Nghiên cứu tạo dòng tế bào gốc trung mô bệnh lí để thử nghiệm thuốc điều trị bệnh tiểu đường tuýp 2

SỞ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN TP HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM CƠNG NGHỆ SINH HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NGHIÊN CỨU TẠO DỊNG TẾ BÀO GỐC TRUNG MƠ BỆNH LÍ ĐỂ THỬ NGHIỆM THUỐC ĐIỀU TRỊ BỆNH TIỂU ĐƯỜNG TUÝP Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Trung tâm Cơng nghệ Sinh học TP HCM Chủ nhiệm nhiệm vụ: TS Trịnh Như Thuỳ Thành phố Hồ Chí Minh – 2020 SỞ NƠNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NƠNG THƠN TP HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ SINH HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP CỞ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NGHIÊN CỨU TẠO DỊNG TẾ BÀO GỐC TRUNG MƠ BỆNH LÍ ĐỂ THỬ NGHIỆM THUỐC ĐIỀU TRỊ BỆNH TIỂU ĐƯỜNG TUÝP (Đã chỉnh sửa theo kết luận Hội đồng nghiệm thu ngày 16/03/2020) Chủ nhiệm nhiệm vụ (ký tên) Trịnh Như Thuỳ Cơ quan chủ trì nhiệm vụ (ký tên đóng dấu) TRUNG TÂM CƠNG NGHỆ SINH HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Thành phố Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2020 BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KH&CN I THÔNG TIN CHUNG Tên nhiệm vụ: Nghiên cứu tạo dịng tế bào gốc trung mơ bệnh lí để thử nghiệm thuốc điều trị bệnh tiểu đường tuýp Thuộc: Chương trình/lĩnh vực (tên chương trình/lĩnh vực): Chủ nhiệm nhiệm vụ: Họ tên: Trịnh Như Thuỳ Ngày, tháng, năm sinh: 27/08/1984 Nam/ Nữ: Nữ Học hàm, học vị: Tiến sĩ Chức danh khoa học: Nghiên cứu viên Chức vụ: Nhân viên Điện thoại: Tổ chức: Nhà riêng: Mobile: 0984238274 Fax: … E-mail: trinhnhuthuy@gmail.com Tên tổ chức công tác: Trung tâm Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh Địa tổ chức: 2374 Quốc lộ 1, Phường Trung Mỹ Tây, Quận 12, TP Hồ Chí Minh Địa nhà riêng: 118/69/11 Tân Thới Hiệp 12, Phường Tân Thới Hiệp, Quận 12, TP Hồ Chí Minh Tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Tên tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Trung tâm Cơng nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh Điện thoại: 028 37153792 Fax: (84-28) 38 91 69 97 E-mail: ttcnsh.snn@tphcm.gov.vn Website: www.hcmbiotech.com.vn Địa chỉ: 2374 Quốc lộ 1, Phường Trung Mỹ Tây, Quận 12, TP Hồ Chí Minh Họ tên thủ trưởng tổ chức: Dương Hoa Xô Số tài khoản: 3713.0.1007645 Kho bạc: Nhà nước TP HCM Tên quan chủ quản đề tài: Trung tâm Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN Thời gian thực nhiệm vụ: - Theo Hợp đồng ký kết: từ tháng 01 năm 2017 đến tháng 03 năm 2019 - Thực tế thực hiện: từ tháng 01 năm 2017 đến tháng 06 năm 2020 - Được gia hạn (nếu có): - Lần từ tháng 03 năm 2019 đến tháng 06 năm 2020 Kinh phí sử dụng kinh phí: a) Tổng số kinh phí thực hiện: 700 tr.đ, đó: + Kính phí hỗ trợ từ ngân sách khoa học: 700 tr.đ + Kinh phí từ nguồn khác: tr.đ b) Tình hình cấp sử dụng kinh phí từ nguồn ngân sách khoa học: Số TT Theo kế hoạch Thời gian Kinh phí (Tháng, năm) (Tr.đ) 273 Năm 2017 Năm 2018 350 Năm 2019 77 Thực tế đạt Thời gian Kinh phí (Tháng, năm) (Tr.đ) 270,56 Năm 2017 349,20 Năm 2018 73,19 Năm 2019 Ghi (Số đề nghị toán) c) Kết sử dụng kinh phí theo khoản chi: Đơn vị tính: Triệu đồng Số TT Nội dung khoản chi Trả công lao động (khoa học, phổ thông) Nguyên, vật liệu, lượng Thiết bị, máy móc Xây dựng, sửa chữa nhỏ Chi khác Tổng cộng Theo kế hoạch Tổng NSKH 156,06 Nguồn khác Thực tế đạt Tổng NSKH 156,06 156,06 156,06 522,70 522,70 520,81 520,81 21,24 21,24 700 700 16,07 692,94 16,07 692,94 Nguồn khác - Lý thay đổi (nếu có): Các văn hành q trình thực đề tài/dự án: (Liệt kê định, văn quan quản lý từ công đoạn xét duyệt, phê duyệt kinh phí, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực có); văn tổ chức chủ trì nhiệm vụ (đơn, kiến nghị điều chỉnh có) Số TT Số, thời gian ban hành văn 325/QĐ-CNSH, 20/12/2016 88/HĐGV-CNSH, 03/05/2017 11/QĐ-CNSH, 18/05/2018 86/QĐ-CNSH, 25/06/2019 Tên văn Quyết định thành lập Hội đồng xét duyệt đề cương Hợp đồng giao việc thực đề tài cấp sở năm 2017 Quyết định việc thành lập Hội đồng Khoa học đánh giá tiến độ đề tài nghiên cứu cấp Trung tâm Quyết định việc thành lập Hội đồng Khoa học đánh giá tiến độ nghiệm thu nhiệm vụ khoa học công nghệ năm 2018 Ghi 44/2019/HĐ-SNN, 09/12/2019 476/QĐ-SNN 53/QĐ-CNSH, 11/03/2020 Hợp đồng thực nhiệm vụ khoa học Công nghệ cấp sở “Nghiên cứu tạo dịng tế bào gốc trung mơ bệnh lí để thử nghiệm thước điều trị bệnh tiểu đường tuýp (nhiệm vụ chuyển tiếp từ năm 2017) Quyết định việc gia hạn thời gian thực nhiệm vụ Khoa học Công nghệ cấp sở Quyết định việc thành lập Hội đồng Khoa học nghiệm thu nhiệm vụ khoa học công nghệ cấp Trung tâm Tổ chức phối hợp thực nhiệm vụ: Số TT Tên tổ chức đăng ký theo Thuyết minh Tên tổ chức tham gia thực Nội dung tham gia chủ yếu Sản phẩm chủ yếu đạt Ghi chú* … - Lý thay đổi (nếu có): Cá nhân tham gia thực nhiệm vụ: (Người tham gia thực đề tài thuộc tổ chức chủ trì quan phối hợp, khơng q 10 người kể chủ nhiệm) Số TT Tên cá nhân đăng ký theo Thuyết minh TS Trịnh Như Thùy Tên cá nhân tham gia thực Nội dung tham gia Sản phẩm chủ yếu đạt TS Trịnh Như Thùy - Chủ trì - Hồn thiện báo cáo tiến độ - Chủ trì việc Xác định biểu gen biệt hoá, kháng insulin tạo mạch - Chủ trì việc Thử nghiệm với thuốc điều trị bệnh tiểu đường tuýp xác định biểu protein EGR1 - Chủ trì việc đánh giá mơ hình di cư tế bào gốc mơ mỡ - Xác định biểu gen biệt hoá, kháng insulin tạo mạch - Thử nghiệm với thuốc điều trị bệnh tiểu đường tuýp xác định biểu protein EGR-1 - Đánh giá khả di cư tế bào gốc mô mỡ Ghi chú* TS Nguyễn Trọng Bình ThS Nguyễn Thị Nhật Uyên TS Nguyễn Trọng Bình CN Phan Ngọc Uyên Phương CN Mai Hữu Phương ThS Bùi Quốc Thắng CN Mai Hữu Phương ThS Âu Dương Tuyết Mai ThS Âu Dương Tuyết Mai CN Phan Ngọc Uyên Phương CN Phan Ngọc Uyên Phương - Nuôi cấy trì thành cơng dịng tế bào gốc mơ mỡ - Biểu gen biệt hố, kháng insulin tạo mạch - Xây dựng - Lập biểu đồ đường tăng trưởng cong tăng tế bào gốc trung trưởng tế mô theo thời bào tác gian điều động kiện nồng độ nồng độ đường cao đường cao - Biệt hoá - Biệt hóa tế thành cơng bào gốc trung dịng tế bào mô xác định gốc mô mỡ biểu thành tế bào gen biệt hoá xương mỡ - Biểu gen - Thử nghiệm kháng insulin với thuốc điều thử trị bệnh tiểu nghiệm với đường tuýp thuốc trị bênh tiểu đường - Xác định tuýp biểu protein EGR-1 - Biểu protein EGR1 - Đánh giá - Đánh giá mơ khả hình di cư di cư tế bào gốc mô tế bào gốc mô mỡ mỡ - Phân lập nuôi cấy tế bào gốc trung mô - Xác định biểu gen biệt hố, kháng insulin tạo mạch Khơng cịn cơng tác TT CNSH Khơng cịn cơng tác TT CNSH - Lý thay đổi (nếu có): Tình hình hợp tác quốc tế: Số TT Theo kế hoạch (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đồn, số lượng người tham gia ) Thực tế đạt (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia ) Ghi chú* - Lý thay đổi (nếu có): Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị: Theo kế hoạch Số (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa TT điểm ) Thực tế đạt (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm ) Ghi chú* - Lý thay đổi (nếu có): Tóm tắt nội dung, công việc chủ yếu: (Nêu mục 15 thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát nước nước ngoài) Số TT Các nội dung, công việc chủ yếu (Các mốc đánh giá chủ yếu) - Phân lập nuôi cấy tế bào gốc trung mô - Khảo sát nồng độ đường khác ảnh hưởng đến sức sống tế bào - Lập biểu đồ tăng trưởng tế bào gốc trung mô theo thời gian điều kiện nồng độ đường cao - Biệt hóa tế bào gốc trung mơ thành tế bào mỡ xương điều kiện nồng độ đường cao - Xác định biểu gen biệt hoá - Xác định gen kháng insulin - Kiểm tra thay đổi biểu gen tạo mạch - Xác định khả tăng trưởng tế bào gốc mô mỡ tác động nồng độ D-Glucose cao - Xác định gen kháng insulin - Thử nghiệm với thuốc điều trị bệnh tiểu đường tuýp lên khả tăng trưởng tế bào gốc mô mỡ tác động nồng độ D-Glucose cao - Xác định kháng insulin mức độ protein (phosphoryl hoá) - Xác định biểu protein EGR-1 Thời gian (Bắt đầu, kết thúc - tháng … năm) Theo kế Thực tế đạt hoạch 1/2017 – 1/2017 – 8/2017 8/2017 Người, quan thực TS Trịnh Như Thuỳ CN Mai Hữu Phương 9/2017 – 2/2018 9/2017 – 2/2018 CN Mai Hữu Phương 3/2018 5/2018 3/2018 5/2018 TS Trịnh Như Thuỳ 4/2018 6/2018 4/2018 6/2018 7/2018 11/2018 6/2018 11/2018 TS Trịnh Như Thuỳ TS Nguyễn Trọng Bình TS Trịnh Như Thuỳ ThS Âu Dương Tuyết Mai - Mơ hình đánh giá di cư tế bào in vitro Viết báo cáo nghiệm thu đề tài 12/2018 2/2019 12/2018 10/2019 CN Phan Ngọc Uyên Phương TS Trịnh Như Thuỳ Số lượng Theo kế hoạch Thực tế đạt 1 Đã tạo iAT-MSCs - Lý thay đổi (nếu có): III SẢN PHẨM KH&CN CỦA NHIỆM VỤ Sản phẩm KH&CN tạo ra: a) Sản phẩm Dạng I: Số TT Tên sản phẩm tiêu chất lượng chủ yếu Dịng tế bào gốc trung mơ mỡ bệnh lí Đơn vị đo - Lý thay đổi (nếu có): b) Sản phẩm Dạng II: Số TT Tên sản phẩm Yêu cầu khoa học cần đạt Theo kế hoạch Thực tế đạt Ghi - Lý thay đổi (nếu có): c) Sản phẩm Dạng III: Số TT Tên sản phẩm Huu-Phuong Mai, Thi-Le-Giang Nguyen, Trong-Binh Nguyen, Dang-Quan Nguyen, Hoa-Xo Duong, and Nhu-Thuy Trinh* Metformin impeded the effect of persistent high D-Glucose concentration on adipogenic potential of AT-MSCs Joint Meeting University of TsukubaUniversity of Science HCMC, 2019, Ho Chi Minh city, Vietnam Mai Hữu Phương, Nguyễn Trọng Bình, Nguyễn Đăng Quân, Trịnh Như Thùy* Metformin làm giảm biểu yếu tố liên quan đến tính kháng insulin tế bào gốc mơ mỡ người điều kiện D- Yêu cầu khoa học cần đạt Theo Thực tế kế hoạch đạt Poster báo đăng tạp chí nước quốc tế báo đăng tạp chí nước quốc tế Poster Số lượng, nơi cơng bố (Tạp chí, nhà xuất bản) The 1st Joint Meeting University of TsukubaUniversity of Science HCMC, 2019, Ho Chi Minh city, Vietnam Hội nghị CNSH Toàn quốc, 2019, Trung tâm Cơng nghệ Sinh học Tp Hồ Chí Minh glucose cao Hội nghị CNSH Toàn quốc, 2019, Trung tâm Cơng nghệ Sinh học Tp Hồ Chí Minh Trinh Nhu Thuy The effect of metformin on osteogenic and adipogenic differentiation of human stem cells under persistent high glucose concentration The 2nd Joint Meeting University of Tsukuba- University of Science HCMC, 2020, Ho Chi Minh city, Vietnam báo đăng tạp chí nước quốc tế Oral The 2nd Joint Meeting University of TsukubaUniversity of Science HCMC, 2020, Ho Chi Minh city, Vietnam - Lý thay đổi (nếu có): d) Kết đào tạo: Số TT Cấp đào tạo, Chuyên ngành đào tạo Thạc sỹ Tiến sỹ Số lượng Theo kế hoạch Thực tế đạt 1 Ghi (Thời gian kết thúc) - Lý thay đổi (nếu có): đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp: Số TT Tên sản phẩm đăng ký Kết Theo kế hoạch Thực tế đạt Ghi (Thời gian kết thúc) - Lý thay đổi (nếu có): e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN ứng dụng vào thực tế Số TT Tên kết ứng dụng Thời gian Địa điểm (Ghi rõ tên, địa nơi ứng dụng) Kết sơ 2 Đánh giá hiệu nhiệm vụ mang lại: a) Hiệu khoa học công nghệ: (Nêu rõ danh mục công nghệ mức độ nắm vững, làm chủ, so sánh với trình độ công nghệ so với khu vực giới…) b) Hiệu kinh tế xã hội: (Nêu rõ hiệu làm lợi tính tiền dự kiến nhiệm vụ tạo so với sản phẩm loại thị trường…) Tình hình thực chế độ báo cáo, kiểm tra nhiệm vụ: Số TT I Nội dung Báo cáo tiến độ Thời gian thực 24/05/2018 01/10/2019 II III Báo cáo giám định Nghiệm thu sở Chủ nhiệm đề tài (Họ tên, chữ ký) 16/03/2020 Ghi (Tóm tắt kết quả, kết luận chính, người chủ trì…) - Nhóm nghiên cứu hồn thành 75% kế hoạch - Chất lượng nghiên cứu tốt, kết đáng tin cậy - Báo cáo cần bổ sung thêm phần thảo luận - Cần có phương án thu nhận tế bào gốc từ mô mỡ người Việt Nam - Đề nghị bổ sung chứng dương tăng nồng độ D-glucose xử lý tế bào - Đề tài thực đa số nội dung đề đề cương - Kết thu tốt, có triển vọng, khả nghiệm thu khả thi - Tuy nhiên, thiếu số sản phẩm nghiên cứu theo đề cương đề - Đề nghị gia hạn thêm thời gian nghiên cứu đến 12/2019 - Chủ nhiệm nhóm nghiên cứu thực đầy đủ nội dung cần thiết nghiên cứu - Đề tài đạt kết cuối có ý nghĩa khoa học - Trình bày lại báo cáo nghiệm thu theo góp ý Hội dồng khoa học - Hồn thiện nộp báo khoa học tạp chí có uy tín - Đề nghị quan chủ quản cho nghiệm thu đề tài Thủ trưởng tổ chức chủ trì (Họ tên, chữ ký đóng dấu) khơng khác biệt so với dAT-MSCs Dữ liệu giá trị trung bình ba thí nghiệm độc lập (trung bình ± SD); P < 0.01 (**) Thanh tỉ lệ: 100 m Kết cho thấy tỉ lệ bắt màu với Oil Red O iAT-MSCs cao 2.78 ± 0.19 lần (P < 0.01, n = 3) so với nAT-MSCs khơng có khác biệt thống kê so với dAT-MSCs (Hình 4.10) Hơn nữa, khả biệt hoá mỡ iAT-MSCs cao 1.47 ± 0.10 lần (P < 0.01, n = 3) so với nAT-MSCs nuôi môi trường bổ sung 100 mM D-glucose (Hình 4.10) Do đó, kết khả biệt hoá mỡ iAT-MSCs tăng cao dù khơng cịn chịu tác động 100 mM D-glucose Hơn nữa, bổ sung metformin vào môi trường biệt hố, chúng tơi nhận thấy khả biệt hố xương iAT-MSCs tăng lên 1.22 ± 0.07 lần (P < 0.01, n = 3) khả biệt hoá mỡ giảm 1.21 ± 0.08 lần (P < 0.01, n = 3) (Hình 4.10) Điều cho thấy metformin có khả hạn chế biệt hố mỡ iAT-MSCs 3.1.7 Đánh giá khả không tự phục hồi iAT-MSCs thông qua biểu gen liên quan đến tính kháng insulin Tiếp theo đó, chúng tơi tiến hành kiểm tra biểu gene liên quan đến tính kháng insulin iAT-MSCs Kết RT-qPCR cho thấy iAT-MSCs có mức độ biểu gene EGR-1, PTEN GGPS-1 cao so với đối chứng nAT-MSCs (EGR-1, 1.76 ± 0.13 lần, P < 0.01, n = 3; PTEN, 1.48 ± 0.17 lần, P < 0.01, n = 3; GGPS-1, 1.51 ± 0.14 lần, P < 0.01, n = 3) (Hình 4.11) 37 EGR-1 ** Biểu mRNA ** ** ** * ĐC 100 mM iAT-MSCs dAT-MSCs nAT-MSCs Biểu mRNA ** ** G G P S-1 ** ** ** ** ** B iể u h iệ n m R N A PTEN ** * ** * ** ** 0 ĐC 100 mM nAT-MSCs iAT-MSCs dAT-MSCs ĐC 10 m M n AT-M SC s iAT -M SCs d AT -M SC s Hình 4.11 Biểu EGR-1 gene mục tiêu (PTEN GGPS-1) iAT-MSCs Biểu gene kiểm tra phương pháp qRT-PCR với chứng nội β-actin iAT-MSCs có mức độ biểu EGR-1 gene mục tiêu cao nAT-MSCs Dữ liệu giá trị trung bình ba thí nghiệm độc lập (trung bình ± SD); P < 0.01 (**); P < 0.05 (*); ĐC: Đối chứng Thêm vào đó, kết western blot cho thấy iAT-MSCs có mức độ biểu protein EGR-1 cao nAT-MSCs 1.36 ± 0.08 lần (P < 0.05, n = 3) (Hình 4.12) Đáng ý mức độ phiên mã dịch mã, biểu yếu tố liên quan đến tính kháng insulin iAT-MSCs khơng có khác biệt thống kê so với nAT-MSCs nuôi môi trường bổ sung 100 mM D-glucose (Hình 4.11 – 12) Điều chứng tỏ khơng cịn chịu tác động 100 mM D-glucose, iAT-MSCs giữ biểu yếu tố liên quan đến tính kháng insulin cao tương tự dAT-MSCs so với nAT-MSCs 38 3.1.8 Đánh giá khả không tự phục hồi iAT-MSCs thông qua biểu protein EGR-1 nAT-MSCs iAT-MSCs dAT-MSCs Metformin - + - + - + - + D-Glucose + - + - + - + - EGR-1 Actin EGR-1 EGR-1/Actin ** 1.5 ** ** ** ** * Non-Metformin Metformin 0.5 ĐC 100 mM iAT-MSCs dAT-MSCs nAT-MSCs Hình 4.12 Biểu protein EGR-1 iAT-MSCs Mức độ biểu protein EGR-1 xác định phương pháp western blot với chứng nội β-actin Biểu protein EGR-1 iAT-MSCs cao nAT-MSCs Dữ liệu giá trị trung bình ba thí nghiệm độc lập (trung bình ± SD); P < 0.01 (**); P < 0.05 (*); ĐC: Đối chứng Hơn nữa, kết cho thấy metformin có khả làm giảm biểu yếu tố liên quan đến tính kháng insulin iAT-MSCs Cụ thể, biểu protein EGR-1 giảm 1.28 ± 0.07 lần, biểu gene PTEN GGPS-1 giảm 1.37 ± 0.16 lần (P < 0.01, n = 3) 1.24 ± 0.11 lần (P < 0.05, n = 3) (Hình 4.11 – 12) 39 3.1.9 Đánh giá khả không tự phục hồi iAT-MSCs thông qua biểu gen tạo mạch di cư Kết trước chúng tơi cho thấy, dAT-MSCs có khả chữa lành vết thương nAT-MSCs [12, 32] Vì vậy, kiểm tra ảnh hưởng 100 mM D-glucose đến biểu gene số nhân tố tạo mạch (ANGPTL4) di cư (SDF-1, CXCR-4) Biểu mRNA ANGPTL4 ** ** ** ** ĐC Ctrl 100 mM dAT-MSCs 100 mM iAT-MSCs iAT dAT nAT-MSCs SDF-1 ** ** ** 10 ** B iể u h iệ n m R N A Biểu mRNA C XC R-4 ** ĐC Ctrl 100 mM dAT-MSCs 100 mM iAT-MSCs iAT dAT nAT-MSCs ** ** ** ** ** C CĐtrl 000 m m M iAT-M 10 iATS C s d AT-M d A TS C s n AT-M S C s Hình 4.13 Biểu nhân tố tạo mạch (ANGPTL4) di cư (SDF-1, CXCR-4) iAT-MSCs Biểu gene kiểm tra phương pháp qRT-PCR với chứng nội β-actin iAT-MSCs có mức độ biểu ANGPTL4 thấp nAT-MSCs biểu nhân tố di cư (SDF-1, CXCR-4) cao Dữ liệu giá trị trung bình ba thí nghiệm độc lập (trung bình ± SD); P < 0.01 (**); P < 0.05 (*); ĐC: Đối chứng Kết chúng tơi cho thấy dAT-MSCs có biểu ANGPTL4 cao 2.63 ± 0.23 lần (P < 0.01, n = 3), biểu SDF-1 CXCR-4 thấp 4.29 ± 0.15 lần 4.63 ± 0.18 lần so với nAT-MSCs (P < 0.01, n = 3) Tuy nhiên, 40 tác động 100 mM D-glucose, biểu ANGTPL4 nAT-MSCs tăng 2.43 ± 0.27 lần (P < 0.01, n = 3), SDF-1 giảm 1.24 ± 0.08 lần (P < 0.01, n = 3), CXCR-4 giảm 1.94 ± 0.13 lần (P < 0.01, n = 3) so với đối chứng (Hình 4.13) Sau ngưng tác động nồng độ D-glucose cao, kết cho thấy biểu nhân tố tạo mạch ANGPTL4 iAT-MSCs cao so với nAT-MSCs (1.93 ± 0.12 lần, P < 0.01, n = 3) Trong đó, biểu nhân tố di cư iATMSCs giảm so với nAT-MSCs (SDF-1, giảm 1.64 ± 0.11 lần, P < 0.01, n = 3; CXCR4, giảm 2.23 ± 0.15 lần, P < 0.01, n = 3) (Hình 4.13) Như vậy, kết chứng minh nồng độ D-glucose cao làm tăng biểu yếu tố liên quan đến tính kháng insulin, thay đổi biểu nhân tố di cư tạo mạch nAT-MSCs Dòng tế bào khơng có khả tự phục hồi khơng cịn chịu tác động nồng độ D-glucose cao 3.1.10 Đánh giá khả không tự phục hồi iAT-MSCs thơng qua mơ hình tế bào di cư in vitro Để đánh giá tiềm chữa lành vết thương tế bào gốc sau chịu tác động nồng độ D-glucose cao (100 mM), iAT-MSCs dAT-MSCs, thực phương pháp vạch tế bào (scratch assay) so sánh khả làm lành vết thương tế bào sau 24 h A B B Hình 4.14 Nồng độ D-glucose cao ức chế khả di cư tế bào in vitro A, Hình ảnh chụp kính hiển vi phân tích phần mềm Wimasis lúc h 41 24 h B, Tỉ lệ phần trăm vị trí hở vết thương nAT-MSC (đối chứng 100 mM), iAT-MSCs dAT-MSCs lúc h 24 h Số liệu lấy từ giá trị trung bình vị trí tổn thương khác lần lặp lại thí nghiệm (giá trị trung bình ± SD); **, P < 0.01 Thanh tỉ lệ: 500 m Kết cho thấy, tỉ lệ vết thương chưa lắp đầy sau 24 h dòng iATMSCs bị tăng đáng kể so với nAT-MSCs (tỉ lệ vết thương nAT-MSCs, 12.3 ± 0.88 vs 25.37 ± 1.70, P < 0.01, n = 5) (Hình 4.14) Kết cho thấy khả di cư iAT-MSCs bị ức chế nuôi cấy điều kiện với nAT-MSCs Quan trọng khả chữa lành vết thương iAT-MSCs tương tự dATMSCs nAT-MSCs chịu tác động 100 mM D-glucose Kết chứng minh iAT-MSCs giữ đặc tính tế bào chịu tác động nồng độ D-glucose cao khơng có khả tự phục hồi 4.2 Thảo luận Trong nghiên cứu này, gây kháng insulin tế bào gốc mô mỡ người cách nuôi chúng môi trường bổ sung nồng độ D-glucose cao Sau đó, thuốc metformin sử dụng để đánh giá hiệu làm giảm biểu yếu tố liên quan đến tính kháng insulin tác động D-glucose Kết bước đầu cho thấy nồng độ D-glucose cao làm chậm tốc độ tăng trưởng, gây biến đổi hình thái làm tăng biểu yếu tố liên quan đến tính kháng insulin nAT-MSCs Hơn nữa, thuốc metformin cho thấy tiềm việc làm giảm biểu yếu tố liên quan đến tính kháng insulin tác động nồng độ D-glucose cao nATMSCs iAT-MSCs ni mơi trường cảm ứng biệt hố xương biệt hoá mỡ để kiểm tra tiềm biệt hoá sau chịu tác động nồng độ D-glucose cao Kết cho thấy dịng tế bào cịn trì khả biệt hoá thành nguyên bào xương tế bào mỡ Tuy nhiên, khả biệt hoá xương iAT-MSCs bị giảm đáng kể, khả biệt hố mỡ tăng cao (Hình 4.9 - 10) Tiềm biệt hóa đặc tính quan trọng bật tế bào gốc Trong nghiên cứu này, tiến hành xác định khả biệt hóa thành tế bào xương tế bào mỡ nAT-MSCs dAT-MSCs Kết cho thấy nATMSCs dAT-MSCs thể tiềm biệt hóa thành tế bào mỡ tế bào xương 42 Kết tương tự nghiên cứu trước thực nhiều dòng tế bào gốc khác [33, 34] Tuy nhiên, nghiên cứu này, chúng tơi nhận thấy nAT-MSCs dAT-MSCs có xu hướng biệt hóa khác Trong đó, dAT-MSCs có xu hướng biệt hóa thành tế bào mỡ tốt hơn, biệt hóa thành tế bào xương lại so với nAT-MSCs (Hình 4.1 4.2) Vì vậy, nghiên cứu sâu giúp xác định nguyên nhân ảnh hưởng tới tiềm biệt hóa tế bào gốc mơ mỡ, ngun nhân tình trạng tăng đường huyết kéo dài bệnh nhân tiểu đường tuýp Mặc dù, D-glucose biết đến nguồn cung cấp lượng cho nhiều hoạt động tế bào [35] Tuy nhiên, nồng độ D-glucose cao chứng minh làm tăng gốc tự tăng mức độ lão hóa tế bào nội mô tĩnh mạch rốn tế bào gốc xương người [21, 22] Kết cho thấy nồng độ D-glucose cao làm giảm tốc độ tăng sinh gây biến đổi hình thái nAT-MSCs (Hình 4.3 4.4) Kết đồng ý với nghiên cứu trước đây, nồng độ D-glucose cao (25 mM) ức chế tăng sinh tế bào gốc xương chuột, tế bào xương MG63 số dòng tế bào gốc từ nguồn khác người (xương, thai, cuống rốn màng đệm) [34, 36, 37] Đáng ý, nghiên cứu này, nhận thấy nồng độ D-glucose cao tốc độ tăng sinh nAT-MSCs chậm hình thái chúng bị biến đổi Trong đó, nồng độ Dglucose 200 mM làm cho hình thái AT-MSCs bị biến đổi mạnh không tăng sinh suốt q trình ni cấy (Hình 4.3 4.4) Trong nghiên cứu trước thường đề cập đến ảnh hưởng 25 mM 55.6 mM D-glucose mà chưa ảnh hưởng nồng độ D-glucose cao lên tính kháng insulin tế bào [10, 20, 23] Đồng thời, cách thức tác động nồng độ D-glucose lên tính kháng insulin cịn chưa so sánh với tế bào bệnh nhân tiểu đường tuýp Vì nồng độ D-glucose cao (25, 50 100 mM) sử dụng để khảo sát biểu gene liên quan đến tính kháng insulin nAT-MSCs so sánh với dAT-MSCs Early growth response-1 (EGR-1) nhân tố phiên mã đóng vai trị quan trọng q trình sinh trưởng phát triển nhiều loại tế bào [25] Tuy nhiên, biểu mức chứng minh có liên quan đến việc làm tăng biểu gene liên quan đến tính kháng insulin [14, 24] Kết cho thấy nAT-MSCs có mức độ biểu EGR-1 thấp so với dAT-MSC Tuy nhiên, biểu mRNA protein EGR-1 nAT-MSCs tăng lên đáng kể chịu tác động nồng độ D43 glucose cao (50 mM 100 mM) so với đối chứng (Hình 3.5 3.6) Kết tương tự nghiên cứu khác thực dòng tế bào beta đảo tụy, tế bào biểu mô nội mạch tế bào mỡ chuột chịu ảnh hưởng 20 mM Dglucose [23-25] Trước đây, gene mục tiêu EGR-1 PTEN GGPS-1 báo cáo có liên quan đến việc làm tăng tính kháng insulin mức tế bào Trong PTEN ức chế đường PI3K/AKT, GGPS-1 lại kích hoạt tín hiệu MAPK/EKRK1/2 làm suy giảm tín hiệu insulin từ thụ thể IRS-1 [24] Trong nghiên cứu chúng tôi, với tăng biểu EGR-1, gene mục tiêu PTEN GGPS-1 tăng mức độ biểu nAT-MSCs chịu tác động nồng độ D-glucose cao (Hình 4.5) Hơn nữa, nồng độ D-glucose thêm vào cao, biểu PTEN GGPS-1 tăng Bên cạnh đó, mức độ biểu EGR-1, PTEN GGPS-1 cao dAT-MSCs so với nAT-MSCs điều kiện (Hình 4.5 4.6) Như vậy, kết cho thấy tương đồng cách thức mà nồng độ D-glucose cao làm tăng biểu yếu tố liên quan đến tính kháng insulin nAT-MSCs so với dAT-MSCs điều kiện in vitro Nồng độ D-glucose cao kéo dài nguyên nhân làm tăng tính kháng insulin bệnh nhân tiểu đường tuýp Đáng ý, nồng độ D-glucose khảo sát, ghi nhận 100 mM D-glucose có tác động mạnh lên biểu gene EGR-1, PTEN GGPS-1 nAT-MSCs (Hình 4.5 4.6) Metformin loại thuốc sử dụng phổ biến điều trị lâm sàng cho bệnh nhân tiểu đường tuýp 2, với vai trò hỗ trợ hấp thu glucose tế bào [3] Vì vậy, kiểm tra tác động metfromin lên biểu gene protein liên quan đến tính kháng insulin gây nồng độ D-glucose cao AT-MSCs Ở mức độ phiên mã, kết cho thấy metformin không tác động đến biểu mRNA EGR-1 (Hình 4.7A) Mặc dù vậy, biểu protein EGR-1 bị giảm đáng kể nAT-MSCs ni mơi trường có 100 mM D-glucose dAT-MSCs (Hình 4.7B) Nghiên cứu gần Can Wu cộng (2018) cho thấy metformin làm thay đổi biểu miR-34a (một yếu tố điều hòa gene mức độ sau phiên mã) từ làm giảm biểu EGR-1 tế bào gốc trung mơ chuột [28] Điều dẫn đến khác biệt tác động metformin lên biểu EGR-1 mức độ phiên mã dịch mã nghiên cứu Như đề cập trước đây, EGR-1 kích hoạt biểu PTEN GGPS-1 làm giảm tín hiệu PI3K/AKT thúc đẩy tín hiệu MAPK/ERK1/2, 44 điều làm tăng tính kháng insulin tế bào mỡ tế bào beta đảo tụy chuột [14, 24] Hơn nữa, theo kết nghiên cứu Kumar, metformin làm giảm tình trạng kháng insulin dòng tế bào myoblast chuột cách làm tăng biểu PI3K giảm phosphoryl hóa ERK1/2 [4] Trong nghiên cứu này, chúng tơi chứng minh metformin làm giảm biểu protein EGR-1 AT-MSCs Cùng với đó, biểu trung gian gây kháng insulin (PTEN GGPS-1) điều chỉnh giảm xuống nAT-MSCs (mẫu nuôi 100 mM D-glucose) dAT-MSCs bổ sung metformin vào mơi trường ni (Hình 4.8) Như vậy, kết cho thấy tiềm hứa hẹn metformin việc làm giảm tính kháng insulin gây nồng độ D-glucose cao dịng tế bào bào gốc mơ mỡ người Tóm lại, nghiên cứu chứng minh nồng độ D-glucose cao làm xuất dấu hiệu việc kháng insulin nAT-MSCs cách làm tăng biểu EGR-1 gene mục tiêu (PTEN GGPS-1) tương tự dAT-MSCs Đáng ý, tế bào sau cảm ứng nồng độ D-glucose cao (iAT-MSCs) khơng có khả tự phục hồi thong qua minh chứng (1) biệt hoá xương mỡ; (2) biểu gen liên quan đến tính kháng insulin; (3) hạn chế khả tạo mạch di cư thong qua biểu gen mơ hình tế bào di cư in vitro Thông qua nghiên cứu này, chứng minh metformin thể tiềm tốt việc (1) tăng khả biệt hoá xương; (2) giảm khả biệt hoá mỡ; (3) ức chế tăng biểu gen protein liên quan đến tính kháng insulin nAT-MSCs tác động nồng độ Dglucose cao, iAT-MSCs dAT-MSCs Mặc dù vậy, nghiên cứu sâu chế tác động nồng độ D-glucose cao metformin đến tính kháng insulin chức tế bào gốc mô mỡ người điều cần thiết để phát triển liệu pháp điều trị bệnh tiểu đường tuýp V KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ Kết luận Đề tài đạt kết theo nội dung nghiên cứu hoàn thành bước đầu việc đánh giá khả tạo dòng tế bào gốc trung mơ bệnh lí để thử nghiệm thuốc điều trị bệnh tiểu đường tuýp Trong đề tài này, chúng tơi chưa xác định phosphoryl hố thụ thể IRS-1 Đây kết chứng minh tính kháng insulin tế bào điều 45 kiện D-glucose cao, iAT-MSCs dAT-MSCs Các giả thuyết lý giải cho nguyên nhân không đạt kết mong muốn do: (1) kháng thể đặc hiệu; (2) nồng độ protein IRS-1 phosphoryl hoá thấp; (3) chưa xác định khoảng thời gian phosphoryl hoá nhiều thụ thể IRS-1 Đề nghị Tiến hành thử nghiệm dược liệu thảo dược lên dòng tế bào tác động nồng độ D-glucose cao, iAT-MSCs dAT-MSCs để so sánh hiệu để hồn thiện quy trình tạo đánh giá dịng tế bào gốc trung mơ bệnh lí VI TÀI LIỆU THAM KHẢO Ralph A DeFronzo et al 2015 Type diabetes mellitus Nature Reviews 1: - 22 Olusegun A Obateru Abdulfatai B Olokoba, Lateefat B Olokoba 2012 Type Diabetes Mellitus: A Review of Current Trends Oman Medical Journal 27 (4): 269 - 273 Gustavo Dias Ferreira, Ariane Germeyer, Amanda de Barros Machado, Tadeu Ludwig Nascimento, Thomas Strowitzki, Ilma Simoni Brum, Helena von Eye Corleta, Edison Capp 2014 Metformin modulates PI3K and GLUT4 expression and Akt/PKB phosphorylation in human endometrial stromal cells after stimulation with androgen and insulin European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology 175: 157 – 162 Chinmoy S Dey Naresh Kumar 2002 Metformin enhances insulin signalling in insulin-dependent and -independent pathways in insulin resistant muscle cells British Journal of Pharmacology 137: 329 – 336 K Marra and JP Rubin Minteer D 2012 Adipose-derived mesenchymal stem cells: biology and potential applications Springer Berlin Heidelberg: - 13 LP Franca Gaiba S, JP Franca and LM Ferreira 2012 Characterization of human adipose-derived stem cells Acta Cirurgica Brasileira 27: 471 - 476 H Eichler Kern S, J Stoeve, H Klüter and K Bieback 2006 Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue Stem Cells 24: 1294 - 1301 46 Kimura K et al 2014 The role of CCL5 in the ability of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells to support repair of ischemic regions Stem Cells And Development 23: 488 - 501 Jianming Guo et al 2018 Adipose-derived mesenchymal stem cells accelerate diabetic wound healing in a similar fashion as bone marrow-derived cells American Journal of Physiology-Cell Physiology 315 (6): 885 – 896 10 Christopher Cramer et al 2010 Persistent High Glucose Concentrations Alter the Regenerative Potential of Mesenchymal Stem Cells Stem Cells and Development 19: 1875 - 1884 11 Nhu-Thuy Trinh et al 2016 Increased Expression of EGR-1 in Diabetic Human Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells Reduces Their Wound Healing Capacity Stem Cells And Development 25: 760 – 773 12 Toshiharu Yamashita Nhu Thuy Trinh, Tran Cam Tu, Toshiki Kato, Kinuko Ohneda, Fujio Sato, Osamu Ohneda 2016 Microvesicles enhance the mobility of human diabetic adipose tissuederived mesenchymal stem cells in vitro and improve wound healing in vivo Biochemical and Biophysical Research Communications 473: 1111 - 1118 13 Tahir S Pillay et al 1996 Glucose-induced Phosphorylation of the Insulin Receptor - Functional Effects and Characterization of Phosphorylation Sites The American Society for Clinical Investigation 97: 613 – 620 14 Xiao Yu et al 2011 Egr-1 decreases adipocyte insulin sensitivity by tilting PI3K/Akt and MAPK signal balance in mice The EMBO Journal 30: 3754 – 3765 15 Bệnh viện Nội tiết Trung ương, Báo cáo kết sơ hoạt động điều tra lập đồ dịch tễ học bệnh tiểu đường toàn quốc năm 2012 2012 16 Phan Nguyễn Thanh Bình 2012 Tổng quan tiểu đường tuýp - Các yếu tố nguy di truyền mơi trường Tạp chí Dinh dưỡng Thực phẩm (3): 17 C Bogardus, S Lillioja, D.M Mott, C Hollenbeck, G Reaven 1985 Relationship between degree of obesity and in vivo insulin action in man American Journal of Physiology-Cell Physiology 248: 286 - 291 18 Mark E Cooper Steven E Kahn, Stefano Del Prato 2014 Pathophysiology and treatment of type diabetes: perspectives on the past, present, and future The Lancet 383: 1068 - 1083 47 19 KL Seeberger Yeung TY, T Kin, A Adesida, N Jomha, AM Shapiro and GS Korbutt 2012 Human mesenchymal stem cells protect human islets from pro-inflammatory cytokines PLoS One 7: 30 20 Frida Renstrfm et al 2007 Insulin resistance induced by high glucose and high insulin precedes insulin receptor substrate protein depletion in human adipocytes Metabolism Clinical and Experimental 56: 190 – 198 21 Munsey TS Abuarab N., Jiang LH., Li J., Sivaprasadarao A 2017 High glucoseinduced ROS activates TRPM2 to trigger lysosomal membrane permeabilization and Zn2+-mediated mitochondrial fission Science Signaling 10: 22 Patrick Horn Wolfgang Wagner, Mirco Castoldi, Anke Diehlmann, Simone Bork, Rainer Saffrich, Vladimir Benes, Jonathon Blake, Stefan Pfister, Volker Eckstein, Anthony D Ho 2008 Replicative senescence of mesenchymal stem cells: a continuous and organized process PLoS ONE (5): 23 Rukhsana N Hasan et al 2003 Differential Regulation of Early Growth Response Gene-1 Expression by Insulin and Glucose in Vascular Endothelial Cells Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology 23: 988 – 993 24 Ning Shen et al 2011 An Early Response Transcription Factor, Egr-1, Enhances Insulin Resistance in Type Diabetes with Chronic Hyperinsulinism The Journal Of Biological Chemistry 286: 14508 –14515 25 K Josefsen et al 1999 Glucose induces early growth response gene (Egr-1) expression in pancreatic beta cells Diabetologia 42 (195 – 203): 26 E Rosivatz 2007 Inhibiting PTEN Biochemical Society Transactions 35: 257 – 259 27 Amit Gupta et al 2012 PTEN, a widely known negative regulator of insulin/PI3K signaling, positively regulates neuronal insulin resistance Molecular Biology of the Cell 23: 3882 - 3898 28 Can Wu et al 2018 Metformin Regulating miR-34a Pathway to Inhibit Egr1 in Rat Mesangial Cells Cultured with High Glucose International Journal of Endocrinology 2018: 29 Kenichi Kimura Masumi Nagano, Toshiharu Yamashita, Kinuko Ohneda, Daisuke Nozawa, Hiromi Hamada, Hiroyuki Yoshikawa, Naoyuki Ochiai, Osamu Ohneda 2010 Hypoxia Responsive Mesenchymal Stem Cells derived from Human 48 Umbilical Cord Blood are Effective for Bone Repair Stem cells and Development 19 (8): 1195 - 1210 30 Ele Ferrannini Ralph A DeFronzo, Leif Groop, Robert R Henry, William H Herman, Jens Juul Holst, Frank B Hu, C Ronald Kahn, Itamar Raz, Gerald I Shulman, Donald C Simonson, Marcia A Testa and Ram Weiss 2015 Type diabetes mellitus Nature Reviews 1: 31 K Cusi, Consoli, A., DeFronzo, R.A 1996 Metabolic effects of metformin on glucose and lactate metabolism in noninsulin-dependent diabetes mellitus The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 81: 4069 - 4067 32 Nhu-Thuy Trinh et al 2016 Increased Expression of EGR-1 in Diabetic Human Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells Reduces Their Wound Healing Capacity Stem Cells And Development 25: 760 – 773 33 Tatjana Schilling Yu-Ming Li, Peggy Benisch, Sabine Zeck, Jutta Meissner-Weigl, Doris Schneider, Catarina Limbert, Jochen Seufert, Moustapha Kassem, Norbert Schuătze, Franz Jakob, Regina Ebert 2007 Effects of high glucose on mesenchymal stem cell proliferation and differentiation Biochemical and Biophysical Research Communications 363: 209 – 215 34 Sirikul Manochantr Weerawan Hankamolsiri, Chairat Tantrawatpan, Duangrat Tantikanlayaporn, Pairath Tapanadechopone, Pakpoom Kheolamai 2016 The Effects of High Glucose on Adipogenic and Osteogenic Differentiation of Gestational Tissue-Derived MSCs Stem Cells International 2016: 35 Sara Leo Paola Aguiari, Barbara Zavan, Vincenzo Vindigni, Alessandro Rimessi, Katiuscia Bianchi, Chiara Franzin, Roberta Cortivo, Marco Rossato, Roberto Vettor, Giovanni Abatangelo, Tullio Pozzan, Paolo Pinton, Rosario Rizzuto 2008 High glucose induces adipogenic differentiation of muscle-derived stem cells PNAS 105 (4): 1226 – 1231 36 Xiaolin Zhang Weiwei Wang, Jiaqiang Zheng, Jianhong Yang 2010 High glucose stimulates adipogenic and inhibits osteogenic differentiation in MG-63 cells through cAMP/protein kinase A/extracellular signal-regulated kinase pathway Molecular and Cellular Biochemistry 338: 115 - 122 49 37 Xiaojun Cao Xinyu Shao, Ge Song, Yuan Zhao, and Bimin Shi 2014 Metformin Rescues the MG63 Osteoblasts against the Effect of High Glucose on Proliferation Journal of Diabetes Research 2014: 50 51