(Luận văn thạc sĩ) ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy lên sự nhân nhanh sinh khối phôi sâm ngọc linh trong nuôi cấy in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY LÊN KHẢ NĂNG NHÂN NHANH SINH KHỐI PHÔI SÂM NGỌC LINH TRONG ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY IN VITRO Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hƣớng dẫn: TS Hà Thị Loan Sinh viên thực : Phạm Thảo My MSSV: 1411100365 Lớp: 14DSH02 TP Hồ Chí Minh, Tháng Năm 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY LÊN KHẢ NĂNG NHÂN NHANH SINH KHỐI PHÔI SÂM NGỌC LINH TRONG ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY IN VITRO Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hƣớng dẫn Sinh viên thực TS Hà Thị Loan Phạm Thảo My TP Hồ Chí Minh, Tháng Năm 2018 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên xin chân thành gửi lời cảm ơn đến cha mẹ gia đình tôi, tạo điều kiện tốt để học tập Trƣờng đại học Hutech thành phố Hồ Chí Minh Cảm ơn cha mẹ ln động viên tơi để tơi hồn thành tốt khóa học Xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Trung tâm Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh nói chung phịng thực nghiệm trồng nói riêng cho phép hỗ trợ mặt sở vật chất để thực đƣợc khóa luận tạ Xin đƣợc gửi lời cơm ơn sâu sắc đến TS Hà Thị Loan KS Đào Bá Uy ngƣời hƣớng dẫn, bảo truyền đạt kiến thức, kỹ năng, tài liệu suốt thời gian thực đề tài Tôi xin cảm ơn tất anh chị phòng thực nghiệm trồng sẵn sàng giúp đỡ hỗ trợ công việc học tập Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn đến trƣờng Đại học Hutech thành phố Hồ Chí Minh, cảm ơn TS Nguyễn Thị Hoài Hƣơng Viện Khoa học Ứng dụng Hutech tạo điều kiện cho đƣợc gặp gỡ tiếp xúc với môi trƣờng làm việc thực tế đƣợc nghiên cứu đề tài Trung tâm Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh Cuối tơi xin kính chúc ban giám hiệu trƣờng Đại học Hutech, ban lãnh đạo Trung tâm Công Nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh, TS Hà Thị Loan, KS Đào Bá Uy dooif sức khỏe, gặt hái đƣợc nhiều thành công công việc, sống tràn đầy niềm vui hạnh phúc Tp Hồ Chí Minh, ngày Tháng Sinh viên thực i Năm 2018 CƠNG TRÌNH ĐƢỢC HỒN THÀNH TẠI TRƢỜNG ĐẠI HỌC HUTECH Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng đƣợc hƣớng dẫn khoa học TS Hà Thị Loan KS Đào Bá Uy; Các nội dung nghiên cứu, kết đề tài trung thực chƣa cơng bố dƣới hình thức trƣớc Những số liệu bảng, Biểu đồ phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá đƣợc tác giả thu thập từ nguồn khác có ghi rõ phần tài liệu tham khảo Ngồi ra, khóa luận cịn sử dụng số nhận xét, đánh giá nhƣ số liệu tác giả khác, quan tổ chức khác, có trích dẫn thích nguồn gốc Nếu phát có gian lận tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm nội dung khóa luận Trƣờng Đại học Hutech khơng liên quan đến vi phạm tác quyền, quyền tao gây q trình thực (nếu có) Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng Tác giả Phạm Thảo My ii năm2018 TÓM TẮT Sinh viên thực hiện: Phạm Thảo My Ngành: Công nghệ Sinh học Lớp: 14DSH02 MSSV:1411100365 Tên đề tài: “Ảnh hƣởng điều kiện nuôi cấy lên khả nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro” Ngƣời hƣớng dẫn: TS Hà Thị Loan Địa điểm: đề tài đƣợc tiến hành phịng thí nghiệm thực nghiệm trồng Trung tâm Cơng nghệ Sinh học quận 12 thành phố Hồ Chí Minh Địa chỉ: 2374 Quốc lộ 1, phƣờng Trung Mỹ Tây, quận 12 TP HCM Đề tài gồm thí nghiệm lần lƣợt khảo sát ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng thực vật BA, BA kết hợp nới NAA, Oligochitosan, điều kiện nuôi cấy ánh sáng nhiệt độ lên khả nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro Sau 10 tuần ni cấy, thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng BA, BA NAA, kết cho thấy mẫu đƣợc ni cấy mơi trƣờng MS có bổ sung 1mg/l BA 0,5m/l NAA (nghiệm thức đạt kết tốt thí nghiệm 2) cho kết tốt so với phôi đƣợc nuôi cấy môi trƣờng MS bổ sung 0,5mg/l BA (nghiệm thức đạt kết tốt thí nghiệm 1) với Hệ số nhân sinh khối 9,55 lần Bên cạnh thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng Oligochitosan, kết cho thấy Oligochitosan khơng khơng kích thích khả tăng sinh khối cho phơi sâm Ngọc Linh mà cịn ức chế khả sinh trƣởng phơi sâm Ngọc Linh Ở thí nghiệm ánh sáng, mẫu phôi sâm Ngọc Linh sinh trƣởng mạnh điều kiện nuôi cấy dƣới ánh đèn LED phối hợp theo tỉ lệ 60 đỏ:40 xanh Và đồng thời qua kết thí nghiệm chúng tơi nhận thấy mẫu phơi sâm Ngọc Linh thích hợp sinh trƣởng iii khoảng nhiệt từ 190C – 230C nhiên đề tài nhiệt độ tốt 230C iv MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i CƠNG TRÌNH ĐƢỢC HỒN THÀNH ii TẠI TRƢỜNG ĐẠI HỌC HUTECH ii TÓM TẮT iii DANH MỤC BẢNG ix DANH MỤC BIỂU ĐỒ x DANH MỤC HÌNH ẢNH xi CHƢƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Nội dung nghiên cứu 1.4 Ý nghĩa đề tài .2 CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN ĐỀ TÀI .3 2.1 Sơ lƣợc nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.1.1 Ni cấy mơ tế bào thực vật gì? 2.1.2 Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.1.3 Ứng dụng .5 2.2 Tổng quan sâm Ngọc Linh .6 2.2.1 Lịch sử phát 2.2.2 Nơi phân bố sâm Ngọc Linh 2.2.3 Đặc điểm sâm Ngọc Linh .7 2.2.4 Tình hình nghiên cứu sâm ngọc linh 2.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật 11 v 3.1 Địa điểm thời gian tiến hành .19 3.2 Vật liệu thí nghiệm 19 3.2.1 Vật liệu 19 3.2.2 Trang thiết bị dụng cụ 20 3.2.3 Hóa chất .20 3.3 Phƣơng pháp thí nghiệm 20 3.4 Bố trí thí nghiệm 21 3.4.1 Thí nghiệm 1: ảnh hƣởng BA lên khả nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro 21 3.4.2 Thí nghiệm 2: ảnh hƣởng NAA BA lên khả nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro 22 3.4.3 Thí nghiệm 3: ảnh hƣởng ánh sáng lên khả nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro 23 3.4.4 Thí nghiệm 4: ảnh hƣởng nhiệt độ lên nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro 25 3.4.5 Thí nghiệm 5: ảnh hƣởng nồng độ chitosan lên nhân nhanh phôi sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro 26 CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 4.1 Kết thí nghiệm 1: ảnh hƣởng BA lên khả nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro 28 4.2 Kết thí nghiệm 2: ảnh hƣởng NAA BA lên khả nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro 31 4.3 Kết thí nghiệm 3: ảnh hƣởng ánh sáng lên khả nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro 35 4.4 Kết thí nghiệm 4: ảnh hƣởng nhiệt độ lên khả nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro 39 vi 4.5 Kết thí nghiệm 5: ảnh hƣởng Oligochitosan lên khả nhân nhanh sinh khối phôi sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro .43 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 5.1 Kết luận 46 5.2 Kiến nghị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC 50 vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BA : – Benzylaminopurine NAA : Naphthalene acetic acid IAA : – Indoleacetic acid IBA : – indol butyric acid MS : Murashige Skoog (1962) 2i – P : – isopentenyladenine Tp Hồ Chí Minh : Thành phố Hồ Chí Minh KHCN : Khoa học cơng nghệ Cty TNHH : công ty trách nhiệm hƣu hạn viii The SAS System 22:47 Friday, July 16, 2018 11 The GLM Procedure t Tests (LSD) for TRONGLUONGPHOITUOI NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square Critical Value of t 0.104283 2.30600 Least Significant Difference 0.608 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N BN A 9.5533 0.50.2 B 8.5033 10.5 C 6.8133 10.2 D 4.4667 00 56 D.XỬ LÝ SỐ LIỆU SỐ CHỒI NGHIỆM THỨC The SAS System 20:52 Tuesday, July 27, 2018 13 The GLM Procedure Dependent Variable: SOCHOI Source DF Model Error 68.8888889 137.78 F 206.6666667 Corrected Total Sum of Squares 164.0000000 42.6666667 0.0000000 DF 1 Type I SS Type III SS 130.6666667 42.6666667 0.0000000 57 6.666667 Mean Square F Value Pr > F 82.0000000 42.6666667 164.00 F 1.79484444 7.04 0.0267 The SAS System 20:52 Tuesday, July 27, 2018 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for TRONGLUONGTUOIPHOI NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 0.2549 Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 1.0087 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N ND A A B A B B 10.1033 23 9.3567 21 8.5567 19 64 G XỬ LÝ SỐ LIỆU SỐ CHỒI THÍ NGHIỆM The SAS System 20:52 Tuesday, July 27, 2018 22 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values ND 19 21 23 SOCHOI 678 Number of observations The SAS System 20:52 Tuesday, July 27, 2018 23 The ANOVA Procedure Dependent Variable: SOCHOI Source DF Model Error Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F 1.55555556 2.00000000 Corrected Total 0.77777778 2.33 0.1780 0.33333333 3.55555556 R-Square Coeff Var Root MSE SOCHOI Mean 0.437500 8.518283 0.577350 Source DF ND Anova SS 1.55555556 65 6.777778 Mean Square F Value Pr > F 0.77777778 2.33 0.1780 The SAS System 20:52 Tuesday, July 27, 2018 24 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for SOCHOI NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 0.333333 Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 1.1535 Means with the same letter are not significantly different t Grouping A A A A A Mean N ND 7.3333 21 6.6667 19 6.3333 23 66 H XỬ LÝ SỐ LIỆU TRỌNG LƢỢNG PHƠI TƢƠI THÍ NGHIỆM The SAS System 11:52 Wednesday, July 21, 2018 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values OLIGOCHITOSAN 0.5 1.5 TRONGLUONGTUOIPHOI 7.91 8.72 12 3.11 3.29 3.93 4.17 4.24 4.28 4.35 4.56 4.63 7.56 Number of observations 12 The SAS System 11:52 Wednesday, July 21, 2018 10 The ANOVA Procedure Dependent Variable: TRONGLUONGTUOIPHOI Source DF Model Error Corrected Total Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F 37.86402500 1.12820000 11 12.62134167 89.50 F 12.62134167 89.50 F 25.41666667 76.25 F 76.25000000 69 4.083333 25.41666667 76.25