Nhân giống và định tính alkaloid từ lá và mô sẹo cây cà gai leo solanum hainanense hance trong nuôi cấy in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: NHÂN GIỐNG VÀ ĐỊNH TÍNH ALKALOID TỪ LÁ VÀ MÔ SẸO CÂY CÀ GAI LEO SOLANUM HAINANENSE HANCE TRONG NUÔI CẤY IN VITRO KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: NÔNG NGHIỆP CBHD: ThS Nguyễn Trần Đông Phương SVTH: Nguyễn Thị Ngọc Hạnh MSSV: 1153010214 Khóa: 2011-2015 Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2015 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học trường Đại học Mở Tp.HCM tạo điều kiện cho em học tập rèn luyện môi trường học tập tốt Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học tận tình truyền đạt kiến thức suốt trình học tập Em xin chân thành gửi lời cám ơn thật sâu sắc đến cô Nguyễn Trần Đông Phương tận tình hướng dẫn em trình học việc phòng Công Nghệ Tế Bào tạo điều kiện tốt để em thực đề tài Em xin chân thành gửi lời cám ơn đến bạn, em học việc phòng thí nghiệm Công Nghệ Tế Bào giúp đỡ em công việc Cuối cùng, xin gửi lời cám ơn đến ba mẹ, anh chị bên cạnh động viên sống Tháng năm 2015 Nguyễn Thị Ngọc Hạnh Trang I CÁC CHỮ VIẾT TẮT BA 6-Benzylaminopurin cs Cộng ĐC Đối chứng Kin Kinetin MS Murashige & Skoog NAA α-naphthalen acetic acid Trang II DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình I Cây Cà gai leo Hình I Cấu trúc hóa học Auxin 11 Hình I Cấu trúc hóa học Cytokinin 12 Hình III Chồi tạo thành từ Cà gai leo in vitro môi trường MS bổ sung BA với nồng độ khác (5 tuần tuổi)………………………………31 Hình III Chồi tạo thành từ Cà gai leo in vitro môi trường MS bổ sung kinetin với nồng độ khác (5 tuần tuổi) 34 Hình III Chồi tạo thành từ đoạn thân Cà gai leo in vitro môi trường MS bổ sung BA với nồng độ khác (5 tuần tuổi) 37 Hình III Chồi tạo thành từ đoạn thân Cà gai leo in vitro môi trường MS bổ sung kinetin với nồng độ khác (5 tuần tuổi) 40 Hình III Mô sẹo từ Cà gai leo in vitro môi trường MS bổ sung NAA với nồng độ khác (5 tuần tuổi) 42 Hình III Mô sẹo từ Cà gai leo in vitro môi trường MS bổ sung mg/l NAA BA với nồng độ thay đổi (5 tuần tuổi) 45 Hình III Chồi từ mô sẹo Cà gai leo in vitro môi trường MS bổ sung kinetin với nồng độ thay đổi (7 tuần tuổi) 47 Hình III Dịch chiết từ Cà gai leo in vitro sau thêm giọt thuốc thử Wagner, Dragendorff, Mayer 48 Hình III Dịch chiết mô sẹo từ Cà gai leo in vitro sau thêm giọt thuốc thử Wagner, Dragendorff, Mayer 48 Trang III DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng II Ảnh hưởng nồng độ BA trình tạo chồi từ Cà gai leo in vitro 20 Bảng II Ảnh hưởng nồng độ kinetin trình tạo chồi từ Cà gai leo in vitro 21 Bảng II Ảnh hưởng nồng độ BA trình tạo chồi từ đoạn thân Cà gai leo in vitro 22 Bảng II Ảnh hưởng nồng độ kinetin trình tạo chồi từ đoạn thân Cà gai leo in vitro 23 Bảng II Ảnh hưởng nồng độ NAA trình tạo mô sẹo từ Cà gai leo in vitro 24 Bảng II Ảnh hưởng nồng độ BA, NAA trình tạo mô sẹo từ Cà gai leo in vitro 25 Bảng II Ảnh hưởng nồng độ kinetin trình tạo chồi từ mô sẹo Cà gai leo in vitro 26 Bảng III Ảnh hưởng nồng độ BA lên tạo chồi từ Cà gai leo in vitro……………………………………………………………………………… 30 Bảng III Ảnh hưởng nồng độ kinetin lên tạo chồi Cà gai leo in vitro 33 Bảng III Ảnh hưởng nồng độ BA lên tạo chồi từ đoạn thân Cà gai leo in vitro 36 Bảng III Ảnh hưởng nồng độ kinetin lên tạo chồi từ đoạn thân Cà gai leo in vitro 39 Bảng III Ảnh hưởng nồng độ NAA lên tạo mô sẹo từ Cà gai leo in vitro 41 Bảng III Ảnh hưởng nồng độ NAA, BA lên tạo mô sẹo từ Cà gai leo in vitro 44 Bảng III Ảnh hưởng nồng độ kinetin lên tạo chồi từ mô sẹo Cà gai leo in vitro 46 Trang IV MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU I.1 Hợp chất tự nhiên I.1.1 Tầm quan trọng hợp chất thứ cấp I.1.2 Sự phân loại hợp chất thứ cấp I.2 Alkaloid I.3 Giới thiệu Cà gai leo (Solanum hainanense Hance) I.3.1 Họ Cà (Solanaceae) I.3.2 Mô tả Cà gai leo I.3.3 Đặc điểm Cà gai leo I.3.4 Phân bố, sinh thái I.3.5 Thành phần hóa học I.4 Tác dụng dược tính Cà gai leo I.5 Các nghiên cứu Cà gai leo I.6 Nuôi cấy mô tế bào thực vật I.6.1 Lịch sử phát triển I.6.2 Khái niệm nuôi cấy mô I.6.3 Cơ cở khoa học kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật I.6.4 Vai trò chất điều hòa sinh trưởng thực vật nuôi cấy mô 10 I.6.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình nuôi cấy mô 13 I.7 Mô sẹo 15 I.8 Phát sinh hình thái chồi bất định 15 Chương II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 18 Trang V II.1 Vật liệu 18 II.1.1 Địa điểm thời gian thực khóa luận tốt nghiệp 18 II.1.2 Đối tượng nghiên cứu 18 II.2 Điều kiện nuôi cấy in vitro Cà gai leo 18 II.2.1 Thiết bị dụng cụ 18 II.2.2 Môi trường nuôi cấy 18 II.2.3 Điều kiện nuôi cấy 19 II.2.4 Các hoá chất pha môi trường nuôi cấy thực vật 19 II.3 Phương pháp nghiên cứu 19 II.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát khả tạo chồi từ Cà gai leo in vitro môi trường MS có bổ sung BA với nồng độ khác 19 II.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả tạo chồi từ Cà gai leo in vitro môi trường MS có bổ sung kinetin với nồng độ khác 20 II.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát khả tạo chồi từ đoạn thân Cà gai leo in vitro môi trường MS có bổ sung BA với nồng độ khác 21 II.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát khả tạo chồi từ đoạn thân Cà gai leo in vitro môi trường MS có bổ sung kinetin với nồng độ khác 22 II.3.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát khả tạo mô sẹo từ Cà gai leo in vitro môi trường MS có bổ sung NAA với nồng độ khác 23 II.3.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát khả tạo mô sẹo từ Cà gai leo in vitro môi trường MS có bổ sung NAA, BA với nồng độ khác 24 Trang VI II.3.7 Thí nghiệm Khảo sát khả tạo chồi từ mô sẹo Cà gai leo in vitro môi trường nuôi cấy bổ sung kinetin 25 II.3.8 Thí nghiệm 8: Định tính alkaloid từ lá, mô sẹo Cà gai leo in vitro 26 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 III.1 Kết 29 III.1.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát khả tạo chồi từ Cà gai leo in vitro môi trường MS có bổ sung BA với nồng độ khác 29 III.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả tạo chồi từ Cà gai leo in vitro môi trường MS có bổ sung kinetin với nồng độ khác 32 III.1.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát khả tạo chồi từ đoạn thân Cà gai leo in vitro môi trường MS có bổ sung BA với nồng độ khác 35 II.1.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát khả tạo chồi từ đoạn Cà gai leo in vitro môi trường MS có bổ sung kinetin với nồng độ khác 38 III.1.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát khả tạo mô sẹo từ Cà gai leo in vitro môi trường MS có bổ sung NAA với nồng độ khác 41 III.1.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát khả tạo mô sẹo từ Cà gai leo in vitro môi trường MS có bổ sung NAA, BA với nồng độ khác 43 III.1.7 Thí nghiệm Khảo sát khả tạo chồi từ mô sẹo Cà gai leo in vitro môi trường nuôi cấy bổ sung kinetin 46 III.1.8 Thí nghiệm 8: Định tính alkaloid từ lá, mô sẹo Cà gai leo in vitro 47 III.2 Thảo luận 48 Trang VII Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 53 IV.1 Kết luận 53 IV.2 Đề nghị 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC i Trang VIII ĐẶT VẤN ĐỀ Nhiều kỷ qua, loài người biết sử dụng thực vật để cung cấp nguồn carbohydrate, protein, chất béo bữa ăn ngày Hơn nữa, biết sử dụng hợp chất tự nhiên để điều chế thuốc chữa bệnh, thuốc trừ sâu sinh học chất phụ gia thực phẩm có giá trị Các hợp chất tự nhiên hình thành với lượng nhỏ (nhỏ 1% khối lượng khô) Chúng xem sản phẩm hóa học thực vật với môi trường hay bảo vệ chống lại vi sinh vật động vật [21] Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), có đến 80% dân số sử dụng thực vật làm thuốc, để chữa bệnh chăm sóc sức khỏe Tuy nhiên, tác động từ việc khai thác thuốc bừa bãi người biến đổi khí hậu đe dọa đến nguồn dược liệu sẵn có tự nhiên Vì vậy, vấn đề đặt cần tìm phương pháp để bảo đáp ứng đầy đủ nguồn dược liệu ngày gia tăng tương lai [22] Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đường tiềm để cung cấp nguyên liệu cần thiết Việc áp dụng nuôi cấy tế bào mô thực vật có ưu điểm bật như: Kiểm soát dịch bệnh trồng, loại cá thể nhiễm bệnh hay mang mầm bệnh Kiểm soát chất lượng giống thông qua kiểm soát kiểu gen giống đem vào sản xuất Kiểm soát toàn kỹ thuật từ khâu nhân giống đến khâu thu hoạch Tạo đồng loạt giống sản phẩm cuối Sự đồng loạt giúp cho giới hóa khâu trồng trọt thu hoạch Do suất lao động tăng lên, chất lượng sản phẩm đồng nhất, tạo điều kiện thuận lợi cho khâu tiêu thụ chế biến [9] Có thể sản xuất hợp chất thứ cấp theo yêu cầu với số lượng thấp với số lượng lớn mà phương pháp công nghiệp thương mại sản xuất Có thể sản xuất hợp chất khác hợp chất yêu cầu [2] Cà gai leo Solanum hainanense Hance, thuộc họ Cà Solanaceae, có tên gọi Solanum procumbens Lour, cà gai dây, cà vạnh, cà quýnh, cà quánh, cà lù, gai cườm, chẻ nam (Tày), Trap khar (Campuchia), Blou xit (Lào), B’rongoon (Ba Na) [1] Ở rễ Cà gai leo có cholesterol, β-sitosterol, lanosterol, dihydro- Trang [13] Lê Văn Truyền, Vũ Khánh, Lê Quan Nghiệm (1999-2000), Nghiên cứu dạng bào chế nâng cao chất lượng thuốc cổ truyền phục vụ sức khỏe cộng đồng, Báo cáo tổng kết đề tài KHCN cấp nhà nước, Trường Đại học Y-Dược thành phố Hồ Chí Minh, mã số: KHCN-11-14 [14] Bùi Trang Việt (2000), Sinh lý thực vật đại cương, phần II: Phát triển, Nhà xuất Đại học Quốc gia, Tp Hồ Chí Minh [15] Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp, (2009), Công nghệ sinh học tế bào tập 2- Công nghệ sinh học, Nhà xuất giáo dục Việt Nam [16] Hoàng Minh Tuấn, Nguyễn Quang Thạch, Vũ Quang Sáng, (2006), Giáo trình Sinh lý thực vật, Nhà xuất Hà Nội, trang 254-255 Tài liệu tiếng Anh: [17] Klocke A J., Balandrin F.M., Wurtele E.S., Bollinger W.H (1985), Natural Plant Chemicals: Sources of Industrial and Medicinal Materials, Science 228:p11541160 [18] Milesi S., Bourgaud F., Gravot A., Gontier E (2001), Production of plant secondary metabolites: a historical perspective, Plant Science 161: pp 839-851 [19] Nguyen Hoang Loc, Nguyen Huu Thuan Anh, Doan Huu Nhat Binh, Moon-Sik Yang, Tae-Geum Kim (2000), Production of glycoalkaloid from callus cultures of Solanum hainanense Hance, Journal of Plant Biotechnology, 37, pp 96-101 [20] Nguyen Hoang Loc, Huynh Van Kiet (2001), Microproduction of Solanum hainanese Hance, Annals of Biological Research, 2(2), pp 394-398 [21] Wink M (1999), Biochemistry of plant secondary metabolism Annual plant reviews, vol 2, Sheffield Academic Press [22] Zhao J., Verpoorte (2007), “Manipulating indole alkaloid production by Catharanthus roseus crll culture in bioreactors: frombiochemical processing to metabolic engineering”, Phytochem Rev 6, pp 435-457 Trang 56 Tài liệu Internet: [23] www.uic.edu/pharmacy/coures/phar331/PHAR331.00.doc Dr.A.D.Kinghorn, PHAR331-Fundamentals of Drug Action I-Lectures on Natural Products Trang 57 PHỤ LỤC I Thành phần môi trường MS (Murashige Skoog) BẢNG 11: THÀNH PHẦN MUỐI KHOÁNG CƠ BẢN (mg.l-1) Skoog I Skoog II Skoog III NH4NO3 1650,00 KNO3 1900,00 KH2PO4 170,00 MgSO4.7H2O 370,00 CaCl2.2H2O 440,00 Na2EDTA 37,30 FeSO4.7H2O 27,80 Mn2SO4.4H2O 22,30 H3BO3 6,20 ZnSO4.7H2O 8,60 KI 0,83 Na2MoO4.2H2O 0,25 CuSO4.5H2O 0,025 CoCl2.6H2O 0,025 BẢNG 12: THÀNH PHẦN VITAMIN CỦA MOREL (mg.l-1) Pirydoxine (B6) 1,00 Biotin (II) 0,01 Vitamin Meso-inositol 100,00 Morel’s Nicotinic Acid (P.P) 1,00 Thiamin-HCl (B1) 1,00 Pantotheate-Ca 1,00 Trang i Phân tích thống kê ANOVA Kết xử lí thống kê thí nghiệm khảo sát khả tạo chồi từ cà gai leo in vitro môi trường MS có bổ sung BA với nồng độ khác SỐ CHỒI/MẪU cv = 15,10 % Trang ii CHIỀU CAO CHỒI cv = 27,69 % Trang iii Kết xử lí thống kê thí nghiệm khảo sát khả tạo chồi từ cà gai leo in vitro môi trường MS có bổ sung kinetin với nồng độ khác SỐ CHỒI/MẪU cv= 9,32% Trang iv CHIỀU CAO CHỒI cv = 10,91% Trang v Kết xử lý thống kê khảo sát khả tạo chồi từ đoạn thân Cà gai leo in vitro môi trường MS có bổ sung BA vơi nồng độ khác SỐ CHỒI/MẪU cv = 17,97 % Trang vi CHIỀU CAO CHỒI cv = 14,31% Trang vii Kết xử lý thống kê khảo sát khả tạo chồi từ đoạn Cà gai leo in vitro môi trường MS có bổ sung kinetin với nồng độ khác SỐ CHỒI/MẪU cv = 7,55% Trang viii CHIỀU CAO CHỒI cv =9,95% Kết xử lý thống kê khảo sát khả tạo mô sẹo từ Cà gai leo in vitro môi trường MS có bổ sung NAA với nồng độ khác Trang ix KHỐI LƯỢNG SẸO cv = 19.54% Trang x Kết xử lý thống kê khảo sát khả tạo mô sẹo từ Cà gai leo in vitro môi trường MS có bổ sung NAA, BA với nồng độ khác KHỐI LƯỢNG SẸO cv = 4,69% Trang xi Kết xử lý thống kê khảo sát khả hình thành chồi từ mô sẹo Cà gai leo in vitro SỐ CHỒI/MẪU cv = 16,71% CHIỀU CAO CHỒI Trang xii cv =9,49% Trang xiii ... đoạn Cà gai leo in vitro Vật liệu thí nghiệm: Đoạn thân Cà gai leo in vitro sau tuần nuôi cấy môi trường nuôi cấy MS Môi trường nuôi cấy: Môi trường MS bổ sung kinetin theo nồng độ khác Mô tả... vật nhằm tìm môi trường tốt tạo chồi từ đoạn thân Cà gai leo in vitro Vật liệu thí nghiệm: Đoạn thân Cà gai leo in vitro sau tuần nuôi cấy môi trường nuôi cấy MS Môi trường nuôi cấy: Môi trường... gai leo in vitro Vật liệu thí nghiệm: Lá Cà gai leo in vitro sau tuần nuôi cấy môi trường nuôi cấy MS Môi trường nuôi cấy: Môi trường MS bổ sung kinetin theo nồng độ khác Mô tả thí nghiệm: Cấy chuyển