Nghiên cứu ứng dụng tế bào vùng rìa giác mạc và bước đầu biệt hoá tế bào gốc máu cuống rốn người

ỦY BẠN NHÂN DẦN TP.HCM SO KHOA HOC VA CONG NGHE TRUONG DH Y KHOA PHAM NGỌC THẠCH BAO CAO NGHIEM THU TEN DE TAI: NGHIEN CUU UNG DUNG TE BAO VUNG RIA GIAC MAC VA BUOC DAU BIET HOA TE BAO GOC MAU CUONG RON NGUOI Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS.BS Trần Công Toại Ths Phan Kim Ngọc THÀNH PHO HO CHI MINH THANG 07/2011 ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRUONG DAI HQC Y KHOA PHẠM NGỌC THẠCH BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đà CHỈNH SỬA THEO GĨP Y CUA HOI ĐƠNG NGHIỆM THU ĐÈ TÀI) TEN DE TÀI: NGHIEN CUU UNG DUNG TE BAO VUNG RiA GIAC MAC VA BUOC DAU BIET HOA TE BAO GOC MAU CUONG RÓN NGƯỜI CHU NHIEM DE TAI (Ky tén) ⁄— đà Ư_2." Trần Cơng Toại CO QUAN QUANLY (Ký tên/đóng dấu xác nhận) VN PHĨ AIK HIỆU TRƯỞNG Phan Kim Ngọc CO QUAN CHU TRi (Ký tên/đóng dấu xác nhận) ` Phan Minh Tân TOM TAT NOI DUNG NGHIEN CỨU Nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc hướng Việt Nam nhiều nước giới Với tiềm lớn y học điều trị, giúp nhà lâm sàng có thêm phương tiện, người tiếp cận kỹ thuật cao chăm sóc sức khỏe Nghiên cứu chúng tơi tiến hành thành cơng biệt hóa tế bào đơn nhân từ máu cuống rốn người cứu bản, thành công thành nguyên bào xương, tế bảo sừng Đây nghiên nhà khoa học giới công nhận qua hai báo tiếng Anh tạp chí cell and tissue banking Bên cạnh đó, qua học tập kinh nghiệm từ labo tiên tiến Nhật thực thành công qui trình ni cấy tạo tắm biểu mơ từ tế bào ving ria giác mạc niêm mạc má để điều trị cho 30 mắt tốn thương với kết ban đầu đáng khích lệ Cũng qua nghiên cứu chúng tơi xây dựng qui trình tạo tắm tế bảo sừng qui trình biệt hóa tế bào gốc tủy xương thành nguyên bào xương mở triển vọng cho ghép tự thân điều trị bệnh lý cần ghép da bệnh lý khuyét hong xương cần ghép điều trị SUMMARY OF RESEARCH CONTENT in the world Stem cell research is a new strategy of Viet Nam and many countries are helpful some The stem cell would have good potential for medicine treatment, there tools for physican and a patient can have quality high for health care In vitro cell, that is a first differentiation of osteoblast and keratinocyte from cord blood stem than 30 epithelium succesceful in our basic research Our experiments had been more sheets from limbal cell and oral mucosal cell The epithelium sheets to 3C cornea epitheliums disease with good result for clinical used sheet and osteoblast Follow our research, we set up protocol to make keratinocyte differentiation from human treatment in the future bone marrow These program can be use autografts for MUC LUC Tóm tắt đề tài/dự án (gồm tiếng Việt tiếng Anh) Mục lục Danh sách chữ viết tắt Danh sách bảng Danh sách hình 1.0 PHÀN MỞ ĐÀU Tén dé tai/dw an:Nghién citu ting dung tế bào vùng rìa giác mạc Trang i ii v vi viii bước đầu biệt hóa tế bào gốc mau cudng ron người Chủ nhiệm đề tài:PGS.TS.Trần Công Toại ThS Phan Kim Ngọc Cơ quan chủ trì: Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch Thời gian thực hiện: 12/2006 — 12/2008 Kinh phí duyệt: 885.860.000 2.0 2.2 2.3 2.4 Kinh phí cấp: 805.869.000d theo TB sé: 218/ TB-SKHCN ngày 28/11/2006 va TB số: 49/ TB-SKHCN ngày 22 /04/2008 Mục tiêu: Xây dựng qui trình phân lập, ni cấy tế bào giá thể màng, collagen từ màng ôi người, nguồn tế bào gốc vùng rìa giác mạc Ứng dụng thử nghiệm điều trị 30 bệnh nhân liệu pháp tế bào gốc từ vùng rìa giác mạc Xây dựng qui trình phân lập, ni cấy biệt hóa nguồn tế bào gốc máu cuồng rốn người thành tế bào sừng, nguyên bào xương — định hướng cho điều trị Xây dựng qui trình bảo quản nguồn tế bào gốc người thu nhận, nuôi Sản phẩm đề tài Qui trình phân lập, ni cấy tế bào vùng rìa giác mạc giá thể màng collagen từ màng ối, tạo tắm biểu mô điều trị bệnh lý biểu mô giác mạc 32) Qui trình phân lập, ni cấy tế bào niêm mạc má giá thể màng 33, Kết ứng dụng ghép tắm biểu mô điều trị bệnh lý biểu mô collagen từ màng ôi, tạo tắm biểu mô giác điều trị bệnh lý biểu mô giác mạc giác mạc có hiệu cao qua q trình theo dõi đánh giá 30 3.4 ca ghép biêu mơ từ niêm mạc má vùng rìa giác mạc Qui trình phân lập, ni cấy biệt hóa tế bào máu cuống rốn thành 3.5 Qui trình phân lập, ni cấy biệt hóa tế bào máu cuống rồn thành 3.6 Qui trình bảo quản tế bào sau nuôi cấy nguyên bào xương tê bào sừng Đào tạo báo khoa học - ÁÔ ` ¬-ANBWNHO CHUONG I: TONG QUAN TAI LIEU Tình hình nghiên cứu ngồi nước Tình hình nghiên cứu nước Đặc điểm biêu mô giác mạc Các phương pháp điều trị 10 10 11 14 16 16 Một số khái niệm Cuống rồn Các phương pháp thu nhận máu cuống rốn Bảo quản tê bào Rã đông Môi trường nuôi cay Đánh giá số lượng tế bào 17 18 19 20 25 32 Các phương pháp nhận biết tế bào trung mô máu cuống rồn Các phương pháp nhận biết tế bào sau biệt hóa Biệt hóa tế bào trung mô từ máu cuống rồn Màng ôi người Sinh học tê bào sừng CHƯƠNG II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nội dung Tạo tắm biểu mô điều trị bệnh lý bề mặt nhãn cầu Thí nghiệm 1.1: Qui trình tạo màng collagen từ màng người 35 vùng rìa giác mạc 36 niêm mạc má 36 Thí nghiệm 1.2: Qui trình tạo tắm biểu mơ giác mạc từ tế bào gốc Thí nghiệm 1.3: Qui trình tạo tắm biểu mơ giác mạc từ tế bào gốc Thí nghiệm 1.4: Qui trình điều trị bệnh lý biểu mơ giác mạc kết i ghép điều trị 30 bệnh nhân tình nguyện Thí nghiệm 1.5: Điều trị bệnh lý biểu mô giác mạc kết ghép điều trị 30 bệnh nhân tình nguyện Nội dung 2: Phân lập tế bào gốc máu cuống rốn người ' Thí nghiệm 2.1: Phân lập tế bào gốc máu cuống rồn người phương pháp ly giải hồng câu 36 a 38 38 Thí nghiệm 2.2: Phân lập tế bào gốc máu cuống rốn người 39 Nội dung 4: Biệt hóa tế bào gốc máu cuống rốn người thành nguyên bào xương, tế bào sừng 40 Ficoll Thí nghiệm 3.1: Biệt hóa tế bào gốc máu cuỗng rốn thành nguyên bào xương Thí nghiệm 3.2: Biệt hóa tế bảo gốc máu cuống rồng người thành tế bào sừng Nội dung : Bảo quản tế bào sau nuôi cấy - Thí nghiệm 4.1: Qui trình bảo quản tê bào sau nuôi iii 40 40 41 CHƯƠNG III: KẾT QỦA VÀ BÀN LUẬN 3.1 31.1 Ne dung 1: Tạo tắm biểu mô điều trị bệnh lý bề mặt nhãn 42 Qui trình tạo màng collagen từ màng ối người 42 cầu FA Nuôi cấy, ức chế tế bào 3T3 dùng làm lớp feeder 3.1.4 Qui trình xử lý tế bào niêm mạc má 34,3 3.1.5 3.1.6 S17 3.2 3.21 S272 42:3 3.2.4 3:22 3.26 3.3 314.1 3.3.2 34 Qui trình thu nhận ni cấy tế bào vùng rìa giác mạc Qui trinh tạo tắm biểu mơ giác mạc từ tế bao gốc vùng rìa giác mạc Đánh giá tắm biểu mơ sau ni Qui trình điều trị bệnh lý biểu mô giác mạc kết ghép điều trị 30 bệnh nhân tình nguyện Nội dung 2: Phân lập tế bào gốc máu cuống rốn người Phân lập tế bào đơn nhân máu cuống rồn Khảo sát hiệu phương pháp ficoll li giải hổng cầu Các yếu tố ảnh hưởng, đến kết phân lập phương pháp li giải hông câu 43 43 45 45 46 49 49 51 57 So sánh hiệu hai phương pháp Ficoll lí giải hồng cầu So sánh hiệu nuôi cấy tế bào qua hai phương pháp phân lập Quy trình nuôi cấy tế bào 58 59 61 Nội dung 4: Biệt hóa tế bào gốc máu cuống rốn người thành nguyên bào xương, tế bào sừng 68 Biệt hóa tế bào gốc máu cuống rồn thành nguyên bào xương 68 70 Nội dung 5: Bảo quản tế bào sau ni cấy 73 KẾT LUẬN 74 Biệt hóa tế bào gốc máu cuống rồng người thành tế bào sừng PHỤ LỤC Phụ lục I: Qui trình xử lý tế bào niêm mạc má Phụ lục II: Qui trình phân lập tế bào máu cuống rốn dùng nuôi cấy, biệt hóa Phụ lục III: Qui trình biệt hóa tế bào gốc máu cuồng rốn thành tế bào sừng Phụ lục IV: Thu nhận tế bào gốc từ máu cuống rồn biệt hóa thành tế bào xương Phụ lục V: Quy trình bảo quản tế bào Phụ lục VI: Quy trình rã đơng tế bào TÀI LIỆU THAM KHẢO 75 77 79 82 85 DANH SACH CAC CHU VIET TAT THUAT NGU TIENG VIET VIET TAT H Micro AGM Động mạch chủ-tuyến sinh dục-trung thận DNA Deoxyribonucleic acid DMEM Dulbecco’smodified Eagle’s medium HG High glucose IMDM Iscove’smodified Dulbecco’ smedium L Lit LG Low glucose M Mol/lit M Mili MCR Máu cuống rốn oc Osteocalcin RNA Ribonucleic Acid BMP Bone morphogenetic protein HBV Virus DNA HIV Human Immunodeficiency Virus RT Reverse transcription: ma nguge Unit thuéc ho Hepadnaviridae BẢNG ĐỐI CHIẾU ANH - VIỆT Động mạch chủ-tuyến sinh dục- trung Aorta-Gonad-Mesonephron thận Cord Blood-Derived Embryonic-Like Stem Cells) Cord Blood-Derived Multipotent Progenitor Cells Unrestricted Somatic Stem Cells Tế bào gốc giống tế bào gốc phôi Apoptosis Affinity chromatography Chết chương trình Sắc ký dựa vào lực máu cuống Tế bào đầu dòng đa tiềm từ MCR Tế bào gốc sinh dưỡng không giới hạn Adipocytes Adult stem cell Tế bào mỡ Tế bào gốc từ người trưởng thành Blastocyte Centrifugal elutriation Phôi nang Rửa quay ly tâm Chondrocytes Connecting stalk Tế bào sụn Cuống phôi Crude preparation Culture Tách tế bào loại thô Nuôi cấy Early hemapoietic stem cells Tế bào gốc tạo máu Embryonic germ cell Tế bào mầm từ phôi Countercurrent distribution Phân phối đảo ngược Differentiation Biệt hóa Embryonic stem cell Tế bào gốc từ phơi Epiblast Thượng bì phơi Electrophoresis Điện di Fibroblast Nguyên bào sợi Dung dịch ly giải hong cầu Erylysis buffer đo kích thước tế bào qua dòng Flow cytometer Máy Hepatocytes Tế bào gan chảy Mào sinh dục Genital ridges Khối nội bào Phương pháp đãi miễn dịch Inner cell mass Immune panning vi Isolation Phân lập Chọn lọc từ tính Chất nên Magnetic sorting Matrix Member of the nanos family Microbeads Myoblast Thanh phan nanos Vi hạt từ tính Nguyên bào Multipotential Tính đa Tế bào giống myofibroblast Myofibroblast-like cells Cơ chế kìm hãm ngược Negative feed-back Nguyên bào xương Osteoblast Primitive multipotential cells Primordial germ cells Primary cell Tế bào nguyên thủy đa Tế bào mầm nguyên thủy Tế bào sơ cấp Stem cell Tế bào gốc Y học phục hồi Regenerative medicine Té bao dém Stromal cells Cay chuyén Subculture Lá nuôi ngoại mac Trophoectoderm Lớp thach Wharton Wharton's jelly Cuống nỗn hồng Yolk stalk Túi nỗn hồng Ghép dị loại Yolk sac endoderm Xenotransplantation vii DANH MỤC CÁC BANG TRANG TEN BANG SO LIEU so 1.1 | Hiệu liêu chiêu xạ gamma khác lên khả 31 ngăn thấm vi sinh vật màng ối 3.2 | Lí loại bỏ MCR trước nuôi cấy 3.3 | Đặc điểm sản khoa mẫu MCR 49 49 thu thập 50 3.5 | Tương quan yếu tố sản khoa thể tích MCR thu 50 3.4 | Đặc điểm mẫu MCR thập 3.6 | Khảo sát mật độ tế bào đơn nhân thu phương 51 pháp dùng li giải hồng cầu phương pháp dùng Ficoll 3.7 | Khảo sát tỉ lệ tế bào sống thu phương pháp dùng li giải hổng cầu phương pháp dùng Eicoll 52 3.8 | Số lượng tế bào tách 52 3.9 [Tương quan yếu tố sản khoa, thể tích MCR số 53 lượng tế bào thu thập trước nuôi cấy 3.10 | Đặc điểm tạo khúm tế bào nuôi cấy 54 3.11 | Đặc điểm tạo lớp đơn tế bào nuôi cấy 54 3.12 | Đặc điểm tế bào cấy chuyển lần 55 3.13 | Đặc điểm tế bào cấy chuyển lần 55 3.14 | Mật độ tế bào đơn nhân thu phương pháp dùng 55 3.15 | So sánh phương pháp thực với tác giả khác 56 3.16 | Khảo sát mật độ tế bào đơn nhân thu băng phương 57 Eicoll số lần quay li tâm mẫu viii Cell Tissue Bank Materials and methods BM MSCs collection and culture 1.5-2.0 ml of bone marrow in).5 ml of heparing was collected from the iliac crest of 20 consented donors, 15 male and female, (average age of 40+ -with a range between 18 and 68) aspired trom iliac crest and tested for exclusion of infection, including HIV, HBV, HCV and VDRL After | week in culture, the average cell density was of 4.4 x 107/ml A total of 40.5 ml of BM blood (range I-16 x 107) was 29-156 colonies) Mononuclear cells from BM were isolated by centrifugation at room temperature, in a density of | x 107 cells/ml using FicollPaque (Amersham, Freiburg Germany) in a ratio of L part of Ficoll-Paque and three parts of blood and PBS and centrifuged at 300 g for 10 Suspended cells have been collected and counted using trypan blue, 300 jul suspended cells plus ml IMDM (IMDM, Gibco, Grand Island NY, USA), plus 20% FBS v/v (Gibco USA) Mononuclear cells were cultured in IMDM medium plus 15% FBS and 500 jl penicillin- steptomycin and incubated at 37°C with in humidified atmosphere with 5% CO2 Non-adherent cells were removed by medium change performed a every days and washed using PBS (buffer solution) twice Primury mononuclear cells started to attach on average at day 2, they were passaged al day at 70-80% confluence using a solution of TrypsinEDTA (Gibeo BRL USA) and seeded in new flasks at density of 10°/ml forming unit to check the Fluorescence electronic microscope Either hBM MSCs or Osteoblasts were tested by fluorescence microseope for actin, desmin, vinentin, Runx2 and osterix (OSX) RUNX2 (Sant Cruz the C-terminus of RUNX2 of human origin OSX (Santa Cruz Biotechnology inc USA) Monoclonal Anti-Desmin antibody produced in mouse (Sigma— Aldrich) and monoclonal Anti-Vimentin antibody produced in mouse, (Sigma-Aldrich) Slides used are SuperFrost from Menzel, Filter Cards trom Thermo Shandon, and Cytospin centrifuge from Shandon together with holders and containers Fluorescence staining procedures The reagents used are PBS, permeabilisation reagent 0.1% titonX in PBS, staining solution | containing primary antibody, 100 jul for each specimen staining solution containing secondary antibody with green fluorescence (e.g Alexa488 or FITC), phalloidine- Alexa fluor 546 stain for actin Hlaments and DAPI nuclear stain, 100 pl for cach specimen, glass jar Dako mounting medium and cover slips Slides were washed once in PBS in jar for min, once dried it was added 100 ju of permeubilisation reagent per slide to cover all sections for | Slides were washed in Jur with PBS for other min, once dried it CFU-Fs assay A colony laboratory ml FGP9 Biotechnology inc, USA) from purified goat pulyclonal antibody raised against a peptide mapping al measured with an average of 79.95 + 8.31 CFU-Fs (range: 15% FBS, 10~’ M dexamethasone (Sigma-Aldrich), 50 ig/ml ascorbic acid (Sigma-Aldrich), 10 mM/mi ˆ B-glycerol phosphate (Sigma-Aldrich) and the aduitional combination of vitamin D2 107? Mand 10 ng/ assay was rate growth was added 100 jl of staining solution | per slide to used in our and develop cover all sections for |_h, Slides were washed times After | week in culture, the average added 100 41! of staining solution per slide to cover of BM blood (range 1-16 x 107 cells/ml) was mea- mounted the tissue by using Dako mounting medium progression of hBM MSCs towards their differentiation into osteoblasts, cell density was of4.40 x 10” cells/ml A total of 20 ml sured with an average of 79.95 + 8.31 CFU-Fs (range: 29-156 colonies) Osteoblast culture Primary BM derived MSC were cultured in a medium , solution composed of IMDM containing antibiotics, for | in PBS ina jar, by changing PBS and it was all sections for Lh Slides were dried and it has been and seal the cover slips with nail varnish MSCs und osteoblast kuryotyping MSCs and osteoblast were harvested at approximately 70-80% confluence in culture Hask ‘125 em? and treated with coleemid for mitotic arrest © Springer Cell Tissue Bank Then, cell pellet was suspended in KCI hypotonic : acetic acid solution and fixative’s solution methanol onto cold wet 3:1) After that, cells were dropped denaturated slides and allowed to air-dry Slides were g slides were in heat at least 40 at 80°C Followin and wash in ion solut ing's colored in Giemsa stain GAAGA-) AGGG primer (5'-GGGCAAGGGCA -CCAAGGC (5' er 25 pm/reaction, Actin forward prim eaction, pm/r GCGAGAAGATGAC-3') CAACC e cells per slide tap Finally, twenty to 30 metaphas were analyzed, the karyotype of each representative of >80% cell confluence culture is Porites Luteu One natural porous coral was selected, distilled water, The coral was washed in 0.9% ray 25 KGy lyophilization and sterilized gamma coral scaffold MSCs were centrifuged five times with rpm and consecuin osteogenic medium at 1,000 re flask with new tively collected and seeded in cultu oblusts, destined Oste days ml osteogenic up to 21 microscope, ronic elect by for fluorescence analysis ined to be dest cells e whil were harvested at day days tested by AP were harvested after 21 RT-PCR cell culture wits Total RNA extraction of the tested control using the carried-out including the positive The supernatant was Trizol LS reagent (Invitrogen) RNA at the removed without losing the precipitated the tube The bottom or on one side of the bottom of the inscript g usin out iedcDNA synthesis was carr synthesis x kit (Biorad) Finally, the multiple cin and actin PCR was carried-out for osteocal CACCGAG AGC Osteocalcin forward primer ( 5'-CGC cin reverse ocal Oste ACACCAT-3') 25 pniv/reaction, um ‘Table Four different types of osteogenic medi Medium n.1 65.25 ml IMDM 8.70 ml pen.-strep 13.05 ml FBS: 10.0 ml Dexamethasone 1,00 mt Ascorbic avid 2,00 ml fi glycerol phosphate D Springer Results were CCGCCAGAC-3') 25 pm/reaction with 600 bps band for under agarose gel electrophoresis band for osteocalcin actin expression, and 400 bps expression Results Coral seeding and preparation cDNA GT: 'ACAT GGTGGTG Actin reverse primer (5-AGG read Medium 0.2 63.25 ml of IMDM 8.70 ml pen.-strep 13.05 ml FBS 10.0 mi Dexamethasone 1.00 mt Ascorbie acid 2.00 ini fi glycerol phosphate 2.00 ml vitamin D2 und their In vitro culture of MSCs from hBM morphology the potential ot hBM To investigate and confirm has isolated low density derived stem cells our team 6), 1, 2, 3, 4, 5, mononuclear cells from BM (Figs condition using and cultured under appropriate stromal cells rapidly IMDM plus 1S%FBS Marrow rated from n0nadhered and could be easily sepa adherent hematopoietic cells by sub-sequent sub- condition, at day culture, In appropriate culture form few adherent, mononuclear cells started to like cells clusters st fusiform and elongated fibrobla precursor cell, inct each of which derived from a di cell cultures have been the CFU-F (Table |), Primary logy was detected by stained by giemsa and morpho y with other stud inverse microscope and compared s have been tested tor results (data not shown) MSC OSX by lluorcsactin, vimentin, desmin, runx2 and 10 11 12 13) cence electronic microscope (Figs in vitro a very strong Average primary cells showed growing and prolif adherence capacity, with a fast span with few samples eration rate, a general long life Medium 13 65,05 ml of IMDM 8.70 ml pen-strep 13.05 ml FBS 10.0 ml Dexamethasone 1,00 mt Ascorbic weid 2.00 int fi glycerol phosphate 0.20 ml FGPY Medium a4 63.05 mi of IMDM 8.70 ml pen-strep 13.05 ml FBS 10.0 ml Dexamethasone 1.00 mÌ Ascorbie acid 2.00 ml f glycerol phosphate 2.00 ml vitamin D2 0.20 inl FGFY Cell Tissue Bank | é NA ° ? green ned for actin rei color, funk Figs 10-13 10 MSCs staitron stained s MSC VY pe ic microsco color, by fluorescence elec actin once esc fur by , color red , r, for vimentin, green cola MSCs stained for desmin, green electronic microscope 12 rs ned for osterix greet colo15 Figs, M17 14 Osteoblastsrescstai pe osco micr ic tron elec ence netin red color, by fluo in, green color, uti, red color Osicablusts stained for desmimieruseope, 16 Ostevblasis stained! by fluorescence electronic rexcence electronic microsco,pe.by color, actin, red color, by twogree n calor: autin, red colar 13 MSCs stained for asterix,oscope fluorescence electronic micr red colar by Ruoroseenee for Runx? green colli actin, blast ntin Osteo s stained! for Vunetron gieetronie mittoscope 17 calor ic elec nce esce Muor by , red green callor, actin, microscope D Springer Cell Tissue Bank blasts from an old woman Either MSCs and osteo ochrom showed normal diploid karyotypes with no XX, without some structural alteration, 46 XY or 46 these results aneuploidy or polyploidy, eventually blasts indicate that the in vitro cultured MSCs and osteo e cultur g durin cs eneti cytog l are able to retained norma s proces ating phase and after the differenti that last well over months with no signs of decreasing neither in proliferating capacity nor an early apoptosis The majority of samples were differentiated n just after the first passage and the rate of contaminatio of y stabilit ‘was almost zero To confirm chromosome cell culture during each passage, we tested for karyotype MSCs from a young male and osteoblasts hoi 18 different cell lines, on A Figs E248 was performed on two MSCs from a young adult male and on osteoblasts from an old woman 18 MSCs Karyotype, cells are 30 days e.ca and 2nd generation, 19 Osteoblast Karyotype, cells are 60 days c.ca 2nd generation WS Hk RB BS BR ah WK RO ah BY af fs (€ 19 a aa Re AR an sexy ae aan Ñ SM n bi,4 i ]i Ì OGghd y ya OVA Ty rh oe oh % : \ i , d in environment 20 Osteoblast like vells from hBM cultureFGF9 and D2 vitamin with d enriche medium 0steogenic stained with HE, original magnitication x 100, 24 Osteoblast © Springer finỉ Wi ASeofh Gbfeckay OR re Cơ welare vetrtìexetleueebve (gesnl m;ớc te) mớn tri NA Viet onto coral and Figs 20-24 hBM MSCs were directly seeded osteomespecific a using by lineage ast osteobl induced into showed results The FGFY dium enriched of vitamin and the new inside rate prolife and home to able are that MSCs iy ie ' Ae ' oa eae” ae if ae ys "tệ i fe as ` , inverse like cells from HBM in coral stained bylike giemsi froin hBM cells last Osteob 22 microseope x 100 at day 15 day 15 at 400 cope micros e invers AP, with Stained stained days 21 at coral on seeded 23Osteublasts from hBM d by staine coral on seeded hBM from s vblast 240ste by AP wre colar blue calor; red actin: for Auorescence microscope nuclei Cell Tissue Bank havea strong adherence capacity with a fast growth rate At the beginning of week cells started to produce a strong, compact matrix with high presence of calcium deposits In general, the surviving rate of osteoblasts was well over passages three and four with very few cases of defection caused by apoptosis (Figs 18 19) However, contrary to those from hUCB all cryopreserved ples did not survive Osteocells seeded on a coral sc: begun to adhere on scaffold surface just after a week, newly osteoblast colonies homed deep inside the porous and interstitial spaces of the coral and were tested for actin by fluorescence electronic microscope (Figs 24) and also stained by HE, Giemsa and AP (Figs 20, 21, 33,39) Fig 25 The BM-MSCx osteoblast phenotype was evaluated by the expression uf ustevealcin al day 21 by using RT-PCR following the manufacturer instruction RNA has been isolated by using Trizol (Gibeo-USA) following the manufacturer's Discussion protocol The extracted RNA has been solved in diethylpyr- The results of our study show a behavior in vilro of transcribed to CDNA with data from published studies (Figs 24, 25, 26) After a relatively critical first phase of seeding, we ocarbonate-treated water, The by using mRNA Advantage his been RT-PCR inverse cDNA has been amplified by using ABIGencAmp PCR system at 94°C for 40 s, 56°C or 50 s and 72°C for 60 » for 35 cycles after an initial denaturation at 94°C for Lane / indicates human osteoblast from hBM cultured in osteo medium plus vitamin D2 and FGFY, Lane indicates MSCs from HBM and Lane osteoblasts from hBM cultured in osteomedium with only vitamin D2 control Characteristics of osteoblast cultures from BM und their morphology In the presence of osteogenic inducers, human BM mesenchymal like cells started to change shape (within seven days), together’ with a continuous increase of alkaline phosphatase and a high presence of typical nodules of hydroxypatite The morphology dd by inverse microscope and compared Wis it with cells from published studies (data not shown) Osteogenesis wus evaluated by classic cytochemical stains including AR, AP and VK, by RT-PCR for osteocalcin markers after a period of 21 days ( actin and human osteoblasts were used as internal control vither for negative or positive control) (Figs 20, 21, 25), assessed for Runx2 and OSX by fluorescence electronic microscope (Figs 14, 15 16, 17) Overall, osteoblast like cells from BM MSCs revealed an average high grade of homogeneity, and it was: observed that all cell lines acquired their typical round-cuboidal shape within few days and showed to BM derived MSCs and osteoblasts which are in line ave successfully obtained, without any substantial loss (less than 1%), cultures up to the 3rd generation over a dozen samples of MSCs and osteoblasts from i single cell culture The results have conlirmed the ability of BM derived MSCs and osteoblasts to adhere and proliferate on a coral scalfold, Porites lutea, homing in the deepest interstices within a short time period (4, 5, 59) The compatibility of Porites ited in human has been tested by our team for over a decade to treat irreversible bone defects such as spinal stenosis (Figs 27, 28, 29, 30) and mandibular defects (data not shown) Model studies and human clinical trials confirmed that this type of coral is completely compatible with the humitn body and no sign of rejection or colluteral effects have been outlined during all of the pre-clinical and clinteal phases Therefore, these data are to be considered crucial because it has demonstrated that the coril scaffold may be used as an ideal osteoinductor and osteoconductor that can be eventually used in clinical procedures in treatment of complicated bone revon- struction, Another important outcome is that the MSC derived osteoblasts maintained their multipotent ability Under proper conditions osteoblisis were induced to re-differentiate into mesenchymal cells which kept a good growth and developing rate capacity, reaching confluence just after few days D Springer Cell Tissue Bank previous the coral ebrae, condition which is diagnosed vert l vica level of ve the a1 osis sten Fig, 26 The MRI images show a spinal implant, Poritey (urea s the same patient after the Figs 27-30 The X-ray image show d Porites lute, The MRI images, performe surgical implant of from show an almost total recovery months after the surgery l spina the of ild rebu ent the previous condition with an evid our results showed Iwo (data not shown) Furtherny ore, i jon no apparent correlat additional facts, first there 1s primary cells density and between the donor's age and ected from BM, second quantity of primary CFU-Fs coll donor's age and the there is no correlation between MSCs and osteoblast, survival rate of both cell lines, than generation for more which lasted over the third the data from the youngest months If we compare ary ity of his prim donor, who is 18 years old, the dens D Springer a as coral implant has hét!0 canal; overall the use of Parites1,00lure ents showing any sign pati vs sinee ä decade on over rejection or incompatibility than CFU-Fs is far more less cells and the quantity of wit old, s r, who is 78 year those from the oldest dono ml and a ity against 8.0/ ratio of 2.2/ml of cell dens against 110 (Table 1) A 34 quantity of CFU-Fs of from this study is the second point that comes out D3 for amin D2 and vita equivalent function of vit ciation with FGF9 (Jono osteoblast maturation in asso conlirmed by etal, 1998; Toui et al 2009) As al ready FGF9 play an important several studies, vitamin D3 and EHIME oy Cell Tissue Bank role, in vitro and in vivo, either in osteocells activity for matrix deposition and mineralization or as main factors in atherosclerotic plaque formation which recall the al osteogenesis process (Purpura et al, 2004; Long et al, 1995; Chao et al 2004; Sudo et al 2007; Hung et were MSCs from sts osteobla all this, 2007) In spite of positive for traditional stains including AR, AP, VK and HE, Vitamin D2 and FGF9 were essential in the lor osteogenic medium to obtain a positive result be may result osteocalcin marker by RT-PCR This not explained by the fact the expression of osteocalcin is directly correlated with the results of cytochemical Sudo stains like AR, AP and VK (Chang et al 2006; etal 2007) However, despite the ongoing debate about MSCS clinical results, whether it is possible to use them in any form or from any source, we are highly aware that be there still remains a few critical issues that should drawn considered before any definitive conclusions are ‘As some authors warn, expansive sub-cultivation may ng eventually impair the cell functionality, by affecti their karyotype, the telomere activity (Reiser etal 2005) and alter the phenotypic stability of stem cells, which that osteoblast cell line Following this, we are aware painful e, invasiv quite the aspiration of BM is a , procedure and may result in some undesirable effects e reliabl and however we consider it a rather strong practice at least in autologous clinical phase Theretore based on our clinical experience and in vitro results, we conclude that this approach, which includes the combination of autologous hBM osteoblasts and Porites e it lutea coral, may be a reasonable answer to achiev better, faster and resolute result in some kinds ol bone defective pathologies To conclude, at the present une fact is well consolidated, the future of stem cells and their effective use in clinical fields still require time As solve a some authors diligently warn, we still have to tive defini their ering few crucial issues before consid it 1s use in clinical treatments for human diseases, they once critical to know the final fate of stem cells c transfused in a new environment und their speciti athoaetiop involvement either in tissue healing or as genic agents (de Buri and Dell’Accio 2007; de Winter 2003) remay have dangerous consequence once they are injected in vivo Dell’ Accio 2007; been anextensive still missing is possible different (Minguell et al 2001; de Bari and Reiser et al, 2005) Though there has use of MSCs either in vitro or in vivo, a conclusive understanding of the behavior of fresh or non-manipulated nvironversus expanded MSCs within the tissue microc et al, Reiser 2007; Accio Dell’ and ment in vivo (de Bari ve effecti the clear get to al essenti 2005) Therefore, it is lineage cell tor progeni the role and function between and the terminally committed progeny and the biologand ical identity of the different types of MSCs (de Bari e becaus is This Dell’ Accio 2007; Reiser et al 2005) nesis athoge aetiop MSCs may play a eritical rule in the of a disease, rather to be just a passive largel of which inflammatory cytokines or a potential factor, eventually reverse a disease process (de Bari and sts Dell’ Accio 2007; Reiser ct ul, 2005) Some scienti to speculate that some form of osteoporosis may be due ors to an abnormal tendency of osteoblast precurs 2005) in Laughl and (Tse ytes differentiate into adipoc Conclusion and implication tent Our data have confirmed that hBM is a consis to e entiat differ source of MSCs which are able to References cell differen: Aubin JE, Heersche JN (2000) Osteuprogenitur tiation to mature bone forming osteoblasts Drig Dew Res 49:206-215 ists and Aubin JE, Malaval F, Gupta AK (1995) Osteobl chondroblasts differentiation Bone 17@).77-83 (2001) Bone Bianco P, Riminucei M, Gronthos S, Robey P marrow stromal stem cells: nature, biology and potential application Stem Cells 19:18U-192 pathway Blank U, Karlsson G, Kurlsson S (2007) Signaling 01 :492-5 111(2) Blood fate, cell stem ng governi Bodine PVN (2008) Wat signaling control of bone cell spop- tosis Cell research 18:248-253 asis ct ostevelBoissy P, Malaval L Jurdie P (2000) Osteobl astes une cooperation exemplaire entre cellulee mesenur Le Cherche chymateuses et cellules hemataporetiques, 66-16 tun Carrefour de I’ Information Hématolugic (2005) Cell R Quarto A s Derubei Cancedda R Bianchi G, Stem therapy for bone disease: a review of current status Cells 21:610-619 (2007) Mesen Chamberlain G, Fox J, Ashton B, Middleton J chymái stem cells: theif phenotype, differentiation hom capacity immunological features and potential fur ing Stem Cells 25:2739-2749 DC Hwang Chang YJ Shih DTB, Tseng CP Hyich TB, Lee eres in SM (2006) Disparate mesenchymal livieage tendlew marrow sunt mesenchymal stem cells from human bone umbilical cord Stem Cells 24:679-685 Stem cell uansChao NI, Emerson SG Weinberg KI (2004) plant, J Hematol 1:354-371 Springer Cell Tissue Bank YS, Park SY, Kim JB (2006) Lee HW, Suh JH, Kim AY, Lee ed histone modification diat I-me e tylas deace Histone ation Mol Endocrinol renti diffe regulates osteoblasts 20(10):2432-2443 Lim r DW, Po Hui JH, Lee EH, Liu TM, Martina M, Hutmache me ways path on comm B (2007) Identification ‘of ed ow ‘and adipose tissue deriv Uifferentiation of bone marr S, Ding G, Gu X (2002) Bone Chen F, Tao K Mao T, Chen n n mandibular condyle reco huma ‘of graft in the shape into s blast osteo ed eriv struction via seeding marrow-d llofac Surg Maxi porous coral in a nude mice model J Oral 1155-1158 X, Liu Y, Lei D, Mao T (2004) Chen F, Chen S, Tao K, Feng natural osteoblasts seeded into porous into three mesenchymal human mesenchymal stem cells Marrow derived bone graft in the shape coral to prefabricate vascularized rime ntal study in rab- lineages Stem Cells 25(3):750-76 aft EA Mann KG (1995) ReeuAsher JA, nson Robi MW, Long derived osteoprogenitur cells Jation of human bone marrow ‘of human mandibular ramus: expe 32-537 bits J Oral Maxillofac Surg 42:5 Shaw SY, Yang CY (2009) A Chun Y, Lee TM, Chiu KH, mechanical prop- Invest 95:88 1-887 by osteogenic growth factors } Clin Isolation of progenitor ) (2007 E Livne S, S, Srouji comparative study of the physical onandthe criteria for bone~ erties of three natural corals based Sci Mater Med tissue engineering scaffold J Mater 20;:1273-1280 Ciapetti G, Ambrosio (2006) Human L, Marletta G, Baldini marrow bone stromal N, Giunti cells: matrives, Cytor‘cells from cord blood using adhesion heenology 54(2): 121-133 nchymal stem J1, Erices A, Conget P (2001) Mese Maurice Minguell A 507-520 cells Soc Exp Biol Med 226; er MA, Connell Mahoney O'Brien FJ, Farrell E, Wall P, Campbell in vitro engineering Bioexpansion and differentiation for bone materials 27:6150-6160 In search of the invivo L, Caplan Al, Nardi NB (2008) Silva da Cells26:2281-2299 Stem cells, stem mal nchy identity of mese stem cells in mal nchy Mese ) de Bari C, Dell'Accio F (2007 to joint repair theumatology: a regenerative approach Clin Sci 113:339-348 the future of stem cells? Cytode Winter EA (2003) What ts technology 43:133-138 ent of fracture healing Einhorn TA (1995) Enhancem Joint Surg 77:940-956 Tu X, Wa X, Bai $, Zhao H, J Bone Kobayashi T, P, Kopan R, Long F ‘Kronenberg HM, Teitelbaum S, Ross marrow mesenbone s (2008) Notch signaling maintaining osteoblast differenti- Hilton MJ, chymal progenitors by suppress ation, Nat Med 14(3):306-312 A Chen TC, Klein EK, Young Holick MF, Biancuzzo RM, um enba Tann A, i Amer W, Bibuld D, Reitz R, Salameh effective ax vitamin Dy in AD (2008) Vitamin D2 is as - ns of 2S-hydroxyvi maintaining circulating concentratio b 3:677-681 tamin D J Clin Endocrinol Meta W, Marx JC, Neel MD, MeNalL Horwitz EM, Gordon PL, Koo Isolated Allogeneic bone RY, Muul L, Hofman T (2002) ft and engra marrow derived mesenchymal stem ogencells esis imperfecta oste with ren child in th grow late stimu PNAS 99(13): implication for cell therapy of bone 8932-8937 Hung SC, Chen NI, (2002) Isulation Lo WH Hsieh SL, Li H, Ma HL, ieved size of n zatio cteri and chara Stem Cells 20:249-258 stemcells from human bone marrow ) FGF9 regu- z DM (2007 Hung TH Kory KY, Lavine J, Omit ytes: differentiation lates hypertrophic chondroc and skel- stylopod Dev Biol elal vascularization in the developing 307(2):300-315 diA, Morii H (1998) 25 Jono S, Nishizawa Y, Shioi fica calci lar vascu in vitro hydroxy vitamin D3 increases l secretion of endugenous parathyrou tion by modulating hormone-related peptide J Am Heart Association-Cire 98: 1302-1306 mal stem cells: heading Koc O, Lazarus HM (2001) Mesenchy Transplant 27:235-239 into the clinic Bone Marrow Chen MH, Hsieh CH Jiang cc Lee HS, Huang GT, Chiou LL, mal stem cells from bone nchy mese t (2003) Multipoten Stem Cells 21:190-199 sis marrow near site of osteonecro D Springer DO VA McHugh McGarry JP, Murphy BP, olds y minar preli cells: and Scaff ) Prendergast PJ (2004 colt a of use the for ts biomechanical analysis and resul engineerins.ln: Prentagen gag scaffold for bone tissue (eds) Topics in bivdergast PJ and MeHugh PE 183 167pp ing neer mechanical engi lor ow stromal cells as stem cells Prockop DJ et al (1997) Marr ce 276:71-7 nonhematopoietic tissues Scien in vilro stra PW (2004) Sustained Zand JE, n Aubi KA, ura Purp density dependent expansion of bone progenitors is cell Stem Cells 22:39-50 tio MP, Senegagiis AC Rebelatto CK, Aguiar AM, More Cira J, Martins J Kuligovski Hansen P, Burchiki F, Olive al VF Brofman PS, GldMansur F, Christofis A, Amar A (2008) Dissimilar dilferea Corr enberg S, Nakao LS, bane marrow from entiation of mesenchymal stem secellstissue, Exp Biol Med adipo and , umbilical cord blood 913 234:901on In: Battler A Leor J (eds) Redui AH (2006) Bone regenerati in regener and gene-based therapy: frontiers Stem cell New York tive medicine, vol 13 Springer-Verlag pp 195-199 D Pradhan CS, Mondal Reiser J, Zhang XY Hemenway of mesentchyinal stem cell Russa VF (2005) Potential and acquired gene therapy approaches for inherited : 1571-1584 5(12) eases, Expert Opin Biol Ther L, Tuan RS (2004) Transdifferentiation dis- potential of from bone marhuman mesenchymal stem cells derived row FASEB Journal 18:980-985 and medicine ElseStocum DL (2006) Regenerative biology vier, Amsterdam, p 237 a S, Hiroyama T Sauio Sudo K, Kanno M, Miharada K, Ogawmal niturs ary able K Nakamura ¥ (2007) Mesenchy, chonproge enic and/or drog genic osteo into to differentiate most primaly in nt prese are adipogenic cells in vitro Cells 25:1610-1617 Stem ation popul fibroblast-lil C Ngve PK Van PH, ‘Toai TC, Thao HD Thao NP Gargiulo differentiation of Song culture and Strong DM (2009) In vitro cord blood Cell Tissue osteoblasts from human umbilical Bank KD, Lee YS, Hsu LW Chi Tsai MS, Hwang SM, Chen AS © Wang CN, Peng HH, Chang YL Chao YK (2007) Lee KD Wang TH, Wang HS, Soong Cell Tissue Bank Functional network analysis on the transcriptomes 0F mesenchymal stem cells derived from amniotic fluid, amniotic membrane, cord blood and bone marrow Stem Cells Express 25(10);251 |-2523 Tse W, Laughlin MJ (2005) Umbilical cord transplantation: new alternative option, J Hematol 377-383 (eds) Tuan RS, Chen FH (2006) Cartilage In: Botler A, Lear J Stem cells and gene based therapy, vol 12 Springer, Berlin, pp 179-189 Waese EY, Kandel R (2007) Application of stem cells in bone repair Skeletal Radiol 37(7):601~608 Xu W, Zhang X, Qian H, Zhu W, Sun X, Hu J, Zhou H Chew marY (2004) Mesenchymal stem cells from adult ebonein vitro row differentiate into a cardiomyocyte phenotyp Suc Exp Biol Med 229:623-631 Wat sigYavrapoulou MP, Yovos JG (2007) The role of the different inaling pathway in osteoblast commitment and ation, Hormones 6(4):279-294 OQ Springer PHU LUC VIII: KET QUA GHEP DIEU TRI MOT so BENH NHAN BENH LY BIEU MO GIAC MAC CO CAC Phân loại : Bệnh nhân chia làm nhóm dựa theo định ® - Nhóm I: ghép “tắm biểu mô” tạo thành từ tế bảo niêm mạc má ® - Nhóm 2: ghép “tam biểu mơ” tạo thành từ tế bảo gốc vùng rìa giác mạc Quy trình chọn lọc bệnh nhân: © Té bao géc ving ria giác mạc: lấy từ kết mạc rìa cực 4x2 mm o _ TẾ bào niêm mạc má: lấy từ niêm mạc má, đường kính mm © Mau đặt môi trường vận chuyên gửi đến Phịng thí nghiệm Vật liệu Sinh học, Bộ môn Mô - Phôi, Trường Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch thực qui trình ni cấy -_ -_ ©_ Bệnh nhân phẫu thuật ghép tắm biểu mô Bệnh nhân điều trị ngoại trú nằm viện Đánh giá: Đánh giá kết dựa khám bề mặt giác mạc, thị lực tân mạch giác mạc (tân mạch chia làm độ: độ tân mạch vùng rìa, độ tân mạch vào giác mạc 3mm, độ tân mạch vào toàn giác mạc, độ vào toàn giác mạc thành bó tân mạch) —_ Nhóm 1: Tam biểu mô tạo thành từ tế bào gốc vùng ria giác mạc 23 bệnh nhân (16 bệnh nhân mộng thịt tái phat, bệnh nhân bỏng kiềm, bệnh nhân Stevens Johnson,l bệnh nhân suy yếu tế bảo gốc chưa rỏ nguyên nhân I bệnh nhân bị ong chích) Thời gian theo dõi trung bình 6,34 tháng —_ Nhóm 2: Tắm biểu mơ từ tế bảo niêm mạc má nuôi cấy màng ối bệnh nhân (6 mắt) với hội chứng Stevens Johnson bệnh nhân bỏng hóa chất Tơng cộng mắt, thời gian theo dõi trung bình 18,4 tháng Kết quả: o Nhóm I: " Ghép tế bào gốc vùng rìa " Thời gian theo dõi trung bình 6.34 tháng *_ o Bề mặt nhãn cầu ôn định 22/23 ca Một ca bỉ nhiễm trùng sau mỗ 07 ngày bệnh nhân nhiễm HIV(nhiễm trùng sau điễu trị én) * Thi lue cải thiện lớn hang 20/23 ca (87%) " Tân mạch chưa phát triển 18/23 ca * DG 1: 3/23 ca, độ 2: 1/23 ca độ: 1/23 Nhom 2: * Ghép tế bào niêm mạc má Thời gian theo dõi trung bình 18,4 tháng Bề mặt nhãn câu ổn định 6/7 mắt Tân mạch độ I: 5/7 mắt, độ 2: 1⁄7 mắt, độ 3: 1⁄7 mắt Thị lực có cải thiện khơng qua | hang 60/60/1£ our 011 oz 60/9/97 01/1 | 60/60/41 | : tòa : WANYUL RAVE 99 PB 6006| =tr es , AL N3ARĐN NIAND: NOW 60///12 §c 6s | SENIANON | 60/†/FI 0t 23A ove 60/L/8T N| HNẠTH aT £I GO/VEOET g0 coreo | gị 60/VS¿8 09Ir6¿0 | 60/VS£ SI9E60 | z1 60/VS§E ogezeoo | 11 60/yepz 1414760 | 01 60/Y9§t 08991860 9S€L6880 ĩ 60/V66I 60/V0££ 60055960 60/V€£ 80/Vữ01 | £8££S80 r s 09971980 | 1587260 £ 60/VSF01 60/Vi£9 60/V108 N@ OS VW 4; Ls - 68978180 f 60/VS001 : “TANYML /880111£ I ‘ad A NJANDN ve ĐNYOH £8/06160 NIN> §d Na NGL OH :đ LN3AfON QOON.LNGANON | - +LA ‘DGHLNIAADN | WSNG 60/081 VÀ * 9Ị r9 WNtNG 6081| 01/01 0U1| 6| 60/01/Z1 | a d3H9 209 LW | 1yL >TWOG HNIG/ SNOWLVHd LW NOSHNOF aa f1L d-HĐ XIN ove WSNG| INFNG | 01/01 011 €L 2Äg/.LYHd giảng ïN|iyLrÖ@ONO NALN| “H.LJARLL.LNVML ove ĐZ| 60//0/€0 NUAILS / 509 OYE 3L 11A AqS Wz 60//SI 0, 01/9 LYHdIYL 81.44HĐ 205 ÁN |_ £'£Ô@G 9NÔW dN 60/8/11 99561 Aya IW HNIG/.LYHd 309 CORN | 60//S1 01/ 01/8 60/Z0/ET ow | 60/8/11 sang 209 ve SNOW dW LYHd Wz 01/01 WENG | NIJANDN Sẽ LYHdIYLWL WONG *O DNYNO LYHdlY Lt SNOW LW ws WENG 061/1 OL | ove os dw AN AVON 60/$0/Z1 iw “11 oF Ad 2OIML fon 61/9 | wr 60/10/20 & SNOW NYHD 80/71/70 61⁄6 | 309 owl 01/01 ALAFIA W9 YOH WN dW LYHd Y WZ NOSHNOF N3A3LS LỈHL Ld NVOG ANS IYL SNOW ly day We) a daHd dW 309 LW dgH9 0a 4a : 01/6 Ove a 01/6 01/8 : 60/P/SL 01/01 aL dgH9 LW 909 oe 299 60/S/11 60/UET 60//0/€£ = WS'ONG 505 ye 909 | OYf tLd3HĐ : 01/9 01/8 01/01 01// d3HO LW SO/ZV/T1 60/10/71 60/F£ | 60/E0/Z1 60/€0/71 60/10/6£LN 60/1/70 IYL SNOW @1d9HDLW | /NYDIWHNIG 01/ d3H9 LW 309 dW LW ove a 909 60//1£ ove daHd : or a 60/8/8) 60//1€ or 209 | NOSHNO F N3A31S /Y2 II HNIđ Nữ 60/8/0£ 061/01 01⁄6 60//0/10 IONUL tr LVHd IV z dW 6O/L/ZZ 209 fLL đ-HĐ dIV OW NYS NVO@ NVHD 60/9/11 01/01 01/01 ALVHd IVL ¢7 dW OG XÍHL NOW 01/01 TL dW Ad WS Lw 60///10 909 aLAyt 60//£C 909, J1 d1H2 90D OVE AL daHD NVHN HNad HOVS HNVG Lad | 60/1/60 | ee MIHLIT | 01/8 “0 D09N NVUL | 06482840 |_ sz 20Vt6E 6LS82080 | 97 soviss 80/249 eszeseo | cz S9IL9S'8O | 87 cz0gso sp | óc 60/VZ88I “Tew rey vO UaN days o6np “] OOON L NHAfÐN tedu quộg| + TIXVOASDNOG WD DAG dW 92 305 8L AY1LN 60/Z1/P1 NING | 206001 | 01/8 | tHLNG 01/10/0 | div asiv pH SNO.NGONOnYsWO| NVOT: 0U01| poe Ova) aLd9HS dW a * 2ÔĐN LNRAĐN | f ie tt O10 L8g | 8001/60| ¿0/60SE | - ¿0/6001| ov6| 2] ow P* 016 1Œ NĐ OäS : dị ove | wrina | SOOT) §0/01/E1 80/01/01 | d 80/86 | — 80/8E0 AGHS Ova | NOSHNO NHASLLS QL 909 dgHOdW | /NYDIWHNIG Wz NOSHOF N3A311S/ĐN/]HO pL 9E sz oorvertt trsslS80 | 91 60/V€§FI GOES) 60/Y1611 SOVEGIE | 60/V0SI ooisesor | 81 60/V6191 6061| 60/VS0£1 Solved | 81 NỘH | orosorso | tị : 'ŒAHLLĐNÝG | — ¿0/VtE tr 'MAN3ARĐN | ¿0/Vel9 zziszizo | ez : HANSARĐN Ạ |_ 60/VFS8I 698M | : 60/Y9SPI : | `LHNYHL NÝHd ¿09€E| Fz 4) So GÌ, Oe) 80/1021 | 0S | ow ake I£ 01/8 conouz | - ¿0/1021 ee Losi | 01/8 ier! er Se (1S | 60806 | sr | : ÒHNYHLNSANON | SE ovz| 608se|: or 2NYAv QA | : LAQHNGANON ovr | 60/8z| ss= f | à a sec" eae) TNYUL | 0U | 60016Z |[ eS | : AHNYHLNGANON Ạ | 001 01/1 | 601/90 | “LONG NIANON | 01/9 -10/4)| 0001 MENG ow 91 60/#1/r0 | ¿0/6/61 I 60/#1//0 /nY2INHNIGMNE| ee ¿0//0/01 | - ¿0/90/€Z L/ | 60/01/ZZ guagHoaw | oY |: óoamioNOD l: £ gu and HNỊdayLYHd Thế HO309 | AYOY IWIYLĐMÔïN in| 509 1YHd giagndw 1Y.L DNOW z aw 309 | yL€ÓGĐNÓNIVHd giagnodw : du | Sam NOG gy gg? /Y2IN HNỊd| : WD YOH WM dW 209 | ty ¢O@ DNOWLVHd araanoaw Y ate ROD 909 ova ayeD | NIING J3HĐ 1n | YOHĐNO8OdN9 018 | +Ld3 VOH OVIW.LM Law 309 ova NOSHOF a ae one NA31S/ĐN/HĐ | NSING | NEING | aoe Id WD O4S LW NOSHOF gi SH Ti NHA31S/ ĐN(IHO | ILING 1g8 | L d) Id WD VOH WX WZ LYHd Aer 309 nit F0 ấn, Y SƠ 0£ | 209 |_ NOSHNOF N3A31S OME) owe ows | 60/6/8 ove 01 # 0U tia | NE0NGÌ uM 0Ư01 0Ï sooweo | 60/01 ra} 60/68) 488] Lư 60/01/Z1 0/0 Bối 601/z0| 0U01| ove] oy 60/£1/01 BÍ, 9I[ 60/6E| ow1 Ou9 |" 61/91 | 60/01/80 60/11/ 60/01/ 6c | ava