Nghiên cứu tạo tấm tế bào gốc trung mô mô cuống rốn người hướng đến ứng dụng điều trị bệnh tim

SỞ NƠNG NGHIỆP VÀ PTNT CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Độc lập – Tự – Hạnh phúc TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NGHIÊN CỨU TẠO TẤM TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ MÔ CUỐNG RỐN NGƯỜI HƯỚNG ĐẾN ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ BỆNH TIM Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Trung tâm Cơng nghệ Sinh học Tp HCM Chủ nhiệm nhiệm vụ: TS Phạm Lê Bửu Trúc Thành phố Hồ Chí Minh – 2020 SỞ NƠNG NGHIỆP VÀ PTNT CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Độc lập – Tự – Hạnh phúc TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NGHIÊN CỨU TẠO TẤM TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ MÔ CUỐNG RỐN NGƯỜI HƯỚNG ĐẾN ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ BỆNH TIM (Đã chỉnh sửa theo kết luận Hội đồng nghiệm thu ngày 30/06/2020) Chủ nhiệm nhiệm vụ: TS Phạm Lê Bửu Trúc Cơ quan chủ trì nhiệm vụ PGS TS Dương Hoa Xơ Thành phố Hồ Chí Minh-2020 SỞ NƠNG NGHIỆP VÀ PTNT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ SINH HỌC CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc ., ngày tháng năm 20 BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KH&CN I THÔNG TIN CHUNG Tên nhiệm vụ: Nghiên cứu tạo tế bào gốc trung mô mô cuống rốn người hướng đến ứng dụng điều trị bệnh tim Chủ nhiệm nhiệm vụ: Họ tên: Phạm Lê Bửu Trúc Ngày, tháng, năm sinh: 10/10/1982 Nam/ Nữ: Nữ Học hàm, học vị: Tiến sĩ Chức danh khoa học: Chức vụ Điện thoại: Tổ chức: Nhà riêng: Mobile: 0856554655 buutruc@gmail.com Fax: .E-mail: Tên tổ chức công tác: Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp HCM Địa tổ chức: 2374 QL1, Khu phố 2, Phường Trung Mỹ Tây, Q.12, Tp.HCM Địa nhà riêng: B3-05-04, Block B3, Chung cư The Art, Phước Long B, Q 9, Tp.HCM Tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Tên tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Trung tâm Cơng nghệ Sinh học Tp Hồ Chí Minh Điện thoại: (84-28) 37 153 792 Fax: (84-28) 38 91 69 97 E-mail: ttcnsh.snn@tphcm.gov.vn Website: https://www.hcmbiotech.com.vn/vi/ Địa chỉ: 2374 Quốc lộ 1, Khu phố 2, Phường Trung Mỹ Tây, Quận 12, Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam Họ tên thủ trưởng tổ chức: PGS TS DƯƠNG HOA XÔ Số tài khoản: 3713.0.1007645 Kho bạc Nhà nước/Ngân hàng: Kho bạc Nhà nước Thành phố Hồ Chí Minh Tên quan chủ quản đề tài : Sở Nông nghiệp Phát triển Nơng thơn Tp HCM II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN Thời gian thực nhiệm vụ : - Theo Hợp đồng ký kết : từ tháng 01 năm 2018 đến tháng 12 năm 2019 - Thực tế thực : từ tháng 01 năm 2018 đến tháng 06 năm 2020 - Được gia hạn (nếu có) : - Lần từ tháng 01 năm 2020 đến tháng 06 năm 2020 Kinh phí sử dụng kinh phí : a) Tổng số kinh phí thực : 750 tr.đ, đó: + Kính phí hỗ trợ từ ngân sách khoa học : 750 tr.đ + Kinh phí từ nguồn khác : tr.đ b) Tình hình cấp sử dụng kinh phí từ nguồn ngân sách khoa học : Số TT Theo kế hoạch Thời gian Kinh phí (Tháng, năm) (Tr.đ) 01/2018 350 12/2018 01/2019400 12/2019 Thực tế đạt Thời gian Kinh phí (Tháng, năm) (Tr.đ) 01/2018 – 349,547460 12/2018 01/2019366,034820 12/2019 Ghi (Số đề nghị toán) c) Kết sử dụng kinh phí theo khoản chi: Đối với đề tài: Đơn vị tính: Triệu đồng Số TT Nội dung khoản chi Trả công lao động (khoa học, phổ thông) Nguyên, vật liệu, lượng Thiết bị, máy móc Xây dựng, sửa chữa nhỏ Chi khác Tổng cộng Theo kế hoạch Tổng NSKH 184,8035 Thực tế đạt Tổng NSKH 184,8035 Nguồn khác 222,32758 222,32758 Nguồn khác 535,208 535,208 490,3497 490,3497 0 0 0 0 0 0 29,9885 750 29,9885 750 0 2,905 715,58228 2,905 715,58228 0 Đối với dự án: Đơn vị tính: Triệu đồng Số TT Nội dung khoản chi Theo kế hoạch Tổng NSKH Nguồn khác Thực tế đạt Tổng NSKH Nguồn khác Thiết bị, máy móc mua Nhà xưởng xây dựng mới, cải tạo Kinh phí hỗ trợ cơng nghệ Chi phí lao động Ngun vật liệu, lượng Thuê thiết bị, nhà xưởng Khác Tổng cộng Các văn hành q trình thực đề tài/dự án: Số TT Số, thời gian ban hành văn Số 01/QĐ-CNSH ngày 09/01/2018 Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp HCM Số 44/HĐGVCNSH ngày 28/03/2018 Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp HCM Số 44a/PLHĐGVCNSH ngày 28/03/2018 Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp HCM Số 86/QĐ-CNSH ngày 25/06/2019 Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp HCM Số 36/2019/HĐSNN ngày 09/12/2019 Sở Nông nghiệp PTNT Tp.HCM Số 349/QĐ-SNN ngày 28/10/2019 Sở Nông nghiệp PTNT Tp.HCM Tên văn Quyết định việc thành lập Hội đồng xét duyệt đề cương chi tiết đề tài sở cấp Trung tâm năm 2018 Hợp đồng giao việc thực đề tài cấp sở năm 2018 Đề tài “Nghiên cứu tạo tế bào gốc trung mô mô cuống rốn người hướng đến ứng dụng điều trị bệnh tim” Phụ lục hợp đồng giao việc thực đề tài cấp sở năm 2018 Đề tài “Nghiên cứu tạo tế bào gốc trung mô mô cuống rốn người hướng đến ứng dụng điều trị bệnh tim” Quyết định việc thành lập Hội đồng đánh giá tiến độ nghiệm thu nhiệm vụ khoa học công nghệ năm 2018 Nhiệm vụ: “Nghiên cứu tạo tế bào gốc trung mô mô cuống rốn người hướng đến ứng dụng điều trị bệnh tim” Hợp đồng thực nhiệm vụ khoa học công nghệ cấp sở “Nghiên cứu tạo tế bào gốc trung mô mô cuống rốn người hướng đến ứng dụng điều trị bệnh tim” Quyết định việc giao tiếp tục thực nhiệm vụ khoa học cấp sở chuyển tiếp từ năm 2016, 2017, 2018 sang năm 2019, 2020, 2021 Đơn vị Trung tâm Công nghệ Sinh học Nhiệm vụ: “Nghiên cứu tạo Ghi Số 149/QĐ-CNSH ngày 10/06/2020 Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp HCM tế bào gốc trung mô mô cuống rốn người hướng đến ứng dụng điều trị bệnh tim” Quyết định việc thành lập Hội đồng khoa học nghiệm thu nhiệm vụ khoa học công nghệ cấp Trung tâm Nhiệm vụ: “Nghiên cứu tạo tế bào gốc trung mô mô cuống rốn người hướng đến ứng dụng điều trị bệnh tim” Tổ chức phối hợp thực nhiệm vụ: Số TT Tên tổ chức đăng ký theo Thuyết minh Tên tổ chức tham gia thực Nội dung tham gia chủ yếu Sản phẩm chủ yếu đạt Ghi chú* - Lý thay đổi (nếu có): Cá nhân tham gia thực nhiệm vụ: (Người tham gia thực đề tài thuộc tổ chức chủ trì quan phối hợp, không 10 người kể chủ nhiệm) Số TT Tên cá nhân đăng ký theo Thuyết minh Tên cá nhân tham gia thực TS Phạm Lê Bửu Trúc TS Phạm Lê Bửu Trúc TS Nguyễn Trọng Bình TS Nguyễn Trọng Bình Nội dung tham gia - Hồn thiện đề cương chi tiết - Chủ trì việc chuẩn bị giá thể nguồn tế bào gốc cuống rốn người - Chủ trì việc tạo tế bào gốc cuống rốn hướng đến ứng dụng điều trị bệnh tim mạch - Chủ trì việc đánh giá đặc tính tế bào - Báo cáo tiến độ - Tổng hợp viết báo cáo kết nghiệm thu đề tài - Chuẩn bị giá thể nguồn tế bào gốc cuống rốn người - Tạo tế bào gốc cuống rốn hướng đến ứng dụng điều trị bệnh tim mạch Sản phẩm chủ yếu đạt - Thuyết minh - Giá thể Col-T - Phân lập tế bào hUC-MSC - Tấm tế bào BIT - Tổng kết đánh giá đặc tính BIT - Báo cáo tiến độ - Báo cáo nghiệm thu - Màng Collagen làm nguyên liệu tạo giá thể Col-T - Kết biệt hoá phân tích marker - Tấm tế bào BIT Ghi chú* ThS Phạm Nguyễn Thanh Thủy CN Trần Nguyễn Tùng Linh ThS Phạm Nguyễn Thanh Thủy - Chuẩn bị trì nguồn tế bào gốc cuống rốn người - Nguồn tế bào sử dụng nghiên cứu Chuyển cơng tác tháng 6/2019 Chuyển nhóm đề tài, chuyển công tác sang Tổ nuôi ĐV CN Trần Huỳnh Như CN Hồ Nguyệt Minh - Đánh giá mức độ nhiễm khuẩn: Đổ đĩa thạch, cấy trải, đánh giá mức độ nhiễm Candida albicans - Đánh giá bề mặt tế bào: Chụp SEM mẫu màng collagen màng Col-T - Đánh giá đặc tính học tế bào: Đánh giá độ bền kéo màng collagen - Đánh giá phân hủy giá thể Col-T huyết tương: Kiểm tra tính tan mẫu ngày - Đánh giá độc tính giá thể sau xử lý: Đánh giá độc tính qua tiếp xúc - Đánh giá tế bào sau nuôi cấy giá thể in vitro: Đánh giá biểu marker tế bào gốc sau cấy lên giá thể - Đánh giá khả bám dính tăng sinh tế bào giá thể: Đánh giá lượng DNA tổng mẫu Collagen membrane-Cells - Đánh giá mức độ nhiễm khuẩn: Đổ đĩa thạch, cấy trải, đánh giá mức độ nhiễm tổng khuẩn - Đánh giá bề mặt tế bào: Chụp SEM - Đánh giá mức độ nhiễm Candida albicans - Kết ghi nhận hình ảnh mẫu màng collagen màng Col-T - Dữ liệu độ bền kéo màng collagen - Kết kiểm tra tính tan mẫu ngày - Kết đánh giá độc tính qua tiếp xúc - Kết đánh giá biểu marker tế bào gốc sau cấy lên giá thể - Kết định lượng DNA tổng mẫu Collagen membrane-Cells - Đánh giá mức độ nhiễm tổng khuẩn - Kết ghi nhận hình ảnh mẫu thí nghiệm sau 18 CN Trần Thị Ngọc Xuân mẫu thí nghiệm sau 18 - Đánh giá đặc tính học tế bào: Đánh giá độ bền kéo giá thể - Đánh giá phân hủy giá thể Col-T huyết tương: Kiểm tra tính tan mẫu ngày 20 - Đánh giá độc tính giá thể sau xử lý với dung dịch: Đánh giá độc tính qua dịch thể mốc - Đánh giá tế bào sau cấy lên giá thể in vitro: Biệt hoá tế bào gốc sau cấy lên giá thể thành nguyên bào xương - Đánh giá khả bám dính tăng sinh tế bào giá thể: Đánh giá lượng DNA tổng mẫu 0h-Cells - Đánh giá mức độ nhiễm khuẩn: Đổ đĩa thạch, cấy trải, đánh giá mức độ nhiễm Pseudomonas aeruginosa - Đánh giá bề mặt tế bào: Chụp SEM mẫu thí nghiệm sau 72 - Đánh giá đặc tính học tế bào: Đánh giá độ bền kéo tế bào - Đánh giá phân hủy giá thể Col-T huyết tương: Kiểm tra tính tan mẫu ngày 10 - Đánh giá độc tính giá thể sau xử lý: Đánh giá độc tính qua dịch thể mốc giờ, 24 - Đánh giá tế bào sau nuôi cấy - Dữ liệu độ bền kéo giá thể - Kết kiểm tra tính tan mẫu ngày 20 - Kết đánh giá độc tính qua dịch thể mốc - Kết biệt hoá tế bào thành nguyên bào xương - Kết định lượng DNA tổng mẫu 0h-Cells - Đánh giá mức độ nhiễm Pseudomonas aeruginosa - Kết ghi nhận hình ảnh mẫu thí nghiệm sau 72 - Dữ liệu độ bền kéo tế bào - Kết kiểm tra tính tan mẫu ngày 10 - Kết đánh giá độc tính qua dịch thể mốc giờ, 24 - Kết biệt hoá tế bào thành tế bào sụn, mỡ - Kết định lượng DNA tổng mẫu Col-TCells giá thể in vitro: Biệt hoá tế bào gốc sau cấy lên giá thể thành tế bào sụn, mỡ - Đánh giá khả bám dính tăng sinh tế bào giá thể: Đánh giá lượng DNA tổng mẫu Col-T-Cells Tình hình hợp tác quốc tế: Số TT Theo kế hoạch (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia ) Thực tế đạt (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia ) Ghi chú* - Lý thay đổi (nếu có): Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị: Số TT Theo kế hoạch (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm) Thực tế đạt (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm) Ghi chú* - Lý thay đổi (nếu có): Tóm tắt nội dung, công việc chủ yếu: Số TT Các nội dung, công việc chủ yếu (Các mốc đánh giá chủ yếu) Thu nhận xử lý màng ối để giá thể Thời gian (Bắt đầu, kết thúc - tháng … năm) Theo kế Thực tế đạt hoạch 1-5/2018 1-5/2018 Người, quan thực TS Phạm Lê Bửu Trúc TS Nguyễn Trọng Bình Phân lập nuôi cấy tế bào gốc trung mô mô cuống rốn người 4-10/2018 4-10/2018 TS Phạm Lê Bửu Trúc TS Nguyễn Trọng Bình Cấy tế bào gốc trung mô mô cuống rốn lên giá thể xử lý 10-12/2018 10-12/2018 ThS Phạm Nguyễn Thanh Thủy TS Phạm Lê Bửu Trúc TS Nguyễn Trọng Bình Đánh giá mức độ nhiễm khuẩn 01-03/2019 01-03/2019 TS Phạm Lê Bửu Trúc Kỹ thuật viên Đánh giá bề mặt tế bào 04-05/2019 04-05/2019 TS Phạm Lê Bửu Trúc TS Nguyễn Trọng Bình Kỹ thuật viên Đánh giá đặc tính học tế bào 06-07/2019 06-07/2019 TS Phạm Lê Bửu Trúc Kỹ thuật viên Đánh giá phân huỷ giá thể ColT huyết tương 08-09/2019 08-09/2019 TS Phạm Lê Bửu Trúc Kỹ thuật viên Đánh giá độc tính giá thể sau xử lý 09-10/2019 09-10/2019 TS Phạm Lê Bửu Trúc Kỹ thuật viên Đánh giá tế bào sau nuôi cấy giá thể in vitro 10-11/2019 10-11/2019 TS Phạm Lê Bửu Trúc TS Nguyễn Trọng Bình Kỹ thuật viên 10 Đánh giá khả bám dính tăng sinh tế bào giá thể 09-11/2019 09-11/2019 TS Phạm Lê Bửu Trúc Kỹ thuật viên 11 Tổng hợp viết báo cáo nghiệm thu 12/2019 12/2019 TS Phạm Lê Bửu Trúc - Lý thay đổi (nếu có): * Kết nhuộm hoá tế bào miễn (Immunocytochemistry-ICC) tế bào 5Ds 5Ds-CD90(+) 5Ds-CD105(+) 5Ds-CD44(+) 5Ds-CD73(+) 5Ds-CD14(-) 5Ds-CD45(-) 5Ds-CD34(-) 5Ds-HLADR(-) Hình 3.36 Dịng 5Ds biểu dương tính với CD90, CD105, CD44, CD73 âm tính với CD14, CD34, CD45, HLA-DR, đặc trưng cho profile marker đa số tế bào gốc trung mơ Từ kết phân tích cho thấy dòng tế bào 5Ds giữ đặc tính tế bào gốc trung mơ 3.2 Thảo luận Các tế bào ứng viên phân lập biểu đầy đủ đặc tính tế bào gốc trung mơ Các tế bào có dạng hình thoi, có khả bám dính tốt bề mặt dụng cụ ni (Hình 3.4), có khả biệt hố thành tế bào có nguồn gốc từ lớp trung bì (Hình 3.6, 3.7, 3.8) phân tích marker kit BD tế bào ứng viên cho thấy chúng dương tính với CD90, CD105, CD73 (positive coctail) âm tính với CD45, CD34, CD11b, CD19 HLA-DR (negative cocktail) (Hình 3.5) Tuy nhiên, phần trăm biểu biện CD105 thấp so với CD90 CD73 (93,3% so với 99% 94,2%) Đến nay, hồ sơ biểu dấu hiệu bề mặt tế bào gốc trung mô từ mô cuống rốn nghiên cứu rộng rãi, đặc biệt CD105 Theo ISCT, CD105 dấu hiệu bề mặt cần thiết để xác định MSC [41]; nhiên, có số liệu khác mâu thuẫn với Trong nghiên cứu Bongso A El Omar R cộng 38 sự, họ chứng minh CD105 biểu bề mặt hUC-MSC [42, 43], biểu trì q trình ni cấy dài hạn (ít 16 lần cấy chuyền) [44] Tuy nhiên, vài nghiên cứu lại chứng minh hUC-MSC không biểu CD105 [45] biểu đến lần cấy chuyền thứ [46] Việc giảm biểu dấu hiệu bề mặt đặc trưng cho tế bào gốc trung mô (CD73, CD90 CD105) hUC-MSC xảy điều kiện thiếu máu cục tế bào bị thiếu oxy [47] Việc sử dụng tế bào hUC-MSCs làm nguyên liệu cho chế tạo tế bào mang lại nhiều ưu điểm hUC-MSC biểu HLA thấp làm tăng khả sử dụng ghép đồng loại, tiết nhân tố dinh dưỡng nhiều BM-MSC [9] Thêm vào đó, nghiên cứu Mitsuyoshi Nakao cộng cho thấy hUC-MSC có khả tiết cytokine có lợi cho việc cấy ghép phục hồi mô tổn thương HGF, TGF-b1, IL-6, IL-10 PGE2 [48] Ngoài ra, dòng tế bào sử dụng điều trị số bệnh lý người cải thiện tình trạng bệnh lý đáng kể [7,8] Như vậy, việc sử dụng hUC-MSC nghiên cứu giúp tăng thêm đặc tính có lợi tế bào tạo thành Môi trường nuôi cấy tế bào thành tố quan trọng trình tạo tế bào ảnh hưởng đến chất lượng tế bào tạo thành Cho đến nay, FBS chấp nhận dùng nuôi cấy, sản xuất tế bào quy mô lâm sàng [49] Tuy nhiên, môi trường chứa huyết tương dễ có nguy nhiễm bẩn từ prion, virus tác nhân gây bệnh kích thích phản ứng miễn dịch vật chủ [50] Vì vậy, nghiên cứu này, chúng tơi sử dụng môi trường không huyết hãng BioIND nên tế bào tạo thành có tính an tồn cho cấy ghép Trong tự nhiên, màng ối đóng vai trò quan trọng giúp bảo vệ thai nhi khỏi tác động nguy hiểm Để làm việc này, màng ối cấu tạo đặc biệt cho tạo thành cấu trúc dai, có tính đàn hồi cao Điều cho thấy giá thể ứng viên tiềm việc tạo tế bào ghép lên tim tim quan có hoạt động co bóp liên tục nên “mảnh vá” cho tim nên vật 39 liệu có tính đàn hồi tốt Chính vậy, màng ối lựa chọn để xử lý tạo giá thể Col-T dùng nghiên cứu Mẫu thô màng thai nhi thu nhận gồm nhiều lớp lớp biểu mô màng ối (Amnion Epithelium-AE), trung mô màng ối (Amnion Mesenchyme-AM), màng Spongiosa (S), trung mô màng đệm (Chronic Mesenchyme-CM), Trophoblast (TR) màng rụng (Decidua-D) Các lớp màng chứa nhiều loại tế bào khác Để thu màng collagen vô bào, tế bào phải xử lý loại bỏ Hình 3.11 cho thấy sau xử lý loại bỏ tế bào khỏi màng ối thu màng collagen vơ bào Trước đây, có số công bố sử dụng màng ối để ghép bệnh nhãn khoa [51, 52] cho kết khả quan màng ối có khả thúc đẩy tăng sinh tế bào gốc nội mô limbal [53-55] Ngồi ra, màng ối cịn sử dụng làm giảm phản ứng viêm cấp tính phẫu thuật dao mổ laser, bỏng hóa chất, bỏng nhiệt che phủ khuyết tật biểu mô sau hoại tử sau phẫu thuật vùng đầu cổ [56]; giúp điều trị bỏng mặt vết thương với kết đầy hứa hẹn [57], sử dụng để tái tạo biệt hóa tế bào thần kinh [58] Tuy vậy, nhà khoa học cho thân màng ối khơng đủ để có trì kết điều trị tốt ghép, việc ghép thêm tế bào gốc limbal cần thiết Do đó, việc tạo tế bào gốc màng ối có giá trị cho điều trị cấy ghép Màng ối vô bào (màng collagen) có cấu tạo bề mặt trơn, nhẵn cho khả bám dính tế bào yếu nên khó để tạo tế bào Vì vậy, việc xử lý màng collagen để tạo thành giá thể Col-T cho phép tế bào bám dính tốt giúp gia cố độ đàn hồi màng quan trọng việc tạo thành tế bào gốc trung mơ có độ đàn hồi tốt Hình 3.12 cho thấy sau xử lý nhìn bên ngồi màng collagen giá thể Col-T khơng khác biệt nhiều hình chụp SEM cho thấy cấu trúc giá thể Col-T khác so với màng collagen (Hình 3.13, 3.14) Khi so sánh khả bám dính, hUC-MSCs cho thấy có khả bám dính tăng sinh tốt giá thể Col-T so với màng Collagen chưa xử lý 40 Kết chụp SEM cho thấy sau 18 tế bào hUC-MSC bám dính đầy giá thể Col-T so với màng Collagen (Hình 3.15) Kết định lượng DNA tổng cho thấy khả bám dính tăng sinh tế bào giá thể Col-T sau 72 (Hình 3.16) Tuy phương pháp sử dụng có khác kết kết Mitsuyoshi Nakao CS có xu hướng tế bào có bám dính tăng sinh sau dùng để tạo tế bào [48] Như vậy, việc xử lý thành công việc giúp tế bào bám dính tăng sinh giá thể Việc cấy ghép scaffold dễ gây viêm thơng thường mơ loại tế bào có tính tương hợp tốt nhất, không gây viêm, cấu trúc phù hợp thân thiện với tự nhiên [59, 60] Tấm tế bào nghiên cứu tạo dựa giá thể Col-T có nguồn gốc từ màng ối vơ bào nên hồn tồn đáp ứng điểm Hiện nay, số nghiên cứu công bố tạo tế bào từ đĩa tách nhiệt [48, 61] Mặc dù, tế bào giúp khắc phục việc làm lớp ECM chứa protein nhân tố sinh trưởng tách tế bào enzyme để tiêm truyền, tế bào tạo dễ bị tác động ngoại lực, khơng có độ bền học cao liên kết tế bào riêng lẻ Trong khi, tế bào nghiên cứu ưu điểm không làm lớp ECM tương tự tế bào lớp đơn, chúng cịn có độ bền học cao tiện lợi dùng làm “mảnh vá” mang tế bào gốc cấy ghép giúp tái tạo mơ tổn thương cho mơ ln có chuyển động mơ tim, mạch máu v.v…và dùng để che phủ, thúc đẩy trình lành hoá vết thương tốt Tấm tế bào tế bào lớp dễ dàng cấy vào bệnh nhân mà không cần khâu protein ECM cịn lại tế bào hoạt động chất keo dính mơ Một ưu điểm khác tế bào nghiên cứu nguồn tế bào chọn sử dụng tế bào hUC-MSC MSC biết đến có khả giúp tăng cường hình thành mạch ức chế hệ thống miễn dịch thông qua việc tiết cytokine VEGF, HGF, PGE2, TGF-b, IL-6 hay IL-10 [62-64] 41 Trong công bố gần đây, Kim CS rõ tế bào hUC-MSC biểu thấp HLA-DR [61] Nghiên cứu cho kết tương tự, tế bào hUC-MSC sau cấy lên giá thể ngày (tế bào 5Ds) âm tính hồn tồn với marker HLA-DR (Hình 3.35) Từ cho thấy tế bào chế tạo nghiên cứu có tiềm sử dụng cho cấy ghép đồng lồi Tuy có số nghiên cứu đánh giá khả cận tiết cytokine tế bào [48, 62, 63], chưa thấy có cơng bố đánh giá tính gốc hUC-MSC sau dùng để tạo tế bào, nghiên cứu tiến hành đánh giá lại tính gốc tế bào sau cấy lên giá thể Col-T nhằm tìm hiểu thêm liệu có ảnh hưởng không tốt giá thể đến tế bào cấy đánh giá tính an tồn tế bào tạo thành Kết cho thấy tế bào sau cấy lên giá thể ngày giữ đặc tính dịng tế bào gốc ban đầu (Hình 3.32 đến Hình 3.36) Hình thái tế bào quan tâm theo dõi nghiên cứu Các hUC cấy lên giá thể sau 18h có hình dạng trịn so với hUC bám dính bình roux 18 sau cấy, tế bào bắt đầu trải bề mặt bình ni mật độ cấy lên giá thể cao (106 tế bào/1x1cm2) nên tế bào xen khít với (Hình 3.15) Sau tách khỏi giá thể nuôi cấy roux nhằm tăng sinh tế bào cho chạy flow, tế bào cho thấy có dạng hình thoi thn dài trở lại (Hình 3.33) Trong nghiên cứu Kim Kyungsook CS cho thấy thay đổi kiểu hình MSC ni mơi trường khác MSC môi trường bổ sung hPL(human platelet) cho thấy hình dạng tế bào kéo dài mỏng Các MSC mơi trường FBS có hình dạng tế bào dẹt [65] Tuy nhiên, dù kiểu hình hUC nghiên cứu có thay đổi đơi chút đặc tính gốc dịng tế bào khả tự làm mới, biệt hoá biểu hồ sơ markers MSC không thay đổi Các kết ICC lần giúp khẳng định kết phân tích flow cytometry biểu profile 42 markers MSC tế bào 5Ds (Hình 3.36) Đây điều quan trọng đánh giá tế bào tạo thành Thêm vào đó, trước cấy ghép lên vật chủ, ngồi khả tương thích sinh học, vật ghép cần đánh giá khả gây độc cho tế bào sống mức độ nhiễm khuẩn vật ghép Tuy nhiên, theo tìm hiểu chúng tơi, công bố liên quan đến tế bào chưa tìm thấy đánh giá tiêu Kết đánh giá độc tính tiếp xúc độc tính dịch thể nghiên cứu chúng tơi cho thấy giá thể Col-T tế bào BIT hồn tồn khơng gây độc cho tế bào đánh giá theo tiêu chuẩn ISO 10993-5 (Mục 3.1.7) đạt độ vô khuẩn theo thông tư 06/2011/TT-BYT, Việt Nam (Mục 3.1.8) Tính tan giá thể Col-T dùng tạo tế bào đánh giá nghiên cứu Kết cho thấy giá thể có khả phân huỷ môi trường huyết tương Tuy nhiên, thời gian phân huỷ chậm Đến ngày 10, %khối lượng cịn lại trung bình 79,02% ngày 20 21,55% (Hình 3.18) Như vậy, khoảng thời gian này, hUC-MSC có khả bám vào vùng mơ cần ghép, tiết yếu tố sinh trưởng, cytokine giúp phục hồi tổn thương Đồng thời tế bào có khả bao phủ, che chở vùng tổn thương mảnh vá tạm thời Sau đó, giá thể Col-T có khả phân huỷ từ từ loại khỏi mô ghép theo thời gian Trong nghiên cứu tiếp theo, thử nghiệm ghép tế bào tạo nghiên cứu lên chuột nhân hoá hệ miễn dịch nhằm đánh giá tương tác mảnh ghép in vivo 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Nghiên cứu tạo tế bào gốc trung mô mô cuống rốn mang tính bền cao giá thể Col-T Tấm tế bào cho thấy tính an toàn cao tế bào cấy giá thể khơng bị thay đổi đặc tính gốc ban đầu, khơng gây độc, có khả tan mơi trường huyết tương vô khuẩn, đạt tiêu cần thiết an toàn cho cấy ghép Kiến nghị - Tiếp tục thử nghiệm cấy ghép tế bào BIT lên chuột nhằm đánh giá đặc tính tế bào tạo thành in vivo - Nghiên cứu bảo quản giá thể Col-T tế bào BIT tạo thành 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO Squillaro T, Peluso G, Galderisi U Clinical Trials with Mesenchymal Stem Cells: An Update Cell Transplant 2016; 25:829–48 Yoshikawa Y, Miyagawa S, Toda K, Saito A, Sakata Y, Sawa Y Myocardial regenerative therapy using a scaffold-free skeletal-muscle-derived cell sheet in patients with dilated cardiomyopathy even under a left ventricular assist device: a safety and feasibility study Surgery Today 2017; 48:200–10 Takahashi H, Okano T Thermally-triggered fabrication of cell sheets for tissue engineering and regenerative medicine Advanced Drug Delivery Reviews 2019; 138:276–92 Potian JA, Aviv H, Ponzio NM, Harrison JS, Rameshwar P Veto-like activity of mesenchymal stem cells: functional discrimination between cellular responses to alloantigens and recall antigens J Immunol 2003; 171:3426–34 Le Blanc K, Tammik C, Rosendahl K, Zetterberg E, Ringdén O HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells Exp Hematol 2003; 31:890–6 Shake JG, Gruber PJ, Baumgartner WA, Senechal G, Meyers J, Redmond JM, et al Mesenchymal stem cell implantation in a swine myocardial infarct model: engraftment and functional effects Ann Thorac Surg 2002; 73:1919– 26 Bartolucci J, Verdugo FJ, González PL, Larrea RE, Abarzua E, Goset C, et al Safety and efficacy of the intravenous infusion of umbilical cord mesenchymal stem cells in patients with heart failure Circ Res 2017; 121:1192–204 Winters AA, Bou-Ghannam S, Thorp H, Hawayek JA, Atkinson DL, Bartlett CE, et al Evaluation of multiple biological therapies for ischemic cardiac disease Cell Transplant 2016; 25:1591–607 45 Patel AN, Vargas V, Revello P, Bull DA Mesenchymal Stem Cell Population Isolated from the Subepithelial Layer of Umbilical Cord Tissue Cell Transplant 2013; 22:513–9 10 Ichim TE, Solano F, Lara F, Paris E, Ugalde F, Rodriguez J, et al Feasibility of combination allogeneic stem cell therapy for spinal cord injury: a case report Int Arch Med 2010; 3:30–10 11 Riordan NH, Morales I, Fernández G, Allen N, Fearnot NE, Leckrone ME, et al Clinical feasibility of umbilical cord tissue-derived mesenchymal stem cells in the treatment of multiple sclerosis Journal of Translational Medicine 2018; 16 12 Devine SM, Cobbs C, Jennings M, Bartholomew A, Hoffman R Mesenchymal stem cells distribute to a wide range of tissues following systemic infusion into nonhuman primates Blood 2003; 101:2999–3001 13 Reiser J, Zhang X-Y, Hemenway CS, Mondal D, Pradhan L, La Russa VF Potential of mesenchymal stem cells in gene therapy approaches for inherited and acquired diseases Expert Opin Biol Ther 2005; 5:1571–84 14 Baxter MA, Wynn RF, Jowitt SN, Wraith JE, Fairbairn LJ, Bellantuono I Study of telomere length reveals rapid aging of human marrow stromal cells following in vitro expansion Stem Cells 2004; 22:675–82 15 David F, et al Mesenchymal stem cell detachment with trace trypsin is superior to EDTA for in vitro chemotaxis and adhesion assays Biochemical and Biophysical Research Communications 2017; 2017:1-6 16 Yamato M, Utsumi M, Kushida A, Konno C, Kikuchi A, Okano T Thermo-responsive culture dishes allow the intact harvest of multilayered keratinocyte sheets without dispase by reducing temperature Tissue Eng 2001; 7:473–80 17 Terrovitis JV, Smith RR, Marbán E Assessment and optimization of cell engraftment after transplantation into the heart Circ Res 2010; 106:479–94 18 Langer R, Vacanti JP Tissue engineering Science 1993; 260:920–6 46 19 Song JJ, Ott HC Organ engineering based on decellularized matrix scaffolds Trends in Molecular Medicine 2011; 17:424–32 20 Kubo H, Shimizu T, Yamato M, Fujimoto T, Okano T Creation of myocardial tubes using cardiomyocyte sheets and an in vitro cell sheetwrapping device Biomaterials 2007; 28:3508–16 21 Liang Y, Kiick KL Heparin-functionalized polymeric biomaterials in tissue engineering and drug delivery applications Acta Biomaterialia 2014; 10:1588–600 22 Ott HC, Matthiesen TS, Goh S-K, Black LD, Kren SM, Netoff TI, et al Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart Nat Med 2008; 14:213–21 23 Murphy SV, Atala A 3D bioprinting of tissues and organs Nat Biotechnol.; 2014; 32:773–85 24 Sekine H, Shimizu T, Sakaguchi K, Dobashi I, Wada M, Yamato M, et al In vitro fabrication of functional three-dimensional tissues with perfusable blood vessels Nat Commun 2019; 25 Sakaguchi K, Shimizu T, Horaguchi S, Sekine H, Yamato M, Umezu M, et al In Vitro Engineering of Vascularized Tissue Surrogates Sci Rep 2013; 3:879–7 26 Karikkineth BC, Zimmermann W-H Myocardial tissue engineering and heart muscle repair Curr Pharm Biotechnol 2013; 14:4–11 27 Yassin MA, Leknes KN, Pedersen TO, Xing Z, Sun Y, Lie SA, FinneWistrand A, Mustafa K Cell seeding density is a critical determinant for copolymer scaffolds induced bone regeneration J Biomed Mater Res Part A 2015; 103A:3649–58 28 Ishii M, Shibata R, Numaguchi Y, Kito T, Suzuki H, Shimizu K, et al Enhanced Angiogenesis by Transplantation of Mesenchymal Stem Cell Sheet Created by a Novel Magnetic Tissue Engineering Method Arterioscler Thromb Vasc Biol 2011; 31:2210–5 47 29 Hossler FE, Douglas JE Vascular Corrosion Casting: Review of Advantages and Limitations in the Application of Some Simple Quantitative Methods Microsc Microanal 2001; 7:253–64 30 Ikuta K, Yamada A, Niikura F Real three-dimensional microfabrication for biodegradable polymers: demonstration of high-resolution and biocompatibility for implantable microdevices IEMBS-04 2004; 3:2679–82 31 Hoque ME, Chuan YL, Pashby I Extrusion based rapid prototyping technique: An advanced platform for tissue engineering scaffold fabrication Biopolymers 2011; 97:83–93 32 Kolesky DB, Truby RL, Gladman AS, Busbee TA, Homan KA, Lewis JA 3D Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell-Laden Tissue Constructs Adv Mater 2014; 26:3124–30 33 Haitao C, et al 3D Bioprinting for Organ Regeneration Adv Healthcare Mater 2017; 1601118 34 Sawa Y, Miyagawa S, Sakaguchi T, Fujita T, Matsuyama A, Saito A, et al Tissue engineered myoblast sheets improved cardiac function sufficiently to discontinue LVAS in a patient with DCM: report of a case Surgery Today 2011; 42:181–4 35 Kim MS, Lee B, Kim HN, Bang S, Yang HS, Kang SM, et al 3D tissue formation by stacking detachable cell sheets formed on nanofiber mesh Biofabrication 2017; 9:015029–11 36 Bakirci E, Toprakhisar B, Zeybek MC, Ince GO, Koc B Cell sheet based bioink for 3D bioprinting applications Biofabrication 2017; 9:024105–11 37 Zhou S, Wang Y, Zhang K, Cao N, Yang R, Huang J, et al The Fabrication and Evaluation of a Potential Biomaterial Produced with Stem Cell Sheet Technology for Future Regenerative Medicine Stem Cells International 2020; 2020:1–12 48 38 Niknejad H, Peirovi H, Jorjani M, Ahmadiani A, Ghanavi J, Seifalian AM Properties of the amniotic membrane for potential use in tissue engineering Eur Cell Mater 2008; 15:88–99 39 Navas A, Maga-Guerrero FS, Domínguez-López A, Chávez-García C, Partido G, Graue-Hernández EO, et al Anti-Inflammatory and AntiFibrotic Effects of Human Amniotic Membrane Mesenchymal Stem Cells and Their Potential in Corneal Repair STEM CELLS Translational Medicine 2018; 7:906–17 40 Beeravolu N, McKee C, Alamri A., Mikhael S, Brown C, Perez-Cruet M, Chaudhry GR Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta J Vis Exp 2017; 122: 55224 41 Dominici M, Le Blanc K, Mueller I et al Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells Cytotherapy 2006; 8(4): 315-17 42 Bongso A and Fong CY Phenotype and differentiation potential of stromal populations obtained from various zones of human umbilical cord: an overview Stem Cell Reviews and Reports 2013; 9(2): 226–40 43 El Omar R, Beroud J, Stoltz JF, Menu P, Velot E, and Decot V Umbilical cord mesenchymal stem cells: the new gold standard for mesenchymal stem cell-based therapies? Tissue Engineering 2014; 20 (5): 523–44 44 Shi Z, Zhao L, Qiu G, He R, and Detamore MS The effectof extended passaging on the phenotype and osteogenic potential of human umbilical cord mesenchymal stem cells Molecular and Cellular Biochemistry 2015; 401(12): 155–64 45 Kadam SS, Bhonde R Islet neogenesis fromthe constitutively nestin expressing human umbilical cord matrix derived mesenchymal stem cells Islets 2010; 2(2): 112–20 46 Bakhshi T, Zabriskie RC, Bodie S et al Mesenchymal stem cells from the Wharton’s jelly of umbilical cord segments provide stromal support for the 49 maintenance of cord blood hematopoietic stem cells during long-term ex vivo culture Transfusion 2008; 48(12): 2638 - 44 47 Majumdar D, Bhonde R, and Datta I Influence of ischemic microenvironment on human Wharton’s Jelly mesenchymal stromal cells Placenta 2013; 34(8): 642–49 48 Nakao M, Inanaga D, Nagase K, Kanazawa H Characteristic differences of cell sheets composed of mesenchymal stem cells with different tissue origins Regenerative Therapy 2019; 11:34–40 49 Jossen V, Bos C, Eibl R, Eibl D Manufacturing human mesenchymal stem cells at clinical scale: process and regulatory challenges Applied Microbiology and Biotechnology; 2018; 102: 3981-3994 50 Spees JL, Gregory CA, Singh H, Tucker HA, Peister A, Lynch PJ, et al Internalized Antigens Must Be Removed to Prepare Hypoimmunogenic Mesenchymal Stem Cells for Cell and Gene Therapy Molecular Therapy The American Society of Gene Therapy; 2004; 9:747–56 51 Meller D, Pauklin M, Thomasen H, Westekemper H, Steuhl K-P Amniotic Membrane Transplantation in the Human Eye Deutsches Aerzteblatt Online 2011; 108:234-8 52 Malhotra C, Jain AK Human amniotic membrane transplantation: Different modalities of its use in ophthalmology World J Transplant 2014; 4:111–2 53 Gomes JA, dos Santos MS, Cunha MC, Mascaro VL, Barros JN, de Sousa LB Amniotic membrane transplantation for partial and total limbal stem cell deficiency secondary to chemical burn Ophthalmology 2003; 110(3):466–73 54 Anderson DF, Ellies P, Pires RT, Tseng SC Amniotic membrane transplantation for partial limbal stem cell deficiency British Journal of Ophthalmology 2001; 85:567–75 50 55 Sangwan VS, Matalia HP, Vemuganti GK, Rao GN Amniotic membrane transplantation for reconstruction of corneal epithelial surface in cases of partial limbal stem cell deficiency Indian J Ophthalmol 2004; 52:281–5 56 Talmi Y, Finkelstein Y, Zohar Y Use of human amniotic membrane as a biologic dressing Eur J Plast Surg 1990; 13: 160-2 57 Bujang-Safawi E, Halim AS, Khoo TL, Dorai AA Dried irradiated human amniotic membrane as a biological dressing for facial burns-a year case series Burn 2010; 36: 876-82 58 Meng XT, Chen D, Dong ZY, Liu JM Enhance neural differentiation neural stem cell and neurite growth by amniotic epithelial cell co-culture Cell Biol Int 2007; 31: 691-698 59 Lu T-Y, Lin B, Kim J, Sullivan M, Tobita K, Salama G, et al Repopulation of decellularized mouse heart with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular progenitor cells Nat Commun 2013; 4: 2307 60 Wang B, Borazjani A, Tahai M, de Jongh Curry AL, Simionescu DT, Guan J, et al Fabrication of cardiac patch with decellularized porcine myocardial scaffold and bone marrow mononuclear cells J Biomed Mater Res 2010; 94:1100-1110 61 Kim K, Bou-Ghannam S, Thorp H, Grainger DW, Okano T Human mesenchymal stem cell sheets in xeno-free media for possible allogenic applications Sci Rep Nature Publishing Group; 2019; 9:14415–12 62 Silva LHA, Antunes MA, Santos Dos CC, Weiss DJ, Cruz FF, Rocco PRM Strategies to improve the therapeutic effects of mesenchymal stromal cells in respiratory diseases Stem Cell Research & Therapy; 2018; 9: 45 63 Gnecchi M, Zhang Z, Ni A, Dzau VJ Paracrine Mechanisms in Adult Stem Cell Signaling and Therapy Circ Res 2008; 103:1204–19 64 Figueroa FE, Carrión F, Villanueva S, Khoury M Mesenchymal stem cell treatment for autoimmune diseases: a critical review Biol Res Sociedad de Biología de Chile; 2012; 45:269–77 51 65 Kim K, Thorp H, Bou-Ghannam S, Grainger DW, Okano T Stable cell adhesion affects mesenchymal stem cell sheet fabrication: Effects of fetal bovine serum and human platelet lysate J Tissue Eng Regen Med 2020; 14:741–53 52