( 25 ) ( TẠP CHÍ KHOA H ỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP HCM SỐ 2 (1) 2007 )KHOA HOC KŸ THUAT 6t ÀNH HÙÖNG CUA ABA TRONG MÔI TRÙ€ING NUÔI CAY LÊN SQ TÁI SINH CHÔI TR C TIÊP T”Ù NUÔI CÂY MÂU LÁ CÂY CHÈ [CAMELLI[.]
KHOA HOC KŸTP.HCM THUAT TẠP CHÍ KHOA H ỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC-MỞ - SỐ (1) 2007 6t 25 ÀNH HÙƯNG CUA ABA TRONG MƠI TRÙ€ING NI CAY LÊN SQ TÁI SINH CHÔI TR C TIÊP T”Ù NUÔI CÂY MÂU LÁ CÂY CHÈ [CAMELLIA SINENSIS (*-) I NGUYE N THANH MAI* NGUN SỴ TN GIĨI THI U Chè mğt nh”iJng công nghiep quan tąo nhieu viec làm tät cà vùng trƯng chè the giói (Mondal et al 2004) Bên cąnh vai trị mğt loąi thúc ng bi6n, chè ngày diJ c la chuğng bơi dțac tính kháng ung thiJ chƯng Ião hóa (Jankul et al 1997) Be cåi thi/en suät nâng cao chät Iu’ğng giƯng, phiJong cách ti6p clan ve cơng nghe sinh hgc nhiJ thao tác gen sé dịi he thÖng sinh sàn phù hop hieu quà (Bhattacharya Ahuja, 2003), bên cąnh viec trì nhúng dịng có suät cao dã có duğc duo tin cúa th! triJịng Vì the, muc dích cúa cơng bƯ khåo sát nÖng dğ khác cúa ABA de phát trien mğt he thÖng sinh sån nham tái sinh tù mơ Iá giƯng chè Oo-long MMac dù dã có mğt sƯ cơng bƯ vë st tái sinh tù loąi mô khác (Kato, 1982, Abraham Rahman, 1986, Bano et at 1991, Jha et al 1992, Mondal et al 1998, Sandal et al 2005), cûng chi có mơt cơng bćỵ ve su' phát sinh phơi vơ tính trac tiep tù mơ Iá dòng chè Assamica-SRL 73, SBs (Kato, 1996) sql tái sinh chưi gián tiep tù Iá thơng qua rë bät d!nh có ngn gƯc calli (Sandal et al 2005) Tuy nhiên, viec Imap Iąi cơng bčỵ cúa Kato Sandal dƯi vói giƯng chè cao sàn dang tiêu ” Thac si”, Giàng viên ca hfìu Khoa Cơng nghê Sinh hqc, DH Mó TP.HCM “Sinh vién năm thru to, Khoa Cơng nghe Sinh hgc, DH Mó TP.HCM thu tąi Viêt Nam, nhU giƯng Oo-Long, dă găp phâi nhieu khó khăn ABA — mğl chat dieu hịa sinh trtïơng thÿc vȘat vùa có vai lrị úc ch6, vùa có vai trị kích thích su phát trien dƯi vói mơt q trình sinh hoc (Tn et al 2005) Chính vai trị rät dac biet cúa axit abscisis mà dã nghiên cúu tìm co ch6 tác thích hqp giúa mơ giai doąn phát sinh hình thái nham kích thích st tái sinh chƯi tù mơ sęo Các guy trình vi nhân giƯng chè (Camellia sinensis) g¿ap phåi trô ngąi ô giai doąn tąo rë in vitro (Mondal et al 2004) Do dó, cüng tien hành nuôi cäy chè nhúng he thƯng vùa mói vùa rè tiën (hơp nhi,fa Bąi Bưng Tien) nhäm thu diJğc giƯng có bğ rë phát trien khơe mąnh VAT LIEU VÀ ł•HLtONG PHÁP Sof khói dau ni cay tái sinh Q trình vơ trùng máu dua.c tien hành erlen 100 ml có bƯ sung 20 ml mơi trDịng MS vói 8,0 9.1-1 agar, 1,0 mg.I-1 TDZ (Thidiaruzon) 30 g.I-1 du'òng succrose Các doąn choi nách di ğc thiet Imap tù nhr”ïng chè trU”ong !hành Camellia sinensis var., Oo- Long duğc trƯng tąi Trung tâm thÿc nghiem chè Lâm Bóng Sau Ian cäy truyen cách mÖi 40 ngày, thú tính tù dỵnh xng duğc cat thành mau cäy vói kích thc (5,0 x 1,0 mm*) disc dùng Iàm vțat lieu thí nghiêm TẠP CHÍ KHOA H ỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM - SỐ (1) 2007 TAP CHI KHOA HQC SO 01(11)-2007 26 62 Các phån úng phát sinh hình thái mơ dcfğc thù nghiem mơi trng MS1 có bƯ sung 30 9.11 dng succrose nÖng khác cúa to help giúa IBA (0,05; 0,1; 0,5 mg.I-1) BA (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg.1-1) pH mơi tr0ịng dUğc diéu chinh ve 5,6 + 0,2 trrỵóc häp khú trùng he thćỵng autoclave Trong thí nghiem thú 2, mơ sęo du’ğc hình thành sau 20 ngày ni cäy mơi trüịng MS1 dügc chuyen sang mơi trr/ịng MS2 có bo sung nong dğ khác cúa ABA (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg.I-1) to hop cúa BA IBA de tái sinh chói Tái sinh rË in vitro chuyen I Trong thí nghiêm thú 3, chói tái sinh tù mơ sęo dUğc tách tien hành nuôi cäy mơi trng MS3 MS4 rJrJam itwn inicrł cay iąo ru Các chƯi cao khổng 4-5 cm või b /ore khõe mąnh diJgc chuyen thú nghiem ngỗi u’om Phân tích thong kê Các thí nghiem diJğc leap Iąi Ian, mịi Ian 40 mau Các sƯ lieu doğc xù ly thÖng kê bang phän mem MSTATC 2004 Tät cå q trình ni cäy d0ğc trì dieu kien quang chu kÿ 16h/ngày dUói ánh sáng dèn huynh quang cUòng 3000 lux nhiet duo phò ng 270C + 20 C KET OUA VA THAO LUAN SJ hình thành mơ sęo tái sinh choi Mô sęo di ğc cãm úng thú (tính tù nggn xng) vói kích thc (5,0 x 1,0 mm2) sau 14 ngày ni cäy nƯng duo khác cúa IBA BA (Hình 1a) Tuy nhiên, mô sęo dã không cho thäy bät kÿ phàn úng phát si ni cäy mơi trng hoțac cäy truyen sang mơi trr/ịng mói có dțac tính Mac dù mô sęo drïğc hinh thành ô tät cå nÖng duo tÖ hdp giúa IBA BA (mô sęo phát sinh nhieu nhät ô nghigem thúc L4, 100% måu cäy tái sinh mơ sęo), chói chi phát sinh tù mơ sęo (hình 1b) chúng dUğc cäy truyen sang mơi trr/ịng MS2 Có bo sung ABA nghiem thúc L4 Tan sƯ tái sinh chưi, sƯ chưi trung bình/máu chieu cao chưi dąt tƯt nhät ô nghiȘem thúc L14, bàng 2, Ian IiJot Ià 100%, 11,18 chƯi cao 6,26 cm fIinh Nhån gióog eäș ebc t’u nuôi may aim lå úng dQDg hop fihȘfì t$Oang Chi he thóng lóng rå rao inõ oeo b iéi einh choi tiï iá d, e Cây hop Dat done tion Côy nuô cåy they canh cT TẠP CHÍ KHOA H ỌC TRƯỜNG ĐẠIHOC HỌC -MỞ KHOA KYTPHCM THUAT- SỐ (1) 2007 27 63 Bàng 1: Ành hiJóng cúa nóng IBA BA lên sim càm iJng mõ seo tU” nuõi câ’y Nghiem thúc Chat dieu hoà tãng trifdng (mgd) IBA Lt L2 L3 0,05 L4 L6 0,1 Lt Lg L9 Lio Lt t Liz 0,5 BA 0,5 1,0 1,5 2,0 0,5 1,0 1,5 2,0 0,5 1,0 1,5 2,0 ABA Ty le mau hinh thành mô s9o (%) 78,80 80,00 87,67 100,0 88,90 90,09 93,33 88,00 50,06 49,00 47,47 34,43 Trpng lJtfng tifdi trung binh mô s9o (mg) 11,06 + 1,48â 12,33 + 1,58 b 13,67 + 0,29 b 18,67 + 0,45d 15,55 + 0,83 16,47 + 0,78 “ 17,05 + 0,12* b 14,23 + 0,21 ’ 09,09 + 0,46 C 08,67 + 0,17‘ 07,45 + 0,23" 06,99 + 0,20' Ghi chú: CV —— 0,01 vá LSD —— 1,556 Bieu Ánh huõng cúa chat DHSTTV lên sq hinh thành gia tàng sinh khoi mô seo 120 100 ng Gi tri so lpu 80 60 40 20 L4 L7 —m- Ty le Eu hírih thành mô seo (%) Trpng krpng tuoi mô seo (mg) Cd L1 Nghiem thúc TẠP CHÍ KHOA H ỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM - SỐ (1) 2007 TAP CHÌ KHOA HQC SƯ 01(11)-2007 28 64 Bång Ánh hUóng cûa ABA Iên src tái sinh chifii tie” mô sęo Chat lieu hoa tăng Ty le man trildng (mg.1 1) hình thành Nghiem thif'c IBA BA ABA So lif ng choi trung Chieu cao trung bình (choi bình cua /mau) choi(cm) choi (%) LȚ3 0,5 6,322 + 6,32b L i4 1,0 11,184 + 11,1ã 6,12 + 0,31å 6,26 + 0,94ã 6,099 + 6,1b 5,00 + 0,19å 3,228 + 3,23 2,12 + 1,69 b 0,05 2,0 L i5 1,5 L l6 2,0 100 Ohi chú: CV —— 0,01 vá LED —— 1,456 Bieu Árih huõng cïia to hip IBA, BA nong ABA lên sq tái sinh choi tù mơ sęo có nguon goc 12 H So iu9ng choi trung biríh/måu 10 H Chieu cao choi trung bioh/u Gi tr1 so lu p L15 Nghiem thúc Dia vào ket quå phân tfch ANOVA cho thäy st khác biet giđa nghìem thúc rät có ÿ nghïa múc dğ 0,01 cho thäy: Giđa nghiem thúc L13 L15 khơng có ski khác biet b Nghiem thúc L14 có su' khác biet có ÿ nghïa vói tät cã nghiem thúc cịn lai Oánh giã L16 ket quå thí nghiem: nghfelzl thúc L14 cúa thí nghiem cho ket q sƯ chói/mơ dąt cao nhät (hình 1b) Nghiem thúc L14 có st khác biet có ÿ nghïa múc 0,01 nên ta nhân thay rang nên khuyen cáo áp dung L14 sè có hiêu q kinh te nhät Ket q thí nghiêm ò bãng cho TẠP CHÍ KHOA H ỌC TRƯỜNG ĐẠIHQC HỌC MỞ - SỐ (1) 2007 KHOA - KŸTP.HCM THUAT thäy nghiem thúc L14 cho ket quã tái sinh chƯi tćít nhät, dąt 11,184 + 11,18 chói/mƠ SLí tái sinh chói bät d!nh thơng qua mơ sęo tù nuôi cäy mô Iá in vitro dUğc báo cáo Ián dau tiên nhät cho den bôi Sandal cğng st, 2005 Trong nghiên cúu dó, Sandal cğng sc/ dã sù dung 2,4-D chät OHSTTV nhät q trình ni cäy thi6t lap duğc quy trình tái sinh chói bät d!nh tù Iá dąt ket q tƯi 0u 14 + 1,6 chói/mäu cäy sau 24 tuan ni căíy Tuy nhiên, quy trình ni cäy s”tï dqng nóng duo 2,4-D rät cao (7,5 — 10 mg/I 2,4-D) thòi gian dài (hon tháng) dã khien tƯc duo phát trien cùa chưi tái sinh b| giãm mąnh Chính tác giå dã nghiên cúu drïa ket luan nêu Hen nña, quy trình cúa Sandal c/ong su' tråi qua gián tiep Ian mô bät d!nh (Iá tąo re bät d!nh, re bät d!nh phát sinh mô sęo, mô sęo hình thành choi bät dinh) có the sé khien tỵ Iê b| dơt bi6n gia tăng Tri óc tình hình này, chúng tơi nƯ lu'c nghiên cúu nham dna guy trình hițeu q Ưn *!nh hon nhieu Trong nghiên cúu này, thiet Iâp dr/ğc quy trình tái sinh chƯi bät d|nh tù ni cäy Iá thơng qua mơ sęo vói tan sƯ tái 29 65 sinh dąt 100% (vän de không thäy de clap nghiên cúu cùa Sandal cțong st, 2005) M¿ac dù ket q tƯt nhät chúng tơi thu diJğc 11,184 + 11,18 chƯi/mơ (thäp hon so vói 14 + 11,6 chƯi/mơ) nhiJng thịi gian ni cäy ngan hon nhieu (sau 10 tn ni cäy) nƯng dğ chät diëu hịa sinh triJơng thșc vȘat diJğc s”Ji dqng ô nÖng dğ thäp hon nhieu (0,05 mg.l- IBA + 2,0 mg.I-1 BA + 1,0 mg.1-1 ABA) Có rät nhieu nhúng nghiên cúu de cap vai trò cûa ABA viec tăng ciJòng khã tái sinh choi tù mô sęo (Liu công st, 1997, Modal cțong st, 2004, Peterson Smith, 2004, ) Trong nghiên cúu này, có Ié ABA dã úc che st tăng sinh khƯi mơ sęo duğc bo sung vào mơi tru’ịng ni cäy nhiJng dong thịi cúng kích thích srï phát trien phát the choi tù mô sęo Viec nghiên cúu sâu hon núa ve mat sinh trac nghiem mô sé dna nhúng ket luan thú V! St tái sinh re in vitro chuyen vUòn u0m Bâng Các mơi tri ịng dùng khào sát st tái sinh rè Nghiem thif'c R, Rø Rø R4 Chat kích thích t3o rë (mg/1) IBA 7 i Diëu kien nuõi cäy Sáng Täi X Rån X Lóng Than (' ’ Ty 'e ‘a hình thành rë 36,04 66,67 50 0 22,16 11,3 x x 0 37 19,05 30 66 TẠP CHÍ KHOA H ỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM - SỐ (1) 2007 TAP CHI KHOA HQC SƯ 01(11)-2007 ílính Z Hình thái k6í thou ß eăy chs quan såt düói KłIV ó phóng dii 6OO lâ n tó n c›/a i tit nhirn b tś in vitro, inơ tr0óng ran Sau tháng ni cäy, tan sƯ tái sinh re cao nhät thu dcfğc ô nghiem thúc R1 (3 mg/I IBA + g/I than hoąt tính, mơi tru'ịng d/ac ni cäy có chieu sáng), dąt tan sƯ 66,67% (Hình 1d, e) Các nghiem thúc R2 R4 (mơi tr0ịng Iơng) (Hình 1f) cüng cho thäy choi có khã phát sinh re nhtïng vói tán sƯ thäp hon so vói ni cay mơi tr0ịng d/ac Tän sćỵ tái sinh re khác giúa mơi trtïịng Iơng d/ac có Ié liên quan den pH mơi trng ni cåy dièu kiên ni cäy thống khí hğp nhÿa Dąi BƯng Ti6n Ngồi ra, có st hien dien cúa auxin ngoąi sinh ket hgp vd‘i auxin nKoi sinh tąo nên mğt st cân bang giña hormone mói nghiêng ve phía auxin tù dó kích thích st re Ket quå phù hop vói ket Iucan cúa Mondal cơng st (2004): st hình thành re in vitro phu thuğc vào nong dơ auxin diëu kien sinh Iÿ trình ni cäy Nghiên cúu cd quan khí khau Grodzinxki, 1891, D!Ch: Tân Huyên), cho thäy Iá ex vitro có sćí Indng khí khau it nhät (Hình 2a), ti6p theo Ià Iá invitro ni cäy mơi trng ran (Hình 2b) Iá in vitro ni cäy lơng (Hình 2c) có sƯ khí khau nhieu nhät Nhúng Iá ex vitro có Ióp bieu bì sáp bên ngồi nên phát trien tÖt hon Iá in vitro mgng nr/óc khơng có Ióp bieu bì sáp bên ngồi (Paek Hahn, 2000) Nhúng Iá mgng nUóc cüng dã bieu hiȘen st phát trien cúa t6 bào båo ve khí khau b! dóng Iąi so sánh vói nhđng Iá bình thU”ong Khí khau dóng ị nhúng mgng n0óc cäu trúc khác thU”ong cúa chúng gây bơi áp st hoi n0óc bão hịa bình ni cäy (Han et al 1992, Preece Sutter, 1991) Chuyen wèn rïdm Các choi có chiëu cao khồng cm vói bțo rë khơe mąnh (Hình 1g) diJğc dna trưng thù nghiêm ngồi viJịn uom Cây có su' sinh trng phát trien bình thu"ong sau tháng (Hình 1h) sau tháng (Hình 1i) Khi tien hành nghiên cúu khí khau theo phLfdng pháp cúa Molotkovxki (Grodzinxki TÀI LIEU THAM KHÀO (1) Abraham GC and Rahman K (1986) Somatic embryogenesis in tissue culture of imma- ture cotyledons of tea (Camellia spp.) In: Somers DA, Gengenbach BG, Biesboer DD, Hackett WP and Green CE (eds), Abstr 6th International Congress of Plant Tissue and GeII Culture University of Minnesota, Minneapolis 294 pp (2) Bano Z, Rajarathnam S, Mohanty BD (1991) Somatic embryogenesis in cotyledon cul- ture of tea (Thea sinensis L.) J Hort Sci 66: 465—470 TẠP CHÍ KHOA H ỌC TRƯỜNG ĐẠI HQC HỌC MỞ TP.HCM - SỐ (1) 2007 KHOA - KŸ THUAT 31 67 (3) Bhattacharya A and Ahuja PS (2003) Prospects of transgenics in tea crop improve- ment In: Singh R.P and Jaiwal P.K (eds), Plant Genetic Engineering Improvement of Commercial Plants -1 Scientific Technology Publishers, LLC, USA, pp 115—130 (4) Han BH, Paek KY, Choi JK (1992) Structural characteristics of vitrified and glaucous plantlets in ypsophila paniculata L in vitro J Korean Soc Hort Sci 33: 177-189 (5) Preece JE, Sutter EG (1991) Acclaimatization of micropropagated plants to green- house and field Debergh PC, Zimmerman RH Micropropagation: Technology and application Dordrecht The Netherlands Kluwers 71-93 (6) Jankun J, Selman SH, Swiercz R, Skrzypczak-Jankun E (1997) Why drinking green tea could prevent cancer? Nature 387: 561 (7) Jha TB, Jha S and Sen SK (1992) Somatic embryogenensis from immature cotyledons of an elite Darjeeling tea clone Plant Sci 84: 209—213 (8) Kato M (1982) Result of organ culture on Camellia japonica and C sinensis Jpn J Breed (Supplement 2): 267—277 (9) Kato M (1996) Somatic embroygenesis from immature leaves of in vitro grown tea shoots Plant Cell Rep 15: 920-923 (10) Mondal TK, Bhattacharya A, Sood A, A’huija PS (1998) Micropropagation of tea using thidiazuran Plant Growth Reg 26: 57-61 (11) Mondal TK, Bhattacharya A, Laxmikumaran M, Ahuja PS (2004) Recent advances of tea (Camelia sinesis) biotechnology Plant Cell, Tissue and Organ Culture 76: 195-254 (12) Paek KY, Hahn EJ (2000) Cytokinins, auxins and activated charcoal affect organogenesis and antomical characteristics of shoot-tip cultures of Lisianthus [Eustoma grandiflorum (RAF.) SHINN] In vitro cell Dev Biol Plant 36 128-132 (13) Sandal I, Kumar A, Bhattacharya A, Sharma M, Shanker M, Ahuja PS (2005) Gradual depletion of 2,4-D “in the culture medium for indirect shoot regeneration from leaf explants of Camellia sinensis (L.) O Kuntze Plant Growth Reg.47:121-127 (14) Tuan NS, Mai NT, Thuy DDT, Uyen NV and Nhut DT (2005) Shoot regeneration and plant formation derived from in vitro root culture of sweet potato (Ipomoea batatas L.) In: TUYEN BC, GIANG TT, MIEN BV, HIEN PP, HAY N, TRI BM (Eds.) Proc Vietnam-Korea Int Sym Biotech Bio-system Eng pp 174-180 TÓM TAT Su tái sinh choi bät d!nh thông qua mô sęo tù mô Iá in vitro düğc cơng bƯ Ian dau tiên chè Mơ sęo duğc hình thành mơi trng MS (Murashige Skoog, 1962) có bo sung nong dơ khác cúa BA, IBA Các phát the choi bat d!nh phát trien tù mô giai doąn nuôi cäy kéo dài tuan mơi trng có bo sung 0,05 mg.I-1 IBA, 2,0 mg.1-1 BA 1,0 mg.IABA Các phát the choi phát trien tù mơ sęo, chỵ ABA di ğc thêm vào mơì trng ni cay nham gây úc ch6 chuyen hóa Các choi tái sinh di c cäy truyen sang mơi trr/ịng MS3 có bƯ 32 68 TẠP CHÍ KHOA H ỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM - SỐ (1) 2007 TAP CHÌ KHOA HOC SO 01(11)-2007 sung 3,0 mg.1-1 IBA 1,0 g.I-1 than hoąt tính mơi trng MS4 có bƯ sung 5,0 mg.1-1 IBA khơng có agar Sau tn ni cäy, re bät d|nh diJ c hình thành Cây sinh tr0”ong phát trien bình thng ngồi com SUMMARY Adventitious shoot regeneration via callus phase from in vitro leaf explants is reported for the first time in tea Callus was obtained on Murashige and Skoog (MS, 1962) medium supplemented with varied concentrations of BA, IBA Adventitious shoot bubs developed indirectly on leaf explants after prolonged culture for weeks on medium supplemented with 0.05 mg.1-1 IBA, 2.0 mg.I-1 and 1.0 mg.I-1 ABA Shoot bubs developed on calli, only when ABA added in the medi- um culture probably due to inhibit and metabolism Shoot bubs regeneration were subcultured on MS3 medium supplemented with 3.0 mg.I-1 IBA and 1.0 g.I-1 activated charcoal and MS4 medi- um supplemented with 5.0mg.1-1 IBA and non-agar Then weeks, adventìtious roots were formed Plantlets grew and developed normally in the greenhouse ... 1,5; 2,0 mg.I-1) to hop cúa BA IBA de tái sinh chói Tái sinh rË in vitro chuyen I Trong thí nghiêm thú 3, chói tái sinh tù mơ sęo dUğc tách tien hành nuôi cäy mơi trng MS3 MS4 rJrJam itwn inicrł... phát sinh nhieu nhät ô nghigem thúc L4, 100% måu cäy tái sinh mô sęo), chói chi phát sinh tù mơ sęo (hình 1b) chúng dUğc cäy truyen sang mơi trr/ịng MS2 Có bo sung ABA nghiem thúc L4 Tan sƯ tái sinh. .. tìm co ch6 tác thích hqp giúa mơ giai doąn phát sinh hình thái nham kích thích st tái sinh chƯi tù mơ sęo Các guy trình vi nhân giƯng chè (Camellia sinensis) g¿ap phåi trô ngąi ô giai doąn tąo rë