ẢNH HƯỞNG CỦA ABA TRONG MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY LÊN SỰ TÁI SINH CHỒI TRỰC TIẾP TỪ NUÔI CẤY MẪU LÁ CÂY CHÈ pptx

ẢNH HƯỞNG CỦA ABA TRONG MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY LÊN SỰ TÁI SINH CHỒI TRỰC TIẾP TỪ NUÔI CẤY MẪU LÁ CÂY CHÈ [CAMELLIA SINENSIS (L.)] Nguyễn Thanh Mai1, Nguyễn Sĩ Tuấn2 GIỚI THIỆU Chè công nghiệp quan trọng tạo nhiều việc làm tất vùng trồng chè giới (Mondal et al 2004) Bên cạnh vai trò loại thức uống phổ biến, chè ngày ưa chuộng đặc tính kháng ung thư chống lão hóa (Jankul et al 1997) Để cải thiện suất nâng cao chất lượng giống, phương cách tiếp cận công nghệ sinh học thao tác gen đòi hỏi hệ thống sinh sản phù hợp hiệu (Bhattacharya Ahuja, 2003), bên cạnh việc trì dịng có suất cao có độ tin cậy thị trường Vì thế, mục đích cơng bố khảo sát nồng độ khác ABA để phát triển hệ thống sinh sản nhằm tái sinh từ mơ giống chè Oolong Mặc dù có số công bố tái sinh từ loại mô khác (Kato, 1982, Abraham Rahman, 1986, Bano et al 1991, Jha et al 1992, Mondal et al 1998, Sandal et al 2005), có cơng bố phát sinh phơi vơ tính trực tiếp từ mơ dịng chè Assamica-SRL 73, SBs (Kato, 1996) tái sinh chồi gián tiếp từ thơng qua rễ bất định có nguồn gốc calli (Sandal et al 2005) Tuy nhiên, việc lặp lại công bố Kato Sandal giống chè cao sản tiêu thụ Việt Nam, giống Oo-Long, gặp phải nhiều khó khăn ABA – chất điều hòa sinh trưởng thực vật vừa có vai trị ức chế, vừa có vai trị kích thích phát triển q trình sinh học (Tuấn et al 2005) Chính vai trị đặc biệt axit abscisis mà nghiên cứu tìm chế tương tác thích hợp mơ giai đoạn phát sinh hình thái nhằm kích thích tái sinh chồi từ mơ sẹo Thạc sĩ, Giảng viên hữu Khoa Công nghệ Sinh học, ĐH Mở TP.HCM Sinh viên năm thứ tư, Khoa Công nghệ Sinh học, ĐH Mở TP.HCM Các quy trình vi nhân giống chè ( Camellia sinensis) gặp phải trở ngại giai đoạn tạo rễ in vitro (Mondal et al 2004) Do đó, tiến hành nuôi cấy chè hệ thống vừa vừa rẻ tiền (hộp nhựa Đại Đồng Tiến) nhằm thu giống có rễ phát triển khỏe mạnh VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Sự khởi đầu ni cấy tái sinh Q trình vơ trùng mẫu tiến hành erlen 100 ml có bổ sung 20 ml môi trường MS với 8,0 g.l-1 agar, 1,0 mg.l-1 TDZ (Thidiaruzon) 30 g.l-1 đường succrose Các đoạn chồi nách thiết lập từ chè trưởng thành Camellia sinensis var., Oo-Long trồng Trung tâm thực nghiệm chè Lâm Đồng Sau lần cấy truyền cách 40 ngày, thứ tính từ đỉnh xuống cắt thành mẫu cấy với kích thước (5,0 × 1,0 mm2) dùng làm vật liệu thí nghiệm Các phản ứng phát sinh hình thái mơ thử nghiệm mơi trường MS1 có bổ sung 30 g.l-1 đường succrose nồng độ khác tổ hợp IBA (0,05; 0,1; 0,5 mg.l -1) BA (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg.l-1) pH môi trường điều chỉnh 5,6 ± 0,2 trước hấp khử trùng hệ thống autoclave Trong thí nghiệm thứ 2, mơ sẹo hình thành sau 20 ngày nuôi cấy môi trường MS1 chuyển sang mơi trường MS2 có bổ sung nồng độ khác ABA (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg.l-1) tổ hợp BA IBA để tái sinh chồi Tái sinh rễ in vitro chuyển vườn ươm Trong thí nghiệm thứ 3, chồi tái sinh từ mô sẹo tách tiến hành nuôi cấy môi trường MS3 MS4 nhằm kích thích tạo rễ Các chồi cao khoảng 4-5 cm với rễ khỏe mạnh chuyển trồng thử nghiệm ngồi vườn ươm Phân tích thống kê Các thí nghiệm lặp lại lần, lần 40 mẫu Các số liệu xử lý thống kê phần mềm MSTATC 2004 Tất q trình ni cấy trì điều kiện quang chu kỳ 16h/ngày ánh sáng đèn huỳnh quang cường độ 3000 lux nhiệt độ phòng 270C ± 20 C KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Sự hình thành mơ sẹo tái sinh chồi Mô sẹo cảm ứng thứ (tính từ xuống) với kích thước (5,0 × 1,0 mm2) sau 14 ngày ni cấy nồng độ khác IBA BA (Hình 1a) Tuy nhiên, mô sẹo không cho thấy phản ứng phát sinh hình thái khác suốt q trình ni cấy mơi trường cấy truyền sang mơi trường có đặc tính Mặc dù mơ sẹo hình thành tất nồng độ tổ hợp IBA BA (mô sẹo phát sinh nhiều nghiệm thức L4, 100% mẫu cấy tái sinh mô sẹo), chồi phát sinh từ mơ sẹo (hình 1b) chúng cấy truyền sang mơi trường MS2 có bổ sung ABA nghiệm thức L Tần số tái sinh chồi, số chồi trung bình/mẫu chiều cao chồi đạt tốt nghiệm thức L14, bảng 2, 100%, 11,18 chồi cao 6,26 cm Bảng Ảnh hưởng nồng độ IBA BA lên cảm ứng mô sẹo từ nuôi cấy Chất điều hoà sinh Nghiệm thức L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9 L10 L11 L12 Ghi chú: IBA BA 0,05 0,1 0,5 ABA 0,5 1,0 1,5 2,0 0,5 1,0 1,5 2,0 0,5 1,0 1,5 2,0 Trọng lượng tươi trung Tỷ lệ mẫu hình trưởng (mg/l) bình mơ sẹo thành mô sẹo (%) (mg) 78,80 80,00 87,67 100,0 88,90 90,09 93,33 88,00 50,06 49,00 47,47 34,43 11,06 ± 1,48a 12,33 ± 1,58b 13,67 ± 0,29b 18,67 ± 0,45d 15,55 ± 0,83cd 16,47 ± 0,78ac 17,05 ± 0,12e 14,23 ± 0,21bc 09,09 ± 0,46c 08,67 ± 0,17c 07,45 ± 0,23c 06,99 ± 0,20f CV = 0,01 LSD = 1,556 Biểu đồ Ảnh hưởng chất ĐHSTTV lên hình thành gia tăng sinh khối mơ sẹo 100 80 60 40 20 Tỷ lệ mẫu hình thành mô sẹo (%) Trọng lượng tươi mô sẹo (mg) L12 L11 L10 L9 L8 L7 L6 L5 L4 L3 L2 L1 Giá trị số lượng 120 Nghiệm thức Bảng Ảnh hưởng ABA lên tái sinh chồi từ mơ sẹo Chất điều hịa sinh Nghiệm thức Tỷ lệ trưởng (mg.l-1) mẫu Số lượng chồi Chiều cao trung hình trung bình bình chồi thành (chồi/mẫu) (cm) 6,322 ± 6,32b 11,184 ± 11,18a 6,099 ± 6,1b 3,228 ± 3,23c 6,12 ± 0,31a 6,26 ± 0,94a 5,00 ± 0,19a 2,12 ± 1,69b IBA BA ABA chồi (%) L13 L14 L15 L16 0,05 Ghi chú: 2,0 0,5 1,0 1,5 2,0 100 CV = 0,01 va# LSD = 1,456 Biểu đồ Ảnh hưởng tổ hợp IBA, BA nồng độ ABA lên tái sinh chồi từ mơ sẹo có nguồn gốc 12 Số lượng chồi trung bình/mẫu Chiều cao chồi trung bình/mẫu Giá trị số lượng 10 L13 L14 L15 L16 Nghiệm thức Dựa vào kết phân tích ANOVA cho thấy khác biệt nghiệm thức có ý nghĩa mức độ 0,01 cho thấy: Giữa nghiệm thức L13 L15 khơng có khác biệt b Nghiệm thức L14 có khác biệt có ý nghĩa với tất nghiệm thức cịn lại Đánh giá kết thí nghiệm: nghiệm thức L14 thí nghiệm cho kết số chồi/mơ đạt cao (hình 1b) Nghiệm thức L14 có khác biệt có ý nghĩa mức 0,01 nên ta nhận thấy nên khuyến cáo áp dụng L14 có hiệu kinh tế Kết thí nghiệm bảng cho thấy nghiệm thức L14 cho kết tái sinh chồi tốt nhất, đạt 11,184 ± 11,18 chồi/mô Sự tái sinh chồi bất định thông qua mô sẹo từ nuôi cấy mô in vitro báo cáo lần Sandal cộng sự, 2005 Trong nghiên cứu đó, Sandal cộng sử dụng 2,4-D chất ĐHSTTV q trình ni cấy thiết lập quy trình tái sinh chồi bất định từ đạt kết tối ưu 14 ± 1,6 chồi/mẫu cấy sau 24 tuần nuôi cấy Tuy nhiên, quy trình ni cấy sử dụng nồng độ 2,4-D cao (7,5 – 10 mg/l 2,4-D) thời gian dài (hơn tháng) khiến tốc độ phát triển chồi tái sinh bị giảm mạnh Chính tác giả nghiên cứu đưa kết luận nêu Hơn nữa, quy trình Sandal cộng trải qua gián tiếp lần mô bất định (lá tạo rễ bất định, rễ bất định phát sinh mô sẹo, mơ sẹo hình thành chồi bất định) khiến tỉ lệ bị đột biến gia tăng Trước tình hình này, chúng tơi nỗ lực nghiên cứu nhằm đưa quy trình hiệu ổn định nhiều Trong nghiên cứu này, thiết lập quy trình tái sinh chồi bất định từ nuôi cấy thông qua mô sẹo với tần số tái sinh đạt 100% (vấn đề không thấy đề cập nghiên cứu Sandal cộng sự, 2005) Mặc dù kết tốt thu 11,184 ± 11,18 chồi/mô (thấp so với 14 ± 11,6 chồi/mô) thời gian nuôi cấy ngắn nhiều (sau 10 tuần nuôi cấy) nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật sử dụng nồng độ thấp nhiều (0,05 mg.l-1 IBA + 2,0 mg.l-1 BA + 1,0 mg.l-1 ABA) Có nhiều nghiên cứu đề cập vai trò ABA việc tăng cường khả tái sinh chồi từ mô sẹo (Liu cộng sự, 1997, Modal cộng sự, 2004, Peterson Smith, 2004, …) Trong nghiên cứu này, có lẽ ABA ức chế tăng sinh khối mô sẹo bổ sung vào môi trường nuôi cấy đồng thời kích thích phát triển phát thể chồi từ mô sẹo Việc nghiên cứu sâu mặt sinh trắc nghiệm mô đưa kết luận thú vị Sự tái sinh rễ in vitro chuyển vườn ươm Bảng Các môi trường dùng khảo sát tái sinh rễ Chất kích Nghiệ thích tạo rễ m thức (mg/l) IBA 7 7 R1 R2 R3 R4 Tỷ lệ mẫu hình Điều kiện ni cấy Than thành rễ (%) (1 g/l) Sáng Tối Rắn Lỏng 36,04 66,67 50 0 22,16 11,3 x - x - x x - - x x - x x - - - 0 37 19,05 - x - x Sau tháng nuôi cấy, tần số tái sinh rễ cao thu nghiệm thức R1 (3 mg/l IBA + g/l than hoạt tính, mơi trường đặc ni cấy có chiếu sáng), đạt tần số 66,67% (Hình 1d, e) Các nghiệm thức R2 R4 (mơi trường lỏng) (Hình 1f) cho thấy chồi có khả phát sinh rễ với tần số thấp so với nuôi cấy môi trường đặc Tần số tái sinh rễ khác mơi trường lỏng đặc có lẽ liên quan đến pH môi trường nuôi cấy điều kiện nuôi cấy thống khí hộp nhựa Đại Đồng Tiến Ngồi ra, có diện auxin ngoại sinh kết hợp với auxin nội sinh tạo nên cân hormone nghiêng phía auxin từ kích thích rễ Kết phù hợp với kết luận Mondal cộng (2004): hình thành rễ in vitro phụ thuộc vào nồng độ auxin điều kiện sinh lý q trình ni cấy Nghiên cứu quan khí Khi tiến hành nghiên cứu khí theo phương pháp Molotkovxki (Grodzinxki Grodzinxki, 1891, Dịch: Tân Huyên), cho thấy ex vitro có số lượng khí (Hình 2a), in vitro ni cấy mơi trường rắn (Hình 2b) in vitro ni cấy lỏng (Hình 2c) có số khí nhiều Những ex vitro có lớp biểu bì sáp bên ngồi nên phát triển tốt in vitro mọng nước khơng có lớp biểu bì sáp bên ngồi (Paek Hahn, 2000) Những mọng nước biểu phát triển tế bào bảo vệ khí bị đóng lại so sánh với bình thường Khí đóng mọng nước cấu trúc khác thường chúng gây áp suất nước bão hịa bình nuôi cấy (Han et al 1992, Preece Sutter, 1991) Chuyển vườn ươm Các chồi có chiều cao khoảng cm với rễ khỏe mạnh (Hình 1g) đưa trồng thử nghiệm vườn ươm Cây có sinh trưởng phát triển bình thường sau tháng (Hình 1h) sau tháng (Hình 1i) TÀI LIỆU THAM KHẢO (1) Abraham GC and Rahman K (1986) Somatic embryogenesis in tissue culture of immature cotyledons of tea (Camellia spp.) In: Somers DA, Gengenbach BG, Biesboer DD, Hackett WP and Green CE (eds), Abstr 6th International Congress of Plant Tissue and Cell Culture University of Minnesota, Minneapolis 294 pp (2) Bano Z, Rajarathnam S, Mohanty BD (1991) Somatic embryogenesis in cotyledon culture of tea (Thea sinensis L.) J Hort Sci 66: 465–470 (3) Bhattacharya A and Ahuja PS (2003) Prospects of transgenics in tea crop improvement In: Singh R.P and Jaiwal P.K (eds), Plant Genetic Engineering Improvement of Commercial Plants -I Scientific Technology Publishers, LLC, USA, pp 115–130 (4) Han BH, Paek KY, Choi JK (1992) Structural characteristics of vitrified and glaucous plantlets in ypsophila paniculata L in vitro J Korean Soc Hort Sci 33: 177-189 (5) Preece JE, Sutter EG (1991) Acclaimatization of micropropagated plants to greenhouse and field Debergh PC, Zimmerman RH Micropropagation: Technology and application Dordrecht The Netherlands Kluwers 71-93 (6) Jankun J, Selman SH, Swiercz R, Skrzypczak-Jankun E (1997) Why drinking green tea could prevent cancer? Nature 387: 561 (7) Jha TB, Jha S and Sen SK (1992) Somatic embryogenensis from immature cotyledons of an elite Darjeeling tea clone Plant Sci 84: 209–213 (8) Kato M (1982) Result of organ culture on Camellia japonica and C sinensis Jpn J Breed (Supplement 2): 267–277 (9) Kato M (1996) Somatic embroygenesis from immature leaves of in vitro grown tea shoots Plant Cell Rep 15: 920-923 (10) Mondal TK, Bhattacharya A, Sood A, Ahuija PS (1998) Micropropagation of tea using thidiazuran Plant Growth Reg 26: 57-61 (11) Mondal TK, Bhattacharya A, Laxmikumaran M, Ahuja PS (2004) Recent advances of tea (Camelia sinesis) biotechnology Plant Cell, Tissue and Organ Culture 76: 195-254 (12) Paek KY, Hahn EJ (2000) Cytokinins, auxins and activated charcoal affect organogenesis and antomical characteristics of shoot-tip cultures of Lisianthus [Eustoma grandiflorum (RAF.) SHINN] In vitro cell Dev Biol Plant 36 128-132 (13) Sandal I, Kumar A, Bhattacharya A, Sharma M, Shanker M, Ahuja PS (2005) Gradual depletion of 2,4-D in the culture medium for indirect shoot regeneration from leaf explants of Camellia sinensis (L.) O Kuntze Plant Growth Reg.47:121-127 (14) Tuan NS, Mai NT, Thuy DDT, Uyen NV and Nhut DT (2005) Shoot regeneration and plant formation derived from in vitro root culture of sweet potato (Ipomoea batatas L.) In: TUYEN BC, GIANG TT, MIEN BV, HIEN PP, HAY N, TRI BM (Eds.) Proc Vietnam-Korea Int Sym Biotech Bio-system Eng pp 174-180 TÓM TẮT Sự tái sinh chồi bất định thông qua mô sẹo từ mô in vitro công bố lần chè Mô sẹo hình thành mơi trường MS (Murashige Skoog, 1962) có bổ sung nồng độ khác BA, IBA Các phát thể chồi bất định phát triển từ mô giai đọan nuôi cấy kéo dài tuần mơi trường có bổ sung 0,05 mg.l-1 IBA, 2,0 mg.l-1 BA 1,0 mg.l-1 ABA Các phát thể chồi phát triển từ mô sẹo, ABA thêm vào môi trường nuôi cấy nhằm gây ức chế chuyển hóa Các chồi tái sinh cấy truyền sang mơi trường MS có bổ sung 3,0 mg.l-1 IBA 1,0 g.l-1 than hoạt tính mơi trường MS4 có bổ sung 5,0 mg.l-1 IBA khơng có agar Sau tuần ni cấy, rễ bất định hình thành Cây sinh trưởng phát triển bình thường ngồi vườn ươm SUMMARY Adventitious shoot regeneration via callus phase from in vitro leaf explants is reported for the first time in tea Callus was obtained on Murashige and Skoog (MS, 1962) medium supplemented with varied concentrations of BA, IBA Adventitious shoot bubs developed indirectly on leaf explants after prolonged culture for weeks on medium supplemented with 0.05 mg.l-1 IBA, 2.0 mg.l-1 and 1.0 mg.l-1 ABA Shoot 10 bubs developed on calli, only when ABA added in the medium culture probably due to inhibit and metabolism Shoot bubs regeneration were subcultured on MS medium supplemented with 3.0 mg.l-1 IBA and 1.0 g.l-1 activated charcoal and MS4 medium supplemented with 5.0mg.l-1 IBA and non-agar Then weeks, adventitious roots were formed Plantlets grew and developed normally in the greenhouse 11 ... cho thấy chồi có khả phát sinh rễ với tần số thấp so với nuôi cấy môi trường đặc Tần số tái sinh rễ khác mơi trường lỏng đặc có lẽ liên quan đến pH môi trường nuôi cấy điều kiện nuôi cấy thống... Nghiệm thức Bảng Ảnh hưởng ABA lên tái sinh chồi từ mơ sẹo Chất điều hịa sinh Nghiệm thức Tỷ lệ trưởng (mg.l-1) mẫu Số lượng chồi Chiều cao trung hình trung bình bình chồi thành (chồi/ mẫu) (cm) 6,322... mẫu cấy tái sinh mô sẹo), chồi phát sinh từ mơ sẹo (hình 1b) chúng cấy truyền sang mơi trường MS2 có bổ sung ABA nghiệm thức L Tần số tái sinh chồi, số chồi trung bình /mẫu chiều cao chồi đạt