh biểu PoIFN bồn lên men 100 mL giống tăng sinh môi trường BMGY bơm vào bồn lên men bơm nhu động Thiết lập quy trình lên men gồm pha bản: pha tăng sinh với glycerol pha cảm ứng methanol với thông số sau: Thông số Môi trường lên men Nhiệt độ pH Tốc độ sục khí Khống PTM1 Tốc độ cánh khuấy Pha tăng sinh với glycerol Pha cảm ứng methanol: BSMYP 30oC 25 oC 5,0 vvm 0,5 mL/L.24h (đến hết thí nghiệm) điều chỉnh cadcase 500rpm Set point DO: 50% 83 Tốc độ bổ sung methanol - 3,5 mL/L.h 24 tiếng đầu → tăng lên mL/L.h đến cuối thí nghiệm Thu mẫu kiểm tra sinh khối ướt, phân tích protein đích thời điểm 0, 24, 48, 72 sau cảm ứng SDS-PAGE, Western Blot kháng thể đặc hiệu, Bradford 84