Nghiên cứu ứng dụng tế bào sừng tự thân qua nuôi cấy điều trị bỏng sâu ở trẻ em

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y KHOA PHẠM NGỌC THẠCH BÁO CÁO NGHIỆM THU TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG TẾ BÀO SỪNG TỰ THÂN QUA NUÔI CẤY ĐIỀU TRỊ BỎNG SÂU Ở TRẺ EM ĐỒNG CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: PGS.TS.BS TRẦN CÔNG TOẠI ThS.BS NGUYỄN BẢO TƯỜNG THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 07/ 2015 TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Tại Việt Nam, chưa có ứng dụng sử dụng liệu pháp tế bào gốc nghiên cứu điều trị vết thương da công bố Những bệnh nhân bỏng sâu diện tích 60% diện tích thể tử vong thiếu hụt nguồn da tự thân che phủ vĩnh viễn Trong đó, việc vận chuyển bệnh nhân bỏng nặng đến trung tâm bỏng có nuôi cấy tế bào sừng giới để điều trị không khả thi tốn Trong nghiên cứu này, tiến hành nghiên cứu quy trình ni cấy tế bào sừng người màng ối ứng dụng ghép tự thân để điều trị tổn thương da Với mục tiêu sau: Xây dựng qui trình phân lập, ni cấy tạo tế bào sừng cho ghép tự thân; Xây dựng qui trình điều trị bỏng tổn thương da kết hợp liệu pháp ghép tế bào sừng tự thân sau nuôi cấy Kết từ nghiên cứu thành cơng việc xây dựng quy trình “Ni cấy tế bào sừng nguyên bào sợi để ghép lại tự thân cho bệnh nhân” giải vấn đề thiếu da thực cho chất lượng sẹo tốt Nhận định kết nghiên cứu cho thấy: quy trình ni cấy, ghép da địi hỏi phải thực nghiêm ngặt thời gian Đôi phải chấp nhận hao tổn tỷ lệ ghép dính chưa cao  cần nghiên cứu cải tiến kỹ thuật Ngồi ra, q trình nghiên cứu cịn gặp phải khó khăn việc đánh giá kết ghép da  cần nghiên cứu cải tiến quy trình SUMMARY OF RESEARCH CONTENT In Vietnam, there are currently no clinical applications using stem cell therapy for study and treatment of loss of skin lesions Patients with deep burns over 60% of the area of the body are dying because of lack of self-covered skin Meanwhile, move the patient to the treatment center with cultured keratinocytes in the world for the treatment is not feasible and very expensive In this study, we investigated the process to cultured human keratinocytes on the membranes to treat the loss of skin lesions With the following objectives: Develop processes isolated, cultured and create keratinocyte sheet to aulogous transplantation; Develop procedures for the treatment of burns and loss of skin lesions combined autologous keratinocyte transplantation after cultured Results from the study, we succeeded in establishing processes "A culture of keratinocytes and fibroblasts to transplant the patient's self to" solve the shortage of skin grafting can be performed and the quality is pretty good scar Commenting on the results of the study showed that the cell culture process, perform skin grafts require strict guarantees on time Sometimes acceptable loss rate due to graft skin adhesive is not high  need to study technical innovations In addition, the research process is still some difficulties suffered in the evaluation of skin grafts need to study process improvement I MỤC LỤC Trang 2.1 2.2 3.1 3.2 3.3 1.1 1.2 1.3 1.3.1 1.3.2 1.4 1.4.1 1.4.2 1.4.3 Tóm tắt đề tài/dự án (gồm tiếng Việt tiếng Anh) Mục lục Danh sách chữ viết tắt Danh sách bảng Danh sách hình I II VI VII VIII PHẦN MỞ ĐẦU (– 3) Tên đề tài/dự án: Nghiên cứu ứng dụng tế bào sừng tự thân qua nuôi cấy điều trị bỏng sâu trẻ em Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS BS Trần Công Toại – Ths.BS Nguyễn Bảo Tường Cơ quan chủ trì: Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch Thời gian thực hiện: 2009 - 2014 Kinh phí duyệt: 800.000.000 đồng Kinh phí cấp đợt 1: 500.000.000đ theo TB số:309/TB-SKHCN ngày 23/12/2009 Kinh phí cấp đợt 2: 220.000.000đ theo TB số:68/TB-SKHCN ngày 14/06/2013 Mục tiêu Xây dựng qui trình phân lập, ni cấy tạo tế bào sừng dùng cho ghép tự thân Xây dựng qui trình điều trị bỏng kết hợp liệu pháp ghép tế bào sừng tự thân sau nuôi cấy Sản phẩm đề tài Tấm tế bào sừng Qui trình phân lập, ni cấy tạo tế bào sừng Qui trình ghép tế bào sừng tự thân sau nuôi cấy điều trị bỏng sâu trẻ em CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tình hình nghiên cứu ngồi nước Tình hình nghiên cứu nước Màng ối người Cấu tạo màng ối người Một số ứng dụng màng ối Đặc điểm sinh học tế bào sừng Đặc điểm tế bào sừng Tế bào gốc biểu bì Vai trị tế bào sừng tái tạo biểu bì da 2 2 2 4 7 12 12 14 17 II 1.5 1.6 1.7 2.1 2.2 2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.2.4 2.2.5 2.2.6 2.3 2.4 2.4.1 2.4.2 2.4.3 2.4.4 2.4.5 2.4.6 2.4.7 2.5 2.5.1 2.5.2 2.5.2.1 2.5.2.2 2.5.3 2.6 2.6.1 2.6.2 2.6.3 Ghép tự thân biểu bì ni cấy (CEA-Culture Epidermal Autograft) Một số giới hạn sử dụng tế bào biểu bì ni cấy biện pháp khắc phục Ghép tế bào sừng để điều trị bệnh nhân bỏng 19 CHƯƠNG II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nội dung 1: phương pháp thu nhận xử lý HAM thành màng collagen Cơ sở khoa học Phương pháp thực Tiêu chuẩn chọn mẫu Tiêu chuẩn loại trừ Phương pháp thu nhận mẫu màng ối Phương pháp loại tế bào biểu mô màng ối Phương pháp trải màng collagen đĩa ni Phương pháp đánh giá hoạt tính màng collagen Nội dung 2: Phân lập, nuôi cấy tạo tế bào sừng Cơ sở khoa học Phương pháp thực Tiêu chuẩn chọn mẫu da Tiêu chuẩn loại trừ Phương pháp thu nhận mẫu da Phương pháp phân lập tế bào Phương pháp nuôi tế bào sừng Phương pháp cấy chuyền tế bào sừng Phương pháp đánh giá tăng sinh tế bào đĩa nuôi lần cấy chuyền thứ Phương pháp tạo nhiều lớp tế bào sừng Phương pháp nuôi tế bào sừng màng collagen Phương pháp tạo nhiều lớp tế bào sừng Phương pháp tạo nhiều lớp tế bào sừng cách nâng lên bề mặt khơng khí (Airlifting) Phương pháp tạo nhiều lớp tế bào sừng tăng nồng độ Ca2+ môi trường nuôi Phương pháp đánh giá hiệu tạo lớp tế bào Phương pháp đánh giá nhiều lớp tế bào sừng Đánh giá bám dính tế bào Đánh giá tính tồn vẹn tế bào sau nuôi cấy Phương pháp nhận diện tế bào sừng RT-PCR 24 24 22 23 24 24 24 24 24 25 26 26 27 27 28 28 28 28 29 29 29 30 30 30 31 31 32 31 32 32 32 33 III 2.7 2.8 2.9 2.10 2.11 3.1 3.1.1 3.1.2 3.1.3 3.2 3.3 3.4 3.4.1 3.4.2 3.4.3 3.5 3.5.1 3.5.2 3.5.3 3.5.4 3.6 3.6.1 3.6.2 3.6.3 3.6.4 3.6.5 3.7 3.8 Nội dung 3: ghép tự thân tế bào sừng nhiều lớp bệnh nhân Quy trình ni cấy tế bào sừng – ghép da Quy trình chuẩn bị cho ghép da Nghiên cứu thử nghiệm Vấn đề y đức Xử lý số liệu 34 CHƯƠNG III: KẾT QỦA VÀ BÀN LUẬN Nội dung 1: Nghiên cứu phương pháp tạo màng collagen từ màng ối ứng dụng làm giá thể nuôi cấy tế bào sừng Kết tạo màng collagen Kết đánh giá hoạt tính màng collagen Kết đánh giá độ an toàn màng collagen Kết khảo sát ảnh hưởng màng collagen đến pH môi trường nuôi tế bào sừng 37 37 Nội dung 2: Nghiên cứu phương pháp tạo tế bào sừng ứng dụng ghép tự thân Kết phân lập, nuôi cấy nhân khối tế bào sừng từ mô da Kết nhân khối tế bào sừng Kết tạo tế bào sừng nhiều lớp Kết nuôi tế bào sừng màng collagen Kết tạo tế bào sừng nhiều lớp cách nâng lên bề mặt khơng khí (Airlifting) Kết nhuộm hóa mơ miễn dịch tế bào sừng nhiều lớp Kết đánh giá tế bào sừng nhiều lớp Kết bám dính tế bào Kết đánh giá tính tồn vẹn tế bào sau nuôi cấy Kết đánh giá yếu tố đánh dấu (marker) tế bào RT-PCR Kết đánh giá nhiễm vi khuẩn nấm sản phẩm tế bào nuôi cấy Nội dung 3: Báo cáo sơ trường hợp nuôi cấy da thực Đặc điểm mẫu nghiên cứu mẫu chứng Bỏng nhiệt Bỏng độ III Diện tích từ 10% trở lên Những tiêu chuẩn loại trừ Nhóm chứng lịch sử Nhu cầu ghép da Thời điểm thực thu nhận ghép mẫu 43 35 35 36 36 36 37 39 39 40 44 46 51 51 53 54 55 55 56 57 58 60 60 60 60 60 60 61 62 63 IV 3.9 3.10 3.11 3.12 3.13 3.14 3.15 3.16 3.17 4.1 4.2 4.3 Đáp ứng mẫu da nuôi cấy Diện tích mẫu da thu nhận Thời điểm tiến hành ghép mẫu da nghiên cứu Một số vấn đề kỹ thuật tiến hành ghép mẫu Gây kích ứng Tỉ lệ bám dính Nhiễm trùng Một số tiêu chí đánh giá khác Nhận xét quy trình điều trị 63 63 64 65 65 65 66 67 68 Chương IV: Kết luận 69 Chương V: Kết minh họa số ca ghép tế bào sừng tự thân qua nuôi cấy bệnh nhân 70 Trường hợp Trường hợp Trường hợp 70 72 74 Báo cáo sơ 12 ca ghép thực ghép tế bào sừng tự thân theo quy trình chuẩn hóa 76 TÀI LIỆU THAM KHẢO 86 PHỤ LỤC V DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT µ AGM BMP CEA DMEM DMSO DNA DT ECM EDTA HBV HG HIV IMDM L LG M M N OC PBSA pHEMA PIAAm PPS RNA RT SDS SEM SFM SNV TBG TBS TEM U THUẬT NGỮ TIẾNG VIẾT Micro Động mạch chủ-tuyến sinh dục-trung thận Bone morphogenetic protein Cultured Epidermal Autograft Dulbecco’smodified Eagle’s medium Dimethyl Sulphoxide Deoxyribonucleic acid Diện tích Extracellular Matrix Ethylenediaminetetraacetic acid Virus DNA thuộc họ Hepadnaviridae High glucose Human Immunodeficiency Virus Iscove’smodified Dulbecco’smedium Lít Low glucose Mol/lit Mili Ngày Osteocalcin Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Poly(2-HydroxyEthyl Methacrylate N-Isopropylacryacryamide Plasma Polymerised functional Surface Ribonucleic Acid Reverse transcription Sodium Dodecyl sulphate Scanning Electron Microscopy Serum Free Medium Số nhập viện Tế bào gốc Tế bào sừng Transmission Electron Microscopy Unit VI DANH MỤC CÁC BẢNG SỐ 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 TÊN BẢNG SỐ LIỆU Kết kiểm nghiệm màng collagen Kết khảo sát ảnh hưởng màng collagen đến thay đổi pH môi trường SFM Thông tin mẫu da thu nhận Số tế bào sống % tế bào sống sau phân lập So sánh số đặc điểm mẫu nghiên cứu mẫu chứng Một số đặc điểm mẫu nghiên cứu thực ghép Các số (trung bình) quan tâm theo dõi đánh giá TRANG 39 40 43 45 61 62 66 VII DANH SÁCH HÌNH TÊN HÌNH ẢNH SỐ TRANG 1.1 Màng ối bọc quanh thai nhi 1.2 Sơ đồ mô tả cấu trúc màng ối 1.3 Ứng dụng màng ối để điều trị bỏng trẻ em 11 1.4 Sử dụng màng ối điều trị bỏng 11 1.5 Hiệu điều trị bỏng màng ối 12 1.6 Các lớp tế bào sừng biểu bì 13 1.7 Tế bào gốc biểu bì vùng sâu da 14 1.8 Các dạng tế bào q trình biệt hóa tế bào gốc biểu bì 15 1.9 Các marker tế bào sừng tương ứng chương trình biệt hóa 16 biểu bì 1.10 Sự phân bố p63 (đỏ) involucrin (xanh) biểu bì 16 người bình thường 1.11 Protein wnt hoạt hóa tế bào gốc biểu bì (EpSC) bất hoạt 17 thành tế bào khuếch đại chuyển (TA) 1.12 Các tế bào sừng lan làm liền vết thương 18 1.13 Chỉ định CEA 20 1.14 Mơ hình minh họa bước CEA 20 2.15 Quy trình xử lý màng ối 26 2.16 Thu nhận mẫu da thí nghiệm 28 2.17 Minh họa phương pháp nuôi cấy tế bào đĩa lồng 31 3.18 Lớp tế bào biểu mô nguyên vẹn màng ối (nhuộm 37 Giemsa, 40X) 3.19 Tạo màng collagen từ màng ối người 37 3.20 Ảnh chụp SEM màng collagen 38 3.21 Ảnh nhuộm mô học màng collagen 38 VIII 3.22 Tách tế bào sừng khỏi phần trung bì 44 3.23 Ảnh nhuộm mơ học phần biểu bì trung bì sau tách 45 enzyme 3.24 Kết nuôi cấy tế bào sừng in vitro 47 3.25 So sánh tế bào sừng nuôi đĩa nuôi màng collagen 51 3.26 Tế bào sừng tăng sinh tạo lớp đơn màng collagen 52 3.27 Kết tạo tế bào sừng 53 3.28 Kết nhuộm hóa mơ miễn dịch cho tế bào sừng 54 3.29 Xác định mối liên kết tế bào màng collagen 55 3.30 Xác định mối liên kết tế bào tế bào 55 3.31 Bộ nhiễm sắc thể đồ tế bào người nữ sau nuôi cấy 56 3.32 Bộ nhiễm sắc thể đồ tế bào người nam sau nuôi cấy 56 3.33 Kết thực RT-PCR để xác định diện tế 57 bào sừng 4.34 Thu nhận mẫu da dùng để nuôi tế bào 70 4.35 Tiến hành ghép mẫu cho bệnh nhân 70 4.36 Kết sau ghép 71 4.37 Tiến hành thu nhận mẫu 72 4.38 Tiến hành thu nhận mẫu lần 72 4.39 Tiến hành ghép tế bào nuôi cấy 73 4.40 Tiến hành ghép da mỏng 73 4.41 Tiến hành thu nhận mẫu 74 4.42 Chuẩn bị ghép da 74 4.43 Thực ghép theo dõi trình điều trị 75 4.44 Bệnh nhân tái khám thời điểm tháng sau trình 75 điều trị IX PHỤ LỤC IV: THUYẾT MINH ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU PHỤ LỤC V: QUY TRÌNH TẠO TẤM TẾ BÀO SỪNG Cơ sở khoa học Tế bào sừng chiếm 90% tổng số tế bào lớp biểu bì da Tế bào gốc biểu bì dạng tế bào sừng có tính gốc, chúng có khả tự đổi khơng có giới hạn tạo tế bào có khả biệt hóa cuối Lớp đáy biểu bì có 10% tế bào gốc biểu bì (epidermal stem cell), 50% tế bào khuếch đại chuyển thời điểm giao thời sinh trưởng (transient amplifying cell), 40% tế bào hậu kỳ gián phân (postmitotic cell) Sau nuôi cấy phịng thí nghiệm, tế bào sừng ghép lên thể bệnh nhân Có hai dạng tự ghép tế bào sừng nuôi cấy dạng huyền phù Hai dạng phân biệt dựa vào phương pháp thu hoạch, xử lý ứng dụng tế bào lên vết thương Trong phương pháp huyền phù, tế bào thu hoạch xử lý suốt trình tái cấu trúc vết thương bệnh nhân Các tế bào đưa vào vết thương dung dịch (môi trường fibrin) cách sử dụng bình phun Dung dịch thường bao gồm tế bào sừng bản, tế bào hắc sắc tố, nguyên bào sợi với tỷ lệ không ổn định Tuy nhiên, có vấn đề sinh học tế bào phương pháp ghép cần quan tâm Các tế bào sừng ổn định dung dịch thời gian ngắn trước bắt đầu chịu biệt hóa cuối Watt cs mơ tả thay đổi nhanh chóng (trong vịng giờ) biểu integrin tế bào sừng đặt huyền phù Do đó, vấn đề khó khăn phải dự trữ vận chuyển tế bào sừng huyền phù với thời gian ngắn Ngoài ra, bác sĩ phẫu thuật y tá chăm sóc vết thương cần phải học kỹ thuật phun tế bào cho khắp vết thương Đối với vết thương rộng, thử thách Trong phương pháp tạo tấm, tế bào nuôi cấy – tuần sau lấy da sau ứng dụng ghép vào vết thương Các tế bào chuyển lên màng để giảm thời gian thao tác phịng thí nghiệm Tuy nhiên, tế bào sừng nuôi cấy thường gồm 3-5 lớp tế bào khó cầm giữ Do đó, cần có cơng cụ để thao tác tế bào Tỷ lệ dung nạp mảnh ghép thay đổi lớn, từ 0% đến 80% người trưởng thành 50% trẻ em Có số lý để giải thích tỷ lệ dung nạp mảnh ghép bị thay đổi Một giả thiết tin tưởng cấu trúc bất thường tơ neo điều kiện nuôi cấy xử lý enzyme để tách khỏi chai nuôi trước ghép Để khắc phục vấn đề này, số vật liệu sử dụng để mang tế bào sừng màng collagen loại bò, pHEMA (poly(2-hydroxyethyl methacrylate)), PIAAm (N-Isopropylacryamide), PPS (plasma polymerised functional surface) Màng màng ối có cấu trúc giống màng da nên vật liệu lý tưởng để mang tế bào sừng Tấm tế bào sừng nuôi cấy gồm nhiều tầng tế bào tạo in vitro Phương pháp tạo tế bào sừng nuôi cấy gồm giai đoạn sau: (i) thu nhận mô da; (ii) phân lập nuôi cấy để tăng sinh tế bào sừng từ mô da; (iii) tạo nhiều tầng tế bào sừng Vật liệu – hóa chất Hố chất: - Dung dịch PBS ( không chứa ion Ca2+ Mg2+ ), PBS 10X, pha loãng với nuớc cất 10 lần để đuợc PBS 1X, hấp vô trùng 1210C, 1atm 20 phút; bảo quản nhiệt độ phòng - Dung dịch Trypsin 2.5% pha loãng với nước cất 10 lần để đuợc Tryspsin 0.25% Lọc vô trùng màng lọc 0.2um Bảo quản 40C - Dung dịch EDTA 0.02% Lọc vô trùng màng lọc 0.2um Bảo quản 40C - Kháng sinh : Penilline/Streptomycine 200X Lọc vô trùng màng lọc 0.2um Bảo quản 40C - Ding dịch HEPES 1M, bảo quản 40C - Huyết bào thai bò(FBS) Bảo quản -200C - Yếu tố tăng trưởng EGF Bảo quản -200C - Độc tố vi khuẩn tả (Cholera Toxin) Bảo quản -200C - Dung dịch Hydeocortisone Bảo quản -200C - Trypan blue 0.4% - Cồn 700 - Povidine - Môi trường nuôi sơ cấp PCM Lọc vô trùng màng lọc 0.2um, bảo quản 40C - Thành phần gồm: Hoá chất Nồng độ HEPES 20Mm FBS 20% EGF 10ng/ml Hydrocortisone 0.4ng/ml Cholera Toxin 10-9M Penicilline 100U/ml Streptimycine 100ug/ml - Dung dịch Defined Keratinocytes 1X, SFM Dụng cụ: - Kẹp cong thẳng - Kéo cong thẳng - Cán dao phẫu thuật No 22 - Luỡi dao phẫu thuật No - Găng tay phẫu thụât vô trùng - Găng tay - Đĩa petri thuỷ tinh đường kính 10cm, 4cm - Đĩa ni tế bào giếng - Đĩa nuôi cấy upcell 10cm - Đĩa insert 0.4um - Chai nuôi tế bào 25cm2 - Pipetteman (1-10ul, 10-100ul, 100-1000ul, 1-10ml) - Ống ly tâm 15ml - Màng lọc 0.2um - Buồng đếm Naubauer cải tiến - Lame, lamelle - Becher 50, 100, 250ml - Bình xịt cồn - Gịn thấm - Đầu tip 100ul, 1000ul, 10ml - Eppendorf - Màng parafilm - Bơm tiêm 10ml - Pipette pasteur thủy tinh - Khẩu trang Quy trình tạo tế bào sừng người mơi trường không huyết thanh: - Mẫu da thu nhận DPBS – kháng sinh Sau vận chuyển phòng thí nghiệm tiến hành thao tác - Đo diện tích mẫu da thước đo vơ trùng - Rửa mẫu da với Povidine 10% phút Vì mẫu da lấy từ bệnh nhân bị bỏng nên khả nhiễm khuẩn cao Việc rửa Povidine giúp ngăn ngừa nhiễm khuẩn - Rửa mẫu da lại DPBS lần, loại bỏ lơng, mỡ, phần lớp trung bì - Cắt thành mảnh nhỏ 1x1 cm Sử dụng lamen tiệt trùng để đè lên mảnh da Việc sử dụng lamen làm giảm tối đa mảnh da bị lại trình ủ trypsin-EDTA thời gian ủ giảm nhiều - Ủ trypsin 0,25% - EDTA 0,02% (tỷ lệ - 4) 15 giờ, 4oC - Tách rời lớp biểu bì lớp trung bì Dùng phương pháp cạo học để tách tế bào sừng khỏi mảnh trung bì - Dùng môi trường nuôi sơ cấp để huyền phù thu nhận tế bào sừng rời - Tiến hành đếm tế bào phương pháp nhuộm trypan blue Tính tốn số lượng tế bào cho diện tích mẫu thu sau ni cấy gấp 20 lần diện tích ban đầu - Cấy tế bào lên màng collagen trải đĩa lồng với mật độ tối thiểu 104 tế bào/cm2 - Nuôi tế bào môi trường sơ cấp 37oC, 5% CO2 - Sau ngày nuôi cấy, thay môi trường sơ cấp môi trường không huyết - Thay mơi trường bên bên ngồi đĩa lồng ngày/lần - Sau 10 ngày tế bào đạt lớp đơn màng collagen - Nâng lên bề mặt khơng khí: hút hết mơi trường đĩa lồng - Thay mơi trường bên ngồi đĩa lồng ngày, kéo dài ngày Như vậy: Việc sử dụng lamen trình ủ mẫu da việc cấy trực tiếp tế bào sừng lên màng collagen giúp giảm thời gian nuôi cấy từ 21 ngày xuống 15 ngày nhằm đáp ứng nhu cầu ghép nhanh cho bệnh nhân bị bỏng Diện tích tế bào sừng sau nuôi cấy tăng 20 lần so với mảnh da thu nhận ban đầu từ bệnh nhân Đánh giá kết quả: Sau 15ngày ni cấy đánh giá hình ảnh mơ học bám dính phát triển tế bào sừng màng ối  Nhuộm HE: mẫu duơng tính tế bào hình đa diện có bào tương bắt màu hồng, nhân bắt màu tím đậm, màng ối bắt màu hồng đồng  Nhuộm p63:mẫu dương tính tế bào hình đa diện có bào tuơng bắt màu nâu, nhân tế bào bắt màu xanh dương  Quan sát hình ảnh mối liên kết tế bào – tế bào, tế bào – màng collagen kỹ thuật chụp TEM, SEM Kết luận: Với quy trình trên, sau 15 ngày nuôi trực tiếp tế bào sừng màng ối đĩa lồng, tạo đuợc tế bào sừng màng ối Bỏ qua giai đoạn cấy chuyền từ giai đoạn sơ cấp lên F1 F2 chai nuôi, bỏ qua giai đoạn chuyển tế bảo chai nuôi 25cm2 sang đĩa lồng Đồng thời giảm tỷ lệ nhiễm giai đoạn nuôi tế bào cấy chuyền Trong số 14 truờng hợp lấy da tự thân để ghép da, theo báo cáo có trường hợp ghép da thành công chiếm tỷ lệ 28%, truờng hợp lại da tự lành truớc ghép số có tình trạng nhiễm trùng nặng truớc tiến hành ghép da nên khó đánh giá q trình ghép QUI TRÌNH GHÉP TẾ BÀO SỪNG TỰ THÂN SAU NUÔI CẤY TRONG ĐIỀU TRỊ BỎNG SÂU Ở TRẺ EM Cơ sở khoa học Tác nhân gây nhiệt (nhiệt khô nhiệt ướt) Chúng không thực nghiên cứu cháu điện hố chất tác nhân không thường gặp tổn thương mang số đặc tính riêng Bệnh nhi bị nguyên nhân nhiệt khô ( lửa, pô xe, bàn ủi …) nhiệt ướt ( nước sôi thức ăn lỏng, nóng nước nấu mì …) Bệnh nhi nhập Khoa 24 đầu sau tai nạn Tiêu chí đưa nhằm loại bỏ trường hợp điều trị sở y tế khác, có khả mắc nhiễm trùng bệnh viện, ảnh hưởng đến kết nghiên cứu Diện tích sâu khoảng 10 – 40% Đây nhóm dân số mà nghiên cứu mong muốn tác động Với tổn thương có diện tích nhỏ 10%, khả lành thương tốt với phương pháp ghép da dày mỏng thơng thường; sẹo ảnh hưởng đến chức thẩm mỹ Với trường hợp sâu, diện rộng, khả nhiễm trùng tử vong cao, việc điều trị thành công không dựa vào ghép da sớm Nghiên cứu bắt đầu việc thu thập mẫu da, tiến hành sau bệnh nhân qua khỏi giai đoạn điều trị sốc Chúng tiến hành cắt lọc mô hoại tử lấy mẫu gửi nuôi cấy da Phẫu thuật tiến hành Phịng mổ, gây mê tồn thân Việc tiến hành Phịng mổ bệnh nhân cần phương tiện theo dõi hồi sức tích cực vừa trải qua sốc Hơn nữa, Phòng mổ, gây mê, chúng tơi đánh giá tổn thương toàn diện tiến hành sát khuẩn tốt, tránh làm nhiễm mẫu nuôi cấy xảy giai đoạn nghiên cứu thử Trong lần phẫu thuật cắt lọc mô hoại tử, bệnh nhân cắt lọc 15 % diện tích thể để bảo đảm hồi sức an tồn Mẫu da ni cấy lấy x 10 cm, dao Watson, theo kiểu lấy da mỏng ( thượng bì nửa lớp trung bì), đựng lọ vơ khuẩn, với dung dịch bảo quản chuyển cho labo vòng Bệnh nhân tiếp tục hồi sức, giảm đau điều trị kháng sinh khoa Phỏng Vết thay băng kem Sulfadiazine 1% đánh giá tình trạng nhiễm trùng Những lần cắt lọc sau thường lên lịch cách tuần xếp cho trùng với chu kỳ nuôi cấy da Vị trí cắt lọc tính tốn cho việc ghép da thuận lợi Tấm tế bào sừng tạo theo quy trình thiết lập phụ lục I, Tấm tế bào sừng tạo từ màng collagen có nguồn gốc từ màng ối người sau xử lý, khử trùng đảm bảo an toàn theo tiêu chuẩn ghép mơ Tế bào sừng lấy từ nguồn da bệnh nhân bỏng Sau trải qua trình phân lập, nuôi cấy nhân khối tiến hành nuôi cấy màng collagen Sau khoảng thời gian nuôi cấy tiến hành tạo tế bào kỹ thuật airlifting để tạo nhiều lớp tế bào sừng (mô lai trình sinh lý cấu trúc biểu mô da) Sau tế bào sừng tạo phịng thí nghiệm, tế bào sừng nhiều lớp giữ thùng có chứa đá gel 2oC – 8oC chuyển nhanh đến bệnh viện để tiến hành phẫu thuật ghép cho bệnh nhân theo quy trình sau Vật liệu – Hóa chất - Dung dịch PBS ( không chứa ion Ca2+ Mg2+ ), PBS 10X, pha loãng với nuớc cất 10 lần để đuợc PBS 1X, hấp vô trùng 1210C, 1atm 20 phút; bảo quản nhiệt độ phòng - Dung dịch Trypsin 2.5% pha loãng với nước cất 10 lần để đuợc Tryspsin 0.25% Lọc vô trùng màng lọc 0.2um Bảo quản 40C - Dung dịch EDTA 0.02% Lọc vô trùng màng lọc 0.2um Bảo quản 40C - Kháng sinh : Penilline/Streptomycine 200X Lọc vô trùng màng lọc 0.2um Bảo quản 40C - Ding dịch HEPES 1M, bảo quản 40C - Huyết bào thai bò(FBS) Bảo quản -200C - Yếu tố tăng trưởng EGF Bảo quản -200C - Độc tố vi khuẩn tả (Cholera Toxin) Bảo quản -200C - Dung dịch Hydeocortisone Bảo quản -200C - Trypan blue 0.4% - Cồn 700 - Povidine - Môi trường nuôi sơ cấp PCM Lọc vô trùng màng lọc 0.2um, bảo quản 40C - Dung dịch Defined Keratinocytes 1X, SFM Dụng cụ: - Kẹp cong thẳng - Kéo cong thẳng - Cán dao phẫu thuật No 22 - Luỡi dao phẫu thuật No - Găng tay phẫu thụât vô trùng - Găng tay - Đĩa petri thuỷ tinh đường kính 10cm, 4cm - Đĩa ni tế bào giếng - Đĩa nuôi cấy upcell 10cm - Đĩa insert 0.4um - Chai nuôi tế bào 25cm2 - Pipetteman (1-10ul, 10-100ul, 100-1000ul, 1-10ml) - Ống ly tâm 15ml - Màng lọc 0.2um - Buồng đếm Naubauer cải tiến - Lame, lamelle - Becher 50, 100, 250ml - Bình xịt cồn - Gòn thấm - Đầu tip 100ul, 1000ul, 10ml - Eppendorf - Màng parafilm - Bơm tiêm 10ml - Pipette pasteur thủy tinh - Khẩu trang Quy trình thực ghép tế bào sừng bệnh nhi bỏng sâu: - Phẫu thuật ghép da thực theo chu trình ni cấy da Nếu lý mà khơng thực dự tính thời gian hỗn lại khơng q ngày - Phẫu thuật tiến hành Phòng mổ, gây mê toàn thân - Sát khuẩn quy trình Thực đặt da ni cấy với quy trình - Băng ép nhẹ vùng ghép da với gạc khơng dính Urgotul băng thun - Chỗ ghép da giữ yên ngày, sau thay băng với gạc khơng dính - Da ni cấy ghép đánh giá sau tuần ( tức tuần sau ghép) - Nếu diện tích rộng lần cắt lọc – lấy mẫu da cắt lọc – ghép da nuôi cấy bố trí cách tuần đóng kín vết thương Đánh giá kết ghép: - Số lần phẫu thuật tính số lần phẫu thuật để ghép da, da nuôi cấy và/hoặc da mỏng tự thân - Tái khám theo lịch hẹn Đánh giá da ghép sau ghép da tháng năm theo tiêu chí phù hợp đề cập PHỤ LỤC VI: MỘT SỐ BÀI BÁO KHOA HỌC ĐÃ ĐĂNG TẠP CHÍ TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC PHỤ LỤC VII: DANH SÁCH BỆNH NHÂN ĐÃ THỰC HIỆN NGHIÊN CỨU NHÓM NGHIÊN CỨU STT 10 11 12 Số hồ sơ 306843/13 364613/13 416885/13 416888/13 424277/13 452898/13 578988/13 590333/13 483989/13 51398/13 120959/14 126394/14 Họ tên bệnh nhân Đoàn Thị Kim N Lương Đoan T Lê Thị Diễm T Phan Như Y Triệu Văn L Lê Thuý A Hoàng Nguyễn Thái D Vũ Hoàng Gia H Trần Minh N Nguyễn Ngọc Phương T Trinh Huy M A N Giới Nữ Nữ Nữ Nữ Nam Nữ Nam Nam Nam Nữ Nam Nam Ngày sinh 25/10/11 10/04/11 01/01/11 20/11/12 01/01/11 18/08/10 15/04/10 05/05/08 01/01/03 20/05/11 13/01/13 20/08/08 Ngày nhập viện 14/07/13 14/08/13 17/09/13 17/09/13 21/09/13 04/10/13 24/12/13 22/12/13 01/01/14 05/01/14 16/03/14 20/03/14 NHÓM CHỨNG ST T 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Số bệnh án 575919/11 639189/12 1540/12 359758/12 25648/12 363200/12 96356/12 26532/12 115866/13 276150/13 186943/13 136519/12 51903/12 623940/12 314026/12 337447/12 55387/13 43469/12 222803/12 Họ QUAN MANH NGUYEN VAN VU DAO HOANG LE THI NGOC CAO VAN THANH TA MINH SINH NGOC TUYET NGUYEN TRUONG DUONG QUY BUI CHI TRAN NGOC NHU NGUYEN HOANG DOAN BA DANG HOANG THAI NGUYEN CONG VI THANH THAN TRI DIEU THI CAM VU HOANG GIA Tên D K S N T T N P N K Y M P L H L C U N Giới Nam Nam Nam Nữ Nam Nam Nữ Nam Nam Nam Nữ Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nữ Nam Ngày sinh 04/08/2011 5/12/2011 01/01/2008 04/10/2008 05/21/2006 02/28/2010 04/14/2010 09/26/2009 07/28/2010 08/27/2007 10/20/2011 03/22/2010 09/16/2009 04/28/2010 02/17/2011 01/01/2009 10/20/2004 12/15/2009 08/18/2011 Ngày vào viện 01/01/2012 01/02/2013 01/08/2012 08/06/2012 01/23/2012 08/04/2012 03/09/2012 01/24/2012 03/24/2013 06/25/2013 05/10/2013 03/30/2012 02/11/2012 06/11/2013 07/08/2012 07/23/2012 02/09/2013 02/07/2012 05/24/2012 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 14522/13 19360/12 24789/12 184128/12 342873/12 27843/12 81367/13 5690/12 489548/12 51780/12 183596/12 11152/12 407/13 59932/12 263728/12 176548/12 236770/12 395313/12 39532/13 43520/13 9971/12 182649/13 49337/13 38603/13 37165/13 422728/12 242567/12 75394/12 12531/12 49 50 51 52 53 54 80309/13 73237/13 171707/13 158830/13 31623/12 142975/13 TRAN ANH NGUYEN THI THUY NGUYEN PHUONG NGUYEN THI YEN TRAN VAN LUONG MINH HOANG MONG YEN TRAN NGUYEN THANH TRUONG TRONG NGUYEN NGOC KHANH TRAN MONG DO NGUYEN TRUC PHAN THI KIM LUU VAN TRAN QUOC PHAM NGOC QUANG NGUYEN MINH VO THI NGOC VO HOANG TRAN THI HONG NGUYEN HAU NGUYEN NHU LAU DUC PHAM KHAI VAN THIEN NGAN MY TRAN NGUYEN TIEN HO THANH NGUYEN THI NGUYEN HUYNH TUONG NGUYEN THI NGOC HUYNH TAN TRAN THI PHUONG NGUYEN VAN DUC MAI LE TUONG T N T C L T N Q T L T H N T H M N T A D T Y P H B L D V T Nam Nữ Nữ Nữ Nam Nam Nữ Nam Nam Nữ Nữ Nữ Nữ Nam Nam Nam Nam Nữ Nam nu Nam Nữ Nam Nam Nam nu Nam Nữ Nữ 07/11/2008 08/14/2010 10/21/2009 09/23/2008 01/03/2009 02/25/2010 09/28/2011 06/01/2009 11/12/2007 08/15/2007 09/22/2003 09/29/2001 01/10/2011 11/13/2009 11/20/2009 04/14/2010 07/15/2011 02/21/2010 11/17/2012 11/18/2006 04/21/2011 04/04/2011 04/11/2008 09/04/2012 07/28/2010 10/30/2000 09/26/2011 10/19/2010 08/03/2009 01/08/2013 01/17/2012 01/18/2012 05/03/2012 07/24/2012 01/24/2012 02/28/2013 01/06/2012 03/21/2013 02/11/2012 04/29/2012 01/09/2012 01/02/2013 02/16/2012 06/13/2012 04/25/2012 05/31/2012 08/22/2012 01/25/2013 02/01/2013 01/08/2012 05/08/2013 02/06/2013 01/26/2013 01/30/2013 09/10/2012 06/04/2012 02/24/2012 01/13/2012 V Y L N T L Nữ Nữ Nam Nữ Nam Nữ 04/13/2008 04/18/2008 07/02/2007 01/31/2012 04/28/2010 10/14/2009 02/28/2013 02/26/2013 04/28/2013 04/20/2013 01/28/2012 04/11/2013 Duyệt Ban Giám Đốc Bệnh viện PHỤ LỤC VIII: TIÊU CHUẨN ƯỚC LƯỢNG DIỆN TÍCH DA Ở TRẺ EM ( sử dụng tốn đồ tính Diện tích da dựa Chiều cao Cân nặng) PHỤ LỤC IX: BẢN CAM KẾT ĐỒNG Ý PHẪU THUẬT VÀ CHO PHÉP LẤY MẪU DA NUÔI CẤY – GHÉP DA NI CẤY SỞ Y TẾ TP HỒ CHÍ MINH BỆNH VIỆN NHI ĐỒNG CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM SHS: Độc lập – Tự – Hạnh phúc GIẤY CAM ĐOAN CHẤP NHẬN PHẪU THUẬT, THỦ THUẬT VÀ GÂY MÊ HỒI SỨC Tôi tên :…………………………tuổi :…… Nam / nữ, Dân tộc: ……… Quốc tịch : Việt nam / Ngoại kiều Địa chỉ:………………………………………………………………………………………………………… Nghề nghiệp :…………………………………Nơi làm việc :……………………………………………… Là cha / mẹ / đại diện gia đình / khác : ……… bệnh nhân họ tên : …………………………………… Hiện điều trị Khoa : ……………Bệnh viện Nhi Đồng Sau nghe Bác sỹ cho biết tình trạng bệnh …… tơi, nguy hiểm bệnh không thực phẫu thuật, thủ thuật, gây mê hồi sức tai biến xảy bệnh tật, tiến hành phẫu thuật, thủ thuật, gây mê hồi sức, tự nguyện viết giấy cam đoan : [ ] Đồng ý xin phẫu thuật, thủ thuật, gây mê hồi sức để giấy làm chứng [ ] Không đồng ý xin phẫu thuật, thủ thuật, gây mê hồi sức để giấy làm chứng Ghi thêm : Gia đình đồng ý tham gia nghiên cứu lấy da gửi ni cấy để tăng diện tích, ghép lại cho bệnh nhân Gia đình Bệnh nhân khơng phải trả thêm chi phí cho việc nuôi cấy da Ngày … tháng … năm …… ĐẠI DIỆN GIA ĐÌNH (Ký ghi rõ họ tên) ... lập, ni cấy tạo tế bào sừng Qui trình ghép tế bào sừng tự thân sau nuôi cấy điều trị bỏng sâu trẻ em CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tình hình nghiên cứu ngồi nước Tình hình nghiên cứu nước Màng ối... sừng tự thân qua nuôi cấy điều trị bỏng sâu trẻ em? ??, nhằm đạt mục tiêu sau: Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng qui trình phân lập, ni cấy tạo tế bào sừng dung cho ghép tự thân Xây dựng qui trình điều trị. .. PHẦN MỞ ĐẦU (– 3) Tên đề tài/dự án: Nghiên cứu ứng dụng tế bào sừng tự thân qua nuôi cấy điều trị bỏng sâu trẻ em Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS BS Trần Công Toại – Ths.BS Nguyễn Bảo Tường Cơ quan chủ