Nghiên ứu đặc điểm sinh học và khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của một số chủng lactococcus phân lập từ sữa

Trang 1 YỄN THỊ ĐÀTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI--- LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌCCÔNG NGHỆ SINH HỌC NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC 1B Trang 2 --- LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM S

-

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP BACTERIOCIN CỦA MỘT SỐ CHỦNG

LACTOCOCCUS PHÂN LẬP TỪ SỮA

LỜI CÁM ƠN

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với PGS.TS Lê Thanh Bình

– Phòng Các chất hoạt tính sinh học từ vi sinh vật Viện Công nghệ sinh học, –

đã nhiệt tình dạy bảo, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu để tôi hoàn thành luận văn này.

Tôi cũng xin được cám ơn Th.S Hoa Thị Minh Tú Phòng Các chất -

hoạt tính sinh học từ vi sinh vật Viện Công nghệ sinh học, đã nhiệt tình giúp –

đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin chân thành cám ơn trung tâm đào tạo sau đại học, trường Đại học Bách khoa Hà Nội; Ban Lãnh Đạo viện Công nghệ sinh học Viện Khoa –

học và Công nghệ Việt Nam cùng toàn thể các thầy cô giáo đã dạy dỗ và tạo điều kiện cho tôi th ực hiện luận văn này

Tôi xin được gửi lời cám ơn tới tất cả các anh chị, các bạn đồng nghiệp

Phòng Các chất hoạt tính sinh học từ vi sinh vật Viện Công nghệ sinh học –

đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Cuối cùng ôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè, những người thân đã luôn t

ủng hộ và góp ý cho tôi trong suốt thời gian học tập và công tác

Hà Nội, ngày tháng năm 2008

Nguyễn Thị Đà

MỤC LỤC

Trang Trang phụ bìa……… i

Lời cám ơn……… ii

Mục lục……… iii

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt……… v

Danh mục các bảng……… vi

Danh mục các hình vẽ, đồ thị……… viii

MỞ ĐẦU……… 1

Chương 1 - TỔNG QUAN……… 3

1.1 Vi khuẩn lactic……… 3

1.1.1 Giới thiệu chung……… 3

1.1.2 Sự phát sinh loài……… 5

1.1.3 Phân loại vi khuẩn lactic 6

1.1.4 Ứng dụng của vi khuẩn lactic……… 10

1.2 Bacteriocin……… 14

1.2.1 Lịch sử nghiên cứu về bacteriocin……… 14

1.2.2 Bacteriocin của vi khuẩn lactic……… 15

Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP……… 34

2.1 Chủng giống và môi trường……… 34

2 1 1 Chủ i i h ật 34 2.1.2 Môi trường……… 34

2.2 Phương pháp nghiên cứu……… 35

2.2.1 Xác định hoạt tính bacteriocin……… 35

2.2.2 Quan sát hình thái tế bào……… 37

2.2.3 Xác định một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa ……… 37

2.2.4 Xác định khả năng kháng kháng sinh và nisin……… 39

2.2.5 Phương pháp lên men thu hồi bacteriocin bằng dung môi……… 39

2.2.6 Xác định một số đặc điểm của bacteriocin……… 40

2.2.7 Tách chiết DNA plasmid……… 41

2.2.8 Điện di protein trên gel polyacrylamide (SDS – PAGE)………… 42

Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……… 45

3.1 Nghiên cứu một số đặc tính của các chủng……… 45

3.1.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa ……… 45

3.1.2 Đặc tính kháng kháng sinh và kháng nisin……… 47

3.1.3 Nghiên cứu nhu cầu dinh dưỡng và tác động của các yếu tố môi trường đối với sự sinh tổng hợp bacteriocin các chủng……… 54

3.2 Nghiên cứu thu hồi bacteriocin bằng phương pháp kết tủa ethanol 72 3.3 Nghiên cứu một số tính chất của chế phẩm……… 74

3.3.1 Ảnh hưởng của pH lên độ bền của các bacteriocin thu hồi……… 74

3.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên độ bền của các bacteriocin thu hồi… 76

3.3.3 Ảnh hưởng kết hợp giữa nhiệt độ và pH lên độ bền của các bacteriocin thu hồi……… 78

3.3.4 Phản ứng với các enzyme phân hủy protein……… 80

3.3.5 Phân tích điện di protein trên gel polyacrylamid (SDS-PAGE)…… 81

Chương 4 - KẾT LUẬN ……….……… 83

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 85

DANH MỤC CÁC THUẬT NGỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT

CHỮ VIẾT TẮT CHỮ VIẾT ĐẦY ĐỦ

GRAS Generally recognized as safe – được coi là an toàn

MIC Minimal inhibition concentration – Nồng độ ức chế tối thiểu

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

1 Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của các chủng 46

2 Bảng 3.2 Tính nhạy kháng sinh của chủng PĐ14, BV20, PĐ2.9 49

3 Bảng 3.3 Số l ợng tế bào của các chủng nghiên cứu sống sót ư

trên môi trường bổ sung nisin ở các nồng ộ khác nhauđ

9 Bảng 3.9 Khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp bacteriocin của

các chủng trên môi trường có các nguồn cacbon khác nhau

68

10 Bảng 3.10 Ảnh hưởng của hàm lượng sacharose lên sự sinh

trưởng và sinh tổng hợp bacteriocin của các chủng

14 Bảng 3.14 Ảnh hưởng của pH đến độ bền hoạt tính bacteriocin 75

15 Bảng 3.15 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền bacteriocin của

4 Hình 1.4 Sơ đồ con đường sinh tổng hợp bacteriocin nhóm II 23

5 Hình 2 Quy trình xác định hoạt tính bacteriocin bằng phương pháp

7 Hình 3.2 Đặc điểm hình thái tế bào chủng vi khuẩn lactic chụp dưới

kính hiển vi điển tử (phóng đại 10.000 lần)

45

8 Hình 3.3 Kết quả điện di plasmid của các chủng nghiên cứu 51

9 Hình 3.4 Đồ thị tỷ lệ phần trăm số tế bào sống sót trên môi trường bổ

sung nisin ở các nồng độ khác nhau

53

10 Hình 3.5 Hoạt tính bacteriocin của tế bào chủng BV20 sống sót trên

môi trường bổ sung nisin ở các nồng độ khác nhau

54

11 Hình 3.6 Động thái sinh trưởng và sinh tổng hợp bacteriocin của

chủng PĐ14 trong thời gian từ 0 48h nuôi cấy.-

57

12 Hình 3.7 Động thái sinh trưởng và sinh tổng hợp bacteriocin của

chủng BV20 trong thời gian từ 0 48h nuôi cấy.-

57

13 Hình 3.8 Động thái sinh trưởng và sinh tổng hợp bacteriocin của

chủng PĐ2.9 trong thời gian từ 0 48h nuôi cấy.-

trưởng, phát triển và sinh bacteriocin của các chủng BV20

16 Hình 3.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh

trưởng, phát triển và sinh bacteriocin của các chủng PĐ2.9

20 Hình 3.15 Hoạt tính bacteriocin của các chủng PĐ14 trên môi trường

có bổ sung nồng độ muối khác nhau

67

21 Hình 3.16 Ảnh hưởng của PH đến độ bền hoạt tính bacteriocin 75

22 Hình 3.17: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền hoạt tính của dịch kết tủa

MỞ ĐẦU

Bảo quản đã đang và sẽ là mối quan tâm hàng đầu của nền công nghiệp thực phẩm trong tương lai Sự phát triển nhanh đời sống xã hội loài người đã làm cho nhu cầu về thực phẩm trở lên lớn hơn bao giờ hết Trong đó, vấn đề

an toàn vệ sinh trong chế biến và bảo quản thưc phẩm trở thành vấn đề được quan tâm đặc biệt

Trước đây các sản phẩm thực phẩm như: thịt, cá… đã được bảo quản bằng thuốc kháng sinh như penicilline, creomicin…Hoa Kỳ là một trong những nước đầu tiên sử dụng kháng sinh để bảo quản thực phẩm, sữa Sử dụng các chất kháng sinh trong bảo quản là một trong số các nguyên nhân gây

ra tình trạng kháng thuốc của vi sinh vật Cũng chính Hoa Kỳ là nước đầu tiên phát hiện ra tác hại này và đã đưa ra luật cấm sử dụng kháng sinh y tế trong bảo quản

Với tác hại nghiêm trọng như vậy, việc tìm ra một chất bảo quản an toàn để bảo quản thực phẩm đáp ứng nhu cầu cũng như yêu cầu về an toàn thực phẩm trở thành một vấn đề đáng được quan tâm

Trước đây, có một số phương pháp bảo quản đã được sử dụng như: bảo quản lạnh, lạnh đông, ướp muối, sấy, gia nhiệt, lên men, sử dụng hoá chất…Các phương pháp này có khả năng bảo quản thực phẩm trong thời gian nhất định song nó lại làm mất đi một số đặc tính tự nhiên của sản phẩm Để khắc phục điều này thì một số chất diệt khuẩn được dung để tiêu diệt vi sinh vật trong quá trình chế biến và kéo dài thời gian bảo quản Các chất diệt khuẩn có nguồn gốc hoá học đã được dùng và nó cho thấy có thể bảo quản được trong thời gian khá lâu nhưng nó lại thường để lại dư lượng trong các sản phẩm và tích tụ lại trong cơ thể và gây hại cho người sử dụng

Vì thế, với việc phát hiên ra nisin, một bacteriocin do vi khuẩn lactic sinh ra đã mở ra một hướng mới trong ngành công nghiệp chế biến bảo quản - thực phẩm Kể từ đó đến nay, việc nghiên cứu về nisin, tìm kiếm các bacteriocin mới và về vi khuẩn lactic thu hút sự quan tâm nghiên cứu đặc biệt trong lĩnh vực công nghệ sinh học và thực phẩm

Với ý nghĩa to lớn trong bảo quản thực phẩm của bacteriocin, chúng tôi

tiến hành: Đề tài: “Nghiên cứu đ ặc đ iểm sinh học và khả n ng sinh tổng ă hợp bacteriocin của một số chủng Latococcus phân lập từ sữa”, với mục

đích đặt ra:

1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá của chủng

2 Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn, khả năng sinh tổng hợp bacteriocin

3 Nghiên cứu đặc điểm kháng kháng sinh

4 Nghiên cứu nhu cầu dinh dưỡng và tác động của một số yếu tố môi trường

5 Nghiên cứu phương pháp thu hồi sản phẩm

6 Nghiên cứu tính chất của sản phẩm thu hồi

Với những mục tiêu nêu trên, đề tài đã thu được một số kết quả về:

1 Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của các chủng tuyển chọn

2 Hoạt tính bacteriocin của các chủng được tuyển chọn

3 Đặc điểm kháng kháng sinh

4 Động thái sinh tổng hợp bacteriocin

5 Thu hồi bacteriocin và nghiên cứu được một số tính chất

Chương 1 – TỔNG QUAN

1.1 Vi khuẩn lactic

1.1.1 Giới thiệu chung

Vi khuẩn lactic có các đặc điểm chung là các vi khuẩn G+, không sinh bào tử, hình que hoặc hình cầu, catalase âm tính, không có cytochrome, sinh axit lactic như một sản phẩm chính của quá trình lên men cacbonhydrat Đây

là nhóm vi khuẩn lên men bắt buộc, chúng sinh trưởng trong môi trường từ kỵ khí đến vi hiếu khí Tuy nhiên, chỉ có duy nhất đặc điểm là chúng thuộc vi khuẩn G+ thì không thay đổi Catalase và cytochrome có thể được hình thành

ở một số LAB khi nuôi cấy ở các điều kiện môi trường nào đó, một số streptococci (Streptococcus bovis) cần nguồn dinh dưỡng giới hạn, khi lên men đường thì tạo ra rất ít axit lactic ở dưới điều kiện môi trường đó [7, 76]

Năm 1780, nhà hóa học người Thụy Điển Scheele lần đầu tiên tách được axit lactic từ sữa bò lên men chua Nhưng phải mãi đến năm 1857 hiện tượng làm chua sữa mới đươc Pasteur chứng minh là do một nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic gây ra Chủng vi khuẩn lactic thuần khiết đầu tiên được đặt tên là Bacterium lactic được J Lister phân lập năm 1873 Từ đó đến nay hàng loạt các vi khuẩn lactic đã được phát hiện và nhưng ứng dụng của chúng ngày càng được mở rộng ra nhiều lĩnh vực [7, 76]

Trong tự nhiên, vi khuẩn lactic có mặt ở nhiều nơi: trong phân, rác, xác của động thực vật, trong niêm mạc miệng, niêm mạc ruột của người và gia súc, gia cầm đặc biệt là sự có mặt một lượng lớn của vi khuẩn lactic trong các sản phẩm lên men chua, trong các môi trường giàu dinh dưỡng như trong các sản phẩm thực phẩm (sữa, thịt, rau quả, đồ uống…)

Nói chung các vi khuẩn lactic không sinh sắc tố nhưng khi sinh trưởng trên môi trường có bổ sung máu thì một số loài lại có khả năng tạo nên các sắc tố

hemin tương ứng [7, 77] Vi khuẩn lactic cũng không chứa catalase và cytocrom (trừ một vài loài như Enterococcus feacalis được coi là có hoạt tính pseudocatalase) [77] Tuy nhiên một vài loài như Lactococcus lactis, Leuconostoc mensenteroides lại có thể khả năng tạo thành các cytocrom khi sinh trưởng trên môi trường chứa máu; ở chúng thậm chí còn có quá trình phosphoryl hóa, oxi hóa của chuỗi hô hấp [7 ].

Vi khuẩn lactic đòi hỏi nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, không một đại diện nào của chúng có thể phát triển trên môi trường muối khoáng thuần khiết chứa glucose và NH4+ Đa số chúng cần hàng loạt các vitamin: lactoflavin, tiamin, axit patotenic, axit nicotinic, axit folic, biotin…và các axit amin trong quá trình sinh trưởng, phát triển [7, 76] Vì vậy, môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic thường chứa một lượng lớn các chất cung cấp axit amin và vitamin như: cao nấm men, peptone, dịch chiết cà chua… Ngoài ra, để tăng cường khả năng sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn lactic, người ta còn phải bổ sung các muối khoáng Mn2+, Mg2+, Fe3+…, thậm chí bổ sung máu (ở Mỹ, người ta bổ sung 5% máu cừu vào môi trường thạch để nuôi cấy Streptococcus; ở Anh, người ta thường dùng 5% máu ngựa để bổ sung vào môi trường thạch…)

Cũng giống như các cơ thể nhân nguyên thủy khác, là một tế bào, vi khuẩn lactic tiếp xúc trực tiếp với môi trường xung quanh không hề có một cơ quan chuyên trách bảo vệ nào, do đó quá trình sinh trưởng, phát triển của chúng phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện môi trường bên ngoài Một biến đổi

dù rất nhỏ của điều kiện nuôi cấy hoặc thành phần môi trường cũng có ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn lactic, thậm chí có thể gây ức chế hoàn toàn quá trình sinh trưởng, phát triển Chủng Lactococcus lactis subsp lactis NIZO 22186 đạt mức sinh trưởng cực đại trên môi trường có hàm lượng glucose ban đầu 20g/l, nhưng chỉ cần giảm hàm lượng glucose ban đầu này xuống 10g/l thì ngay lập tức sinh trưởng, phát triển của chúng đã giảm

1/3 lần so với trước [34] Tuy nhiên, khả năng thích ứng với các điều kiện sống khác nhau cũng tùy thuộc vào từng loài, từng chủng Nồng độ muối 5%

đã đủ để ức chế sinh trưởng, phát triển của hầu hết các vi khuẩn lactic nhưng đối với các chủng chịu mặn được bổ sung vào thức ăn xanh ủ chua thì nồng

độ muối 5% lại tăng cường khả năng lên men của chúng [25]

Mối quan hệ về sự phát sinh loài của các vi khuẩn G dương được thể hiện thông qua các dữ liệu về oligonucleotid và trình tự rRNA Vi khuẩn Gram dương được chia theo tỷ lệ % G + C của DNA cao và thấp Điểm ranh giới phân chia là 50%, tuy nhiên nó có thể là 53 55% tùy thuộc vào một số – loài có G+ C thấp trong dãy này như Lb fermentum và Lb pontis Hàm lượng

G + C cao bao gồm một số chi: Bifidobacterium, Arthrobacter, Micrococcus, Propionibacterium, Microbacterium, Corynebacterium, Actinomyces, and Streptomyces Hàm lượng G + C thấp bao gồm tất cả các vi khuẩn lactic, cùng với các vi khuẩn lên men hiếu khí hay kỵ khí tùy tiện như Bacillus, Staphylococcus, Listeria và các vi khuẩn kỵ khí như Clostridium, Peptococcus, và Ruminococcus

Mối quan hệ giữa các chi trong LAB và giữa LAB với các chi khác có cùng hàm lượng G+ C thấp đã được M D Collin và cộng sự đưa ra khi nghiên cứu thông qua hai phương pháp là phiên mã ngược và kỹ thuật PCR Hầu hết

vi khuẩn lactic ngày nay được định nghĩa một phần dựa trên việc đo khoảng cách phát sinh loài đối với trường hợp của Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactococcus, Leuconostoc sensu stricto, Oenococcus, Streptococcus sensu stricto, Tetragenococcus, Vagococcus, và Weissella mỗi loại trong các chi này đều đã được tính toán chính xác về đơn vị phát sinh loài LAB không thực sự phân chia rõ ràng đối với các vi khuẩn Gram dương

có hàm lượng G + C thấp khác

Hình 1.1 Sơ đồ cây phát sinh của vi khuẩn lactic bao gồm một số vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí tùy tiện dựa trên hàm lượng G+C

1.1.3 Phân loại vi khuẩn lactic

Vào năm 1919, Orla Jensen đã đưa ra một số đặc điểm đặc trưng để phân loại vi khuẩn lcatic Nhờ các đặc điểm này mà công việc phân loại vi khuẩn lactic được rõ ràng hơn rất nhiều và chúng vẫn còn là một công cụ phân loại hữu ích cho đến ngày nay Các đặc điểm để phân loại lactic mà Orla-Jensen đưa ra bao gồm: các đặc điểm hình thái (dạng hình que, cầu hay dạng tetrad), kiểu lên men đường glucose (lên men đồng hình hay lên men dị hình), khả năng sinh trưởng ở các ngưỡng nhiệt độ (100C hay 450C) và khả năng sử dụng một số các loại đường khác nhau Dựa trên những đặc điểm phân loại của Orla Jensen thì LAB được chia thành 4 chi: – Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, và Streptococcus Nếu phân loại theo định nghĩa phổ rộng về đặc điểm sinh lý và sinh hoá thì nhóm vi khuẩn lactic bao gồm khoảng 20 chi [ ] Thực tế trong ngành công nghiệp thực phẩm thì các chi 76

-được coi là nhóm vi khuẩn lactic chính bao gồm: Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus, và Weissella Chi Bifidobacterium thường được coi như vi khuẩn lactic vì nó có mang một số đặc điểm của vi khuẩn lactic Các chi mới như Alloiococcus, Dilosicoccus, Dilosigranulum, Eremococcus, Facklamia, Globicatella, Helcococcus, Ignavigranum và Lactosphaera bao gồm một số chủng có quan

hệ với LAB cả về đặc điểm sinh lý cũng như hệ thống phát sinh loài [76]

Sự phân loại vi khuẩn lactic thành các chi khác nhau phần lớn dựa trên

sự khác nhau về hình thái, cơ chế lên men đường, khả năng sinh trưởng ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau, dạng sản phẩm axit lactic, khả năng sinh trưởng

ở các nồng độ muối khác nhau và khả năng chịu axit hay kiềm Đặc điểm hoá học như thành phần axit béo và thành phần cấu tạo thành tế bào cũng được sử dụng để phân loại Hơn nữa, các kỹ thuật phân loại ngày nay dựa trên mối quan hệ về phylogenetic, phân loại dựa trên việc xác định trình tự rRNA, mối quan hệ gần gũi ở mức độ loài hay dưới loài có thể được xác định dựa trên các nghiên cứu sự tương đồng DNA DNA Để xác định sự phát sinh kiểu gen -của loài và chi, thì phương pháp nghiên cứu dựa trên trình tự rRNA là phù hợp hơn cả vì nó có chứa cả các vùng có trình tự bảo thủ và ít bảo thủ

Dựa vào đặc điểm hình thái thì vi khuẩn lactic được chia thành hai loại

đó là dạng hình que (gồm có Lactobacillus và Carnobacterium) và hình cầu (tất cả các chi còn lại) Riêng chi Weissella theo định nghĩa thi nó gồm cả hai dạng là hình que và hình cầu Trong dạng hình cầu lại có một số chi tồn tại ở dạng tetrad như Aerococcus, Pediococcus, và Tetragenococcus

Dựa theo khả năng lên men đường thì vi khuẩn lactic được chia làm hai nhóm: là nhóm lên men đồng hình (Glycolysis hay là con đường Embden-Meyerhof-Parnas) và nhóm lên men dị hình (con đường 6 phosphogluconate /

phosphoketolase) [7, 8, ] Hầu hết các LAB sử dụng quá trình đường phân 76theo con đường Embden-Meyerhof-Parnas Ngoại trừ leuconostoc, oenococci

và weissella và một số dưới nhóm lactobacilli có cơ chế lên men dị hình còn tất cả các LAB khác đều lên men đồng hình [76]

Các vi khuẩn lactic lên men đồng hình phân giải đường theo con đường EMP (Embden-Meyerhof-Parnas path way) và cho ta sản phẩm chủ yếu là axit lactic từ 90 – 98%[5, 88] Chỉ một phần nhỏ pyruvat được decarboxyl hóa thành axit axetic, etanol, axetoin và CO2 Mức độ tạo thành các sản phẩm này phụ thuộc vào sự có mặt của O2 Đại diện của các vi khuẩn lactic lên men đồng hình như: Lc lactis, E faecalis, Str salivarius, Str pyogenes, S thermophilus, Lb helveticus, Lb acidophilus, Lb bulgaricus, Lb platarum …

Các vi khuẩn lactic dị hình do thiếu hai 2 enzym chủ yếu của con đường EMP là aldolase và triozophosphat isomerase nên giai đoạn đầu của -quá trình phân giải glucose xảy ra theo con đường PP (Pentose phosphat) Quá trình chuyển hóa triozophosphat thành axit lactic xảy ra giống như trong lên men đồng hình [7, 76] Sản phẩm chủ yếu của quá trình lên men lactic dị hình vẫn là axit lactic (40%), ngoài ra, tùy từng loài có thể tạo them các sản phẩm khác như: axit xucinic và rượu etylic khoảng 20%, axit axetic khoảng 10%, các chất khí còn lại chiếm 20%[7] Đại diện các vi khuẩn lên men dị hình như: Ln mensenteroides, Ln cremoris và một số vi khuẩn lactic hình que như Lb brevis, Lb fermentum, …

Hình 1.2 Hai con đường chính lên men glucose: (A) lên men lactic đồng

hình (glycolysis hay Embden-Meyerhof-Parnas pathway); (B) con đường lên men lactic dị hình (6-phosphogluconate/phosphoketolase pathway) Thứ tự các enzyme được đánh dấu cho phản ứng: 1 Glucokinase; 2 fructose-1,6-diphosphate aldolase; 3 Glyceradehyde-3-phosphate dehydrogenase; 4 pyruvate kinase; 5 Lactate dehydrogenase; 6 glucose-6-phosphate dehydrogenase; 7 6 phosphogluconate dehydrogenase; 8 phosphoketolase; 9 -acetaldehyde dehydrogenase; 10 alcohol dehydrogenase

1.1.4 Ứng dụng của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn có lịch sử nghiên cứu lâu dài và nó được coi là an toàn cho người sử dụng Vi khuẩn lactic đã được sử dụng trong công nghiệp từ rất nhiều năm nay bởi chúng có thể lên men đường (bao gồm

cả lactose) và một số nguồn cacbonhydrat khác thành axit lactic Điều này không chỉ đem lại vị ngon, làm mềm các sản phẩm lên men hàng ngày giống như sữa chua, mà còn tạo ra axit lactic làm giảm pH của môi trường dẫn tới

có khả năng ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây hỏng, gây thối do đó nó rất có lợi cho sức khỏe và có khả năng ngăn chặn sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh có trong đường ruột Vi khuẩn lactic có khả năng tạo ra các axit hữu cơ, enzyme, vitamin, các hợp chất chống oxy hóa, EPS (exopolysacharide) và các chất kháng khuẩn [71, 76 Vi khuẩn lactic còn ]được ứng dụng để sản xuất các chế phẩm probiotic được dùng cho con người

và gia súc, gia cầm [1, 2, 7, 14 76] Dư, ới đây là một số ứng dụng của vi khuẩn lactic:

Ứng dụng đầu tiên của vi khuẩn lactic là trong ngành công nghiệp sản xuất axit lactic, một nguồn nguyên liệu rất cần thiết cho nhiều ngành công nghiệp Axit lactic được sử dụng trong ngành công nghiệp thuộc da (làm mềm

và nở da), trong công nghiệp dệt (làm thuốc nhuộm), trong in ấn, sơn (có vai trò như dung môi trong sơn), trong ngành công nghiệp chế tạo chất dẻo có khả năng phân hủy sinh học PLA… PLA là sản phẩm nhựa phân huỷ sinh học được chế tạo từ axit lactic đã đem lại cho loài người một nguồn nguyên liệu mới thân thiện với môi trường Ngoài ra, muối lactat với các nguyên tố vi lượng thường được dùng làm dược phẩm bổ sung cho cơ thể dưới dạng dễ hấp thụ

Ứng dụng lớn thứ hai của vi khuẩn lactic là trong công nghiệp chế biến

và bảo quản thực phẩm Lên men lactic sinh ra các axit hữu cơ (axit lactic,

axit axetic,…) do đó làm giảm pH của môi trường Ở pH thấp này hầu hết các VSV gây thối hỏng thực phẩm như: B subtilis, P vulgaris, B mensenterium, Clostridium hay Acromobacter 12 và các VSV gây bệnh có trong thực phẩm [ ]

tự nhiên như: E coli, Pseudomonas sp, Sarcina sp, Samonella sp…[14 46, ,

75 76, ] đều bị tiêu diệt Ngoài khả năng sinh axit hữu cơ làm giảm pH môi trường, một số chủng vi khuẩn lactic còn có khả năng sinh ra các chất ức chế như diaxetyl, hydroperoxyt, axetaldehyt và đặc biệt là bacteriocin

Diaxetyl ức chế mạnh đối với vi khuẩn G-, nấm mốc, đặc biệt là đối với M.tuberculosis

Hydroperoxyt ức chế hoặc tiêu diệt các vi khuẩn nhạy cảm nhờ khả năng oxy hóa mạnh kìm hãm sự phát triển của S aureus, Pseudomonas, Proteus, Flavobacter, Achromobacter

Axetaldehyt ức chế sự sinh sản của E coli

Bacteriocin thực sự là một phát hiện có giá trị trong bảo quản thực phẩm lên men cũng như không lên men Bacteriocin của vi khuẩn lactic có khả năng ức chế chủ yếu các vi khuẩn G+ có quan hệ họ hàng với chủng sinh bacteriocin đó, một số bacteriocin có phổ kháng khuẩn rộng, có khả năng ức chế vi khuẩn G âm và G dương [ ] 76

Nhờ khả năng sinh ra các chất ức chế trên cho nên lên men lactic, từ lâu

đã thành một biện pháp bảo quản thực phẩm hữu hiệu trong dân gian: các hình thức muối dưa, muối cà, nem chua, sữa chua… Lên men lactic đồng thời cũng sinh ra các hợp chất vòng thơm, các axit amin tự do… do đó sản phẩm lên men lactic rất giàu dinh dưỡng và có hương vị thơm ngon đặc trưng

Có thể kể đến một vài sản phẩm lên men lactic từ sữa như: sữa chua, phomat,…

Sữa chua là món ăn truyền thống của nhiều dân tộc: sữa ngựa chua của Mông Cổ được lên men lactic tự nhiên từ sữa tươi hoặc dùng hạt kefir làm

giống ban đầu Hiện nay trong công nghiệp thường dùng các chủng thuần khiết để lên men như: Lactococcus lactis, Lactobacillus bulgaricus, S cremoris, S diacetylactis…

Phomat cũng là món ăn truyền thống của dân vùng khí hậu lạnh Quá trình làm chín và tạo hương cho phomat chính là nhờ các vi khuẩn lactic Hiện nay có rất nhiêu loại phomat nổi tiếng được sản xuất công nghiêp Tùy từng loại phomat mà quá trình lên men có thể do các tập đoàn VSV khác nhau tham gia, thường bao gồm các vi khuẩn propionic, nấm men, nấm mốc, vi khuẩn lactic [7 ]

Ngoài các sản phẩm lên men rau quả tự nhiên như: dưa muối, cà muối, kim chi…ngày nay lên men lactic được sử dụng để ủ chua thức ăn xanh cho gia súc, dự trữ một nguồn thức ăn giàu dinh dưỡng cho gia súc trong suốt mùa đông lạnh [1, 24, 25] Vi khuẩn lactic thường được sử dụng để ủ chua thức ăn xanh là L.plantarum

Khả năng phân giải protein của vi khuẩn lactic được ứng dụng để chế biến và bảo quản thịt cá Trong dân gian, người ta sử dụng lên men lactic để tạo ra các sản phẩm: nem chua, tôm chua, cá muối chua (Việt Nam), salami (Ý), xúc xích, jambon, thịt hun khói (các nước châu âu)…

Gần đây, hệ thống enzym phân giải protein ở Lactococcus đã được nghiên cứu một cách khá đầy đủ mở ra khả năng ứng dụng rộng rãi [2, 47]

Lên men lactic trong bảo quản thịt, cá, và các phế phụ phẩm của chúng dành cho chăn nuôi [3, 58] Các sản phẩm thịt, cá lên men lactic có hàm lượng axit amin tự do cao, mùi vị thơm ngon, lại không bị nhiễm các vi sinh vật gây thối hỏng thực phẩm, các VSV gây bệnh…nên rất được ưa chuộng

Bên cạnh khả năng sinh ra các chất ức chế được ứng dụng trong chế biến, bảo quản thực phẩm, vi khuẩn lactic lên men lactic dị hình còn được sử dụng để tạo ra hương vi cho sản phẩm bảo quản Nhờ khả năng sinh các chất

thơm như diaccetyl, axetaldehyt… của các vi khuẩn lên men lactic dị hình như: L diacetylactis, các sản phẩm lên men lactic (phomat, sữa chua) có mùi thơm và hương vị đặc trưng Lên men lactic dị hình của Leuconostoc oenos trong rượu vang và các sản phẩm nước hoa quả cũng tạo hương thơm đặc trưng và vị chua nhẹ cho các sản phẩm này [75 77, ]

Gần đây, người ta đã phát hiện ra vai trò to lớn của vi khuẩn lactic đối với sức khỏe con người cũng như động vật nuôi Khu hệ vi khuẩn lactic trong đường ruột người và động vật đóng một vai trò quan trọng, chúng cạnh tranh với các VSV gây bệnh, giúp tăng cường tiêu hóa và bảo vệ ruột Những nghiên cứu gần đây về khu hệ VSV trong đường tiêu hóa của người, gia súc, gia cầm [24, , 46 54 đều gắn liền với việc tạo ra các chế phẩm sống giúp cân ] bằng hệ VSV đường ruột [46], giảm lượng cholesteron trong máu, chữa các bệnh rối loạn đường ruột, bệnh không dung nạp lactose, bệnh viêm dạ dày cấp tính và nhiều bệnh đường ruột khác [75] đồng thời tạo ra nhiều thức ăn bổ sung khoáng, vitamin cho người bệnh, những người ăn kiêng và cả gia súc gia cầm

Bên cạnh những mặt có lợi nêu trên, vi khuẩn lactic cũng gây một số tác hại đối với sức khỏe con người cũng như trong công nghiệp Trong công gnhiệp sản xuất rượu vang, bia, nước ngọt, hiện tượng nhiễm một số vi khuẩn lactic (L.manitoporum) sẽ làm vẩn đục và làm chua sản phẩm; có khi gây hư hại cả một giai đoạn quá trình lên men rượu [7 ] Một số vi khuẩn lactic ký sinh ở người, gia súc, gia cầm khi phát triển quá mức sẽ gây bệnh VD: Enterococcus faecalis gây bệnh tim cấp [75]

Vi khuẩn lactic đem lại lợi nhuận to lớn từ các ứng dụng nhiều mặt của chúng Để nâng cao hiệu quả của các ứng dụng đó, trong những năm gần đây, bên cạnh việc thu thập, tuyển chọn các vi khuẩn lactic cho năng xuất cao, người ta đã nghiên cứu áp dụng các tành tựu của sinh học phân tử , kỹ thuật di

truyền trên các vi khuẩn lactic và đã thu được một số thành công nhất định

Đó là các công trình nghiên cứu thiết lập hệ thống biến nạp cho vi khuẩn lactic với các hệ vectơ tách dòng, vectơ biểu hiện [2, 47]

Việc phát hiện ra bacteriocin của vi khuẩn lactic đã mở ra một hướng mới trong công nghiệp chế biến và bảo quản các sản phẩm thực phẩm Bacteriocin của vi khuẩn lactic thực sự là một phát hiện có giá trị trong bảo quản thực phẩm lên men cũng như không lên men Bacteriocin của vi khuẩn lactic có khả năng ức chế chủ yếu các vi khuẩn G+ có quan hệ họ hàng với chủng sinh bacteriocin đó

1.2 Bacteriocin

1.2.1 Lịch sử nghiên cứu về bacteriocin

Năm 1877, Pasteur và Joubert đã lần đầu tiên ghi nhận hiện tượng ức chế lẫn nhau giữa các chủng Bacillus anthracis, một loại vi khuẩn thường được tìm thấy có mặt trong nước tiểu [79] Những nghiên cứu tiếp theo của Florey và cs cũng khám phá ra bệnh than (anthrax) và bệnh bạch hầu (diphtheria) bằng các vi sinh vật không gây bệnh, có tính đối kháng Năm

1925, Gratia đã phát hiện ra sự ảnh hưởng lẫn nhau của hai chủng E coli Đến năm 1928, Roges là người đầu tiên phát hiện ra nisin, một polypeptide do chủng Lactococcus tổng hợp có khả năng ức chế chủng Lactococcus lactis

1946, Gratia và Frederic đã phân lập thành công một chất sinh ra từ chủng E coli V có khả năng ức chế E coli và gọi tên là “colicine” Vào năm 1953, Jacop và cs đã sử dụng thuật ngữ “bacteriocin” làm thuật ngữ chung cho các chất kháng khuẩn có bản chất protein được sinh ra từ vi sinh vật Năm 1982 theo Konisky thì thuật ngữ colicine ngày nay được dùng để chỉ các bacteriocin được sản xuất bởi một số chủng thuộc loài E coli và có quan hệ gần với họ Enterobacteriaceae Chính vì thế mà ý nghĩa ban đầu của thuật ngữ bacteriocin có đặc trưng phổ biến của colicine như: có phổ kháng khuẩn hẹp

và có khả năng bám lên các thụ thể trên bề mặt tế bào [ ] Sau đó, phát hiện26

bổ sung về mối liên quan giữa sự tổng hợp bacteriocin và plasmid Tại đây cho thấy có sự khác nhau giữa colicine và bacteriocin được sinh ra bởi các chủng vi khuẩn G+ [26, 79] Bacteriocin được tổng hợp từ các vi khuẩn G+ không có thụ thể đặc biệt để bám trên bề mặt tế bào, thường có khối lượng thấp hơn colicine, có thể có cơ chế tiêu diệt khác so với colicine, có phổ tác dụng rộng hơn và khác nhau về cách vận chuyển và giải phóng trong tế bào

và nó có thể có trình tự đầu được phân chia trong giai đoạn thành thục [26, 52]

Trong suốt 2 thập kỷ gần đây, bacteriocin - một sản phẩm do vi sinh vật sinh ra có khả năng giết hoặc ức chế sự phát triển của các vi sinh vật khác đã được nghiên cứu rất nhiều về các đặc tính sinh hoá cũng như các đặc điểm về

di truyền ở cấp độ phân tử bởi vai trò của nó trong vấn đề bảo quản Bacteriocin có đặc tính giống như một kháng sinh vì nó có khả năng kháng khuẩn nhưng bacteriocin không phải là kháng sinh Bacteriocin khác với các kháng sinh bởi quá trình tổng hợp, cơ chế tác dụng, phổ tác dụng, tính miễn dịch của chủng sản, đích tấn công,…[28] Bacteriocin có bản chất protein, được tồng hợp ở ribosome và có phổ kháng khuẩn hẹp có khả năng ức chế các

vi khuẩn có quan hệ họ hàng với nó [30, 32 79, ] Theo Joger và cs năm 2000, bacteriocin là một polypeptide được tổng hợp ở ribosome và bị phân huỷ rất nhanh bởi enzyme phân huỷ protein trong hệ tiêu hoá của người Vì vậy, để nghiên cứu bản chất protein của những bacteriocin mới người ta thường thử khả năng nhạy cảm của chúng với các enzyme phân huỷ protein

1.2.2 Bacteriocin của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic không chỉ được biết đến như một vi khuẩn tạo hương trong thực phẩm lên men mà còn tạo ra chất kháng khuẩn – bacteriocin Bacteriocin của vi khuẩn lactic được xem như một giải pháp mới hữu hiệu để

ngăn ngừa những vi khuẩn gây bệnh và vi khuẩn gây thối hỏng trong thực phẩm [20] Vì vậy ngày càng có nhiều phát hiện về các bacteriocin mới do vi khuẩn lactic sinh ra [16, 88, 89] Bacteriocin từ vi khuẩn lactic mang điện tích dương, có chứa khoảng 20 đến 60 axit amin, có điểm đẳng điện cao và có khả năng ức chế các vi khuẩn có quan hệ chủng loại gần với vi khuẩn sinh ra bacteriocin đó [20, 31, 40, 55]

Các bacteriocin từ vi khuẩn lactic được xem là có tiềm năng to lớn trong bảo quản vì hầu hết LAB được coi là an toàn (Generally recognized as safe-GRAS) Chính vì vậy, bacteriocin của vi khuẩn lactic được coi là một nhân tố ức chế “tự nhiên” [31] Các bacteriocin của vi khuẩn lactic thuộc các giống Lactobacillus, Lactococcus, Pediococcus, Enterococcus, Carnobactium, Leuconostoc đang được nghiên cứu rộng rãi [31, 40] Hai nhóm Lactobacillus, Lactococcus đóng vai trò tăng cường chức năng trong thực phẩm lên men, có khả năng ức chế Listeria và các vi khuẩn G+ khác Các nhóm Pediococcus, Enterococcus, Carnobactium và Leuconostoc đang thu được hút được nhiều sự quan tâm vì chúng được xem là nguồn tìm ra các bacteriocin mới [40]

Chi Lactococcus được biết đến với khả năng sinh ra các bacteriocin như: nisin của chủng Lc lactis subsp lactis, diplococcin từ Lc.lactis subsp cremoris và Lactostrepcin(Lac5) là một bacteriocin được sinh ra bởi các - chủng vi khuẩn L lactis subsp lactis không sinh nisin, hầu hết các chủng L lactis subsp diacetylactis và một số chủng L lactis subsp cremoris), bacteriocin S50 (Lc lactis subsp diacetylatis S50) [31] Trong đó, bacteriocin được biết đến nhiều nhất là nisin Bacteriocin nisin được nghiên cứu và được FDA cho phép sử dụng trong bảo quản thực phẩm và hiện nay được ứng dụng ở hơn 50 quốc gia trên thế giới [26, 31, 4 ].4

Chi Pediococcus cũng được biết đến với khả năng sinh ra nhiều bacteriocin như pediocin A do hai chủng P pentosaceus FBB61 và L7230 sinh ra, pediocin PA-1 của chủng P acidilactici PAC 1.0 Đặc biệt vào năm

1987, Bhunia đã tìm ra Pediocin AcH, một bacteriocin được tổng hợp bởi chủng P acidilactici H Khả năng ức chế vi khuẩn Gram âm như Aeromonas hydrophila và P putida của Pediocin AcH đã được Bhunia chứng minh năm

1988 Đây là một phát hiện rất ý nghĩa bởi vì các bacteriocin sinh ra bởi vi khuẩn G+ thường không có khả năng ức chế các vi khuẩn G- 1 [3 ]

Chi Lactobacillus được biết đến với nhiều sản phẩm bacteriocin như: Acidolin và acidophilin được sinh ra bởi Lb acidophilus, reutericin 6 (Lb reuteri LA6), Lactacin B (Lb acidophilus N2 , Lactacin F() Lb acidophilus 88), Lactocin 27 (Lb helveticus LP27) và hevelticin J (L helveticus), Plantaricin A (Lb plantarum C–11), Plantaricin UG1 (Lb plantarum UG1)…Các vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus còn được biết có khả năng sinh

ra chất có khả năng ức chế cả vi khuẩn G âm và G dương Lb reuteri được phát hiện có khả năng sinh ra reuterin, một chất có khối lượng phân tử thấp, không có bản chất protein Ngoài khả năng tác dụng với các chủng vi khuẩn G+ (thuộc chi Clostridium, Staphylococcus, Listeria), reuterin còn có thể ức chế các chủng vi khuẩn G- (thuộc chi Samonella, Shigella cũng như Candida

và Trypanosoma) Đây là các đặc điểm không có ở bacteriocin Người ta còn tìm thấy một sản phẩm khác của vi khuẩn lactic là reutericyclin thu được từ chủng L reuteri LTH2584 không phải là một bacteriocin nhưng tích điện âm,

có khối lượng phân tử 349 Reutericyclin có tác dụng chống lại các vi khuẩn

G dương nhưng không có tác dụng đối với các vi khuẩn G âm [31 ]

Chi Carnobacterium có khả năng sinh ra một số bacteriocin như: Carnocin UI49, Piscicolin 126 do chủng C piscicola JG126 sinh ra, Carnocin CP51 và CP52 từ chủng C piscicola CP5… Piscicolin 126 của chủng C

piscicola JG126 thu được từ jambon hỏng cho thấy có hoạt tính chống lại L monocytogenes và các vi khuẩn G âm khác Đây chính là một điểm rất đáng chú ý về các bacteriocin của LAB [31]

Chi Leuconostoc tổng hợp một số các bacteriocin như mensenteroicin 52A và 52B là sản phẩm của chủng Ln mensenteroides subsp mensenteroides FR52, Leucosin A-TA33a từ chủng Ln mensenteroides TA33a, Leucocin H

do chủng Leuconostoc sp MF215B sinh ra… Leucocin H là một bacteriocin

có chuỗi polypeptide kép gồm 2 chuỗi đơn là leucocin Hα và Hβ đều có 40 aa

và có khả năng ức chế vi khuẩn G dương như: L monocytogenes, B cereus,

C perfringen Leuconocin S bacteriocin thu được từ chủng L paramesenteroides có hoạt tính chống lại L monocytogenes, S aureus, Yersinia enterocolitica và một chủng thuộc loài C botulinum

Các bacteriocin của chi Eterococcus gồm có: Enterocin CRL 35 do chủng E faecium CRL35 sinh ra, enterocin B, P, 50A, 50B Enterocin P từ Enterococcus faecium có hoạt tính kháng Listeria rất mạnh Bacteriocin này

có trình tự tương đồng với pediocin, bền ở 1210C trong 15 phút và có hoạt tính kháng C botulinum [31 ]

1.2.2.1 Phân loại bacteriocin

Năm 1993, Klaenhamer đã phân loại bacteriocin thành 4 nhóm dựa trên đặc điểm chính [53]:

Nhóm I: bao gồm các bacteriocin gọi chung là lantibiotic, có khối lượng < 5kDa, có chứa axit amin dị thường lanthionine (Lan), α–methyllanthionin (MeLan), dehydroalanine, và dehydrobutyrine Dựa vào cấu trúc hoá học và hoạt tính kháng khuẩn nhóm I lại được chia thành loại A và B lantibiotic

Lantibiotic loại A có chuỗi peptid dài và mang điện tích dương Chúng tấn công vào vi khuẩn thông qua các lỗ trên màng tế bào Một số lantibiotic

loại A điển hình như: nisin từ L lactis, lactocin S từ Lactobacillus sake, epidermin từ Staphylococcus epidermidis và Streptococcus mutants, gallidermin từ S epidermidis và lacticin 481 từ L lactis Loại B lantibiotic là peptid dạng cầu có kích thước nhỏ hơn, tích điện âm hoặc không mang điện Hoạt tính kháng khuẩn của chúng có liên quan tới sự ức chế của các enzym đặc hiệu Đại diện cho nhóm này như: mersacidin từ Bacillus subsp.; cinnamycin từ Streptomyces cinnamoneus; ancovenin và duramycin từ Streptomyces và Streptoverticilium

Nhóm II: Các bacteriocin có kích thước < 10kDa, bền nhiệt và tác động lên màng tế bào IIA là các bacteriocin giống như pediocin có hoạt tính kháng listeria IIB là các bacteriocin có cấu trúc gồm 2 chuỗi peptid

Nhóm III bacteriocin là một nhóm có chứa các protein có kích thước > 30kDa, không bền bền nhiệt và không đặc trưng (vd: heveticins J và V – 1829 (Lactobacillus heleveticus))

Nhóm IV là các bacteriocin cần các thành phần phức hợp với lipid hay cacbonhydrat để thể hiện hoạt tính

Theo Cotter và cs, 2005 bacteriocin được sinh ra bởi các vi khuẩn G+ thường được chia thành 3 nhóm dựa trên khối lượng phân tử của chúng [30]

Nhóm I và nhóm III bacteriocin theo phân loại của Cotter và cs cũng được chia tương tự như theo phân loại của Klaenhamer, chỉ có sự khác biệt trong phân loại nhóm II Nhóm II là nhóm chứa các peptid nhỏ có kích thước

< 10kDa, bền nhiệt, không chứa vòng lanthionin Chúng có thể được chia làm

3 dưới nhóm: IIa bao gồm các peptid như pediocin có một đầu cuối N có cùng trình tự -Tyr Gly Asn Gly Val Xaa Cys Chúng được quan tâm hơn vì có thể - - - -hiện hoạt tính kháng Listeria Một số bacteriocin tiêu biểu thuộc nhóm này như: Sakacins A và P, leucocinA-UAL187, Leucocin A UAL187, divercin -V41 Lớp IIb gồm có các bacteriocin cần hai peptid khác nhau để có hoạt tính

Ví dụ như: lactococcin G và M lactacin F, plantaricins A, S, EF, JK Lớp IIc , gồm có acidocin B, carnobacteriocin A, divergicin A và enterocins P

Dựa trên cơ sở phân loại của Klaenhamer(1993), Cotter (2005), Heng

và cs (2007), Riley và cs [73] đã đưa ra khóa phân loại mới cho các bacteriocin của vi khuẩn G dương Các bacteriocin của vi khuẩn G+ được chia thành 4 nhóm:

Nhóm I: gọi chung là lantibiotic lại được chia thành 3 nhóm nhỏ IA,

IB, IC Loại A gồm các peptid mạch thẳng và chúng lại được chia thành 2 dưới nhóm là: dưới nhóm AI như nisin A, nisin U, streptin dưới nhóm AII ; như SA FF22, lacticin 481, salivaricin A Loại B gồm các peptid dạng cầu -như mersacidin, cinnamycin Loại C gồm: lacticin 3147, cytolysin

Nhóm II là nhóm bacteriocin nhỏ (< 10kDa), và không có quá trình cải biên sau dịch mã Bacteriocin lại được chia làm 3 nhóm IIA, IIB, IIC Nhóm IIA gồm các bacteriocin như: pediocin PA1, Carnobacteriocin B2, ubericin A Nhóm IIB gồm: lactococcin G, thermophilin 13, enterocin L50, plantaricin NC8 và C11 Nhóm IIC bacteriocin gồm có sakacin Q, sakacins T và X, mutacins IV và V

Nhóm III là các bacteriocin có kích thước > 10 kDa Nhóm này lại được chia thành 2 nhóm nhỏ IIIA là các bacteriolysin (bacteriolytic enzyme) như: lysostaphin từ Staphylococcus simulans subsp staphilolyticus, Mellericin

B từ Streptococcus milleri, enterolysin A từ E faecalis Nhóm IIIB là các non-lytic bacteriocin Nhóm này bao gồm: helveticin J từ Lb helveticus, streptococcin A-M57 do chủng Streptococcus pyogenes sinh ra

Nhóm IV là các bacteriocin như: enterocin AS – 48, gassericin A,reutericin 6, uberolysin

1.2.2.2 Cụm gen sinh tổng hợp bacteriocin

Xác định cấu trúc di truyền của bacteriocin nhóm I và II hầu hết dựa trên các kết quả nghiên cứu về nisin và tiềm năng ứng dụng của 2 lớp này Bacteriocin được tổng hợp ở ribosome và cụm gen mã hoá cho tính miễn dịch

và khả năng sinh bacteriocin thường là một peron Cụm gen sinh bacteriocin o

có thể là gen trên nhiễm sắc thể (như subtilin và mersacidin); hoặc trên plasmid (như divergicin A, sakacin A); hoặc là gen nằm trên gen nhảy như nisin và lacticin 481

Phân tích sự tổng hợp một số lantibiotic như epodermin, nisin, subtilin, lacticin 481 và mersacidin ở cấp độ di truyền cho thấy rằng cụm gen mã hoá cho sự tổng hợp lantibiotics có chứa các gen mã hoá cho: prepeptide (LanA), cho các enzym cho phản ứng cải biên (LanB,C; LanM), mã hoá cho proteases

để phân cắt loại bỏ peptide đầu tiên (LanP), ABC (ATP[adenosine triphosphate]-binding cassette), một họ các protein vận chuyển (LanT), protein điều hòa (LanR, K) và các protein liên quan đến khả năng tự miễn dịch (LanI, FEG) Đặc điểm di truyền của rất nhiều bacteriocin nhóm II như: lactococcins A, B, M; pediocin PA – 1/AcH và plantaricin A đã được nghiên cứu Gen mã hóa cho sự sinh tổng hợp của bacteriocin nhóm II bao gồm các gen mã hóa cho các precusor peptid, gen miễn dịch, gen mã hóa cho nhân tố vận chuyển ABC và các protein accessory, trong một số trường hợp còn cho thấy có các gen điều hòa Các protein accessory tuy không cho thấy có ở các lantibiotics nhưng nó lại rất cần thiết để thể hiện hoạt tính của bacteriocin nhóm II [31]

1.2.2.3 Cơ chế sinh tổng hợp [31 1 2, 4 , 4 , 84]

Cơ chế sinh tổng hợp lantibiotic theo một sơ đồ chung bao gồm sự hình thành các prepeptide, các phản ứng cải biên, sự cắt bỏ peptide đầu tiên, và quá trình vận chuyển các prepeptide đã được cải biên hay các propeptide mature

thông qua màng tế bào chất Sự cắt bỏ đầu peptid có thể được ưu tiên trước, trong hoặc sau quá trình vận chuyển ra ngoài tế bào Dựa trên con đường sinh tổng hợp, gen sinh tổng hợp lantibiotic lại được chia ra làm 2 nhóm Nhóm I lantibiotic như nisin, epidermin, subtilin và pep5 thì phản ứng loại nước có thể được xúc tác thủy phân bởi enzym LanB, trong khi LanC lại liên quan tới

sự hình thành các thioether Các prepeptide được phân cắt gần vị trí serin nhờ protease LanP và được vận chuyển thông qua nhân tố vận chuyển ABC LanT Ngược lại, lantibiotic nhóm II như cytolysin, lacticin 481, mersacidin có khả năng lại chịu tác dụng của một enzym LanM và quá trình thay thế đồng thời với sự vận chuyển bởi LanT(P) Lactocin S là một trường hợp ngoại lệ của nhóm này Nó cũng được cải biên nhờ một enzym LanM và quá trình thay thế

ưu tiên xảy ra trước quá trình vận chuyển do đó nó được xếp vào nhóm mới

Hình 1.3 Sơ đồ con đường sinh tổng hợp lantibiotics:

1: Sự hình thành prebacteriocin; 2: Các tiền bacteriocin được cải biên nhờ LanB, LanC, vận chuyển thông qua nhân tố vận chuyển chuyên dụng ABC LanT, xử lý phân cắt với LanP, kết quả thu được bacteriocin mature; 3: Histidine protein kinase(HPK) cảm ứng với sự có mặt của bacteriocin và sau

đó xảy ra quá trình tự phosphoryl hóa; 4: Nhóm phosphoryl được chuyển tới

nhân tố protein điều hoà (RR- response regulator); 5: RR hoạt động phiên mã của gen điều hoà; 6: Quá trình sinh miễn dịch

Nhóm II bacteriocin được tổng hợp là một prepeptide có chứa đầu cuối

N được bảo tồn và có vị trí thuỷ phân ở 2 vị trí glycine đặc trưng Không giống như các lantibiotic, chúng không phải trải qua quá trình kéo dài sau dịch mã Sau khi các prepeptide được hình thành, chúng xảy ra quá trình loại

bỏ peptide đầu tiên đồng thời với việc giải phóng ra ngoài tế bào thông qua nhân tố vận chuyển ABC (ABC transporter) và các protein accessory (protein

hỗ trợ)

Hình 1.4 Sơ đồ con đường sinh tổng hợp bacteriocin nhóm II

1: Sự hình thành prebacteriocin và prepeptide của nhân tố cảm ứng IF (induction factor); 2: prebacteriocin và pre-IF được di chuyển nhờ ABC – transporter kết quả tạo ra bacteriocin hoàn chỉnh và IF; 3: HPK (histidine protein kinase cảm ứng với sự có mặt của IF và quá trình tự phosphoryl hoá); 4: Nhóm phosphoryl được chuyển tới nhân tố đáp ứng điều hoà (RR); 5: RR kích hoạt sự phiên mã của gen điều hoà; 6: Quá trình sinh miễn dịch

Một số công bố đã nêu được vai trò chức năng của các prepeptid chúng

có thể đáp ứng như một vị trí nhận biết trực tiếp để thu được các protein trưởng thành và protein vận chuyển, bảo vệ chủng sản giữ được hoạt tính lantibiotic ở trạng thái bất hoạt trong khi nó ở trong chủng sản xuất, và tương tác với các vùng của propeptide để đảm bảo cho sự phù hợp cho tương tác trong phản ứng giữa enzym và cơ chất

1.2.2.4 Điều hòa sinh tổng hợp bacteriocin

Sự điều hoà quá trình sinh tổng hợp lantibiotic và nonlantibiotic thông thường được biết đến gồm có sự tham gia của 2 hệ thống điều hoà Những hệ thống điều hoà này gồm có 2 protein tín hiệu, một là HPK giới hạn màng tế bào và một là nhân tố RR tế bào chất Trong con dường truyền tín hiệu này,

sự tự phosphoryl hoá HPK vẫn giữ đầu khử histidine ở trong tế bào khi nó cảm ứng với sự có mặt của bacteriocin trong môi trường Nhóm phosphoryl

sẽ được chuyển tới vùng đầu khử của acid aspartic trên vùng thụ thể RR và kết quả là gây ra các chuyển động của phân tử bên trong từ đó dẫn tới việc khởi động các nhân tố đáp ứng điều hoà nhằm kích hoạt sự phiên mã của các gen điều hoà Những gen điều hoà này bao gồm gen cấu trúc, gen vận chuyển, gen miễn dịch và trong một số trường hợp là gen tự điều hòa

Phân tử bacteriocin tự nó có thể hoạt động giống như tín hiệu bên ngoài, như trong trường hợp của nisin và subtilin, thì quá trình tự điều hoà sinh tổng hợp riêng thông qua tín hiệu vận chuyển Ngược lại, hầu hết các chủng sinh bacteriocin nhóm II có khả năng sinh ra chuỗi peptide giống như bacteriocin nhưng lại không có hoạt tính kháng khuẩn và nó được sử dụng làm nhân tố cảm ứng IF để kích hoạt quá trình phiên mã của các gen điều hoà

IF là một peptide nhỏ, bền nhiệt, tích điện dương, kị nước được tổng hợp đầu tiên dưới dạng prepeptide có trình tự đầu glycine kép Các ABC transporter chuyên dụng đặc trưng phân cắt trình tự đầu của IF đồng thời với việc giải

phóng peptide hoàn chỉnh từ tế bào Các IP được tiết ra hoạt động giống như một tín hiệu bên ngoài nhằm khởi động quá trình phiên mã của các gen bao gồm cả trong sản phẩm bacteriocin Đối với các chủng sinh bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn, chúng cũng tự sinh miễn dịch nhằm bảo vệ bản thân chống lại các bacteriocin do chúng sinh ra Có hai hệ thống miễn dịch lantibiotic đã được phân loại Sự bảo vệ có thể xảy ra ngay bởi protein miễn dịch LanI và nhân tố protein ABC vận chuyển chuyên dụng LanFEG được mã hoá rất nhiều trên ORF Hai hệ thống này hỗ trợ nhau để bảo vệ các tế bào sinh bacteriocin khỏi tác động của chính bacteriocin đó LanI có khả năng nhất trong việc gắn với màng bên ngoài của tế bào chất, tạo một lớp chắc chắn trên màng tế bào của chủng sinh bacteriocin để ngăn chặn quá trình hình thành lỗ trên màng tế bào chủng sản khi có tác động của bacteriocin LanFEG

có thể kích hoạt phân tử bacteriocin vận chuyển cài lại bên trong màng tế bào quanh vị trí tiếp xúc với môi trường xung quanh và vì thể nó giữ cho nồng độ bacteriocin trong màng tế bào thấp hơn mức giới hạn nên không ảnh hưởng đến chủng sinh ra

Gen sinh miễn dịch của bacteriocin nhóm II thông thường mã hoá cho các protein chuyên dụng tương tác lỏng lẻo với màng tế bào chất Protein miễn dịch tích điện dương và có kích thước trong khoảng từ 51 đến 254 axit amin, cung cấp toàn bộ tính miễn dịch chống lại protein của chủng sản Các protein này được sử dụng để nghiên cứu sự tương tác giữa protein miễn dịch với sự bảo vệ màng tế bào chủng sản chống lại chống lại bacteriocin của chính chủng đó

1.2.2.5 Cơ chế tác dụng

Bacteriocin của vi khuẩn lactic dù thuộc nhóm này hay nhóm khác nhưng chúng đều có cơ chế tác dụng chung: Chúng gây ra hiện tượng suy yếu hoặc phá vỡ lực đẩy proton (PMF: proton motive force) trong các bào quan

sinh năng lượng như liposome và trong toàn bộ tế bào của vi sinh vật nhạy cảm với bacteriocin đó [20, 3 ] Lực đẩy proton là lực điều khiển nhiều quá 1trình sống đòi hỏi năng lượng nội chất của tế bào vi khuẩn Do lực đẩy proton đóng một vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi năng lượng của tế bào nên sự phá vỡ hoặc làm suy giảm lực này sẽ dẫn đến tình trạng thiếu hụt ATP trong tế bào; khả năng vận chuyển chất dinh dưỡng cũng như duy trì các cofactor như K+, Mg2+…bị ức chế và cuối cùng dẫn đến giết chết tế bào VSV nhạy cảm với các bacteriocin đó [20]

Nisin, một bacteriocin được tổng hợp từ một vài chủng Lc lactis, là bacteriocin của vi khuẩn lactic được ghiên cứu kỹ nhất Nisin phá vỡ thế năng của màng tế bào của vi sinh vật nhạy cảm với nó, sau đó làm suy giảm lực vận động proton trong các liposome của các tế bào Listeria monocytogenes và Clostridium sporogenes

Theo Belkum và cộng sự thì lactococcin A do Lc lactis subsp cremoris sinh ra cũng phá vỡ thế năng của màng tế bào VSV nhạy cảm, ức chế sinh tổng hợp axit amin và là nguyên nhân gây thất thoát các axit amin tiền tích tụ trong tế bào nhạy cảm

Lactacin F của Lb johnsonii thì làm tăng cường tính thấm của màng tế bào nhạy cảm dẫn đến hiện tượng thoát K+ ra ngoài môi trường, phá vỡ lực vận động proton của tế bào Mặc dù ATP không bị thoát ra ngoài nhưng sự sinh tổng hợp ATP trong nội bào bị ức chế và cuối cùng gây chết tế bào

1.2.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp bacteriocin

Quá trình sinh tổng hợp bacteriocin chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố môi trường thành phần môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy.,

Ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy

Cacbon là nguồn cung cấp năng lượng chính cho quá trình sinh trưởng cũng như sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn lactic Do vậy, nguồn C của môi trường có ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất sinh tổng hợp bacteriocin Hàm lượng đường thích hợp cho sinh trưởng và phát triển đạt mức tối

ưu không phải bao giờ cũng trùng với hàm lượng đường thích hợp cho sinh tổng hợp bacteriocin đạt mức tối ưu Chẳng hạn như chủng Lc Lactis subsp lactis NIZO22186 đạt sinh trưởng, phát triển tối ưu ở môi trường có hàm lượng sucrose ban đầu là 20g/l (gấp 1,5 lần trong môi trường có hàm lượng sucrose ban đầu là 10g/l) Tuy nhiên, sinh tổng hợp nisin của chủng lạI đạt tốI

ưu trên môi trường có hàm lượng C ban đầu là 10g/l [34]

Ngoài ra, các chủng khác nhau đòi hỏi hàm lượng đường trong môi trường ban đầu khác nhau để đạt mức sinh tổng hợp bacteriocin tối ưu Chủng Enterococcus faecium ST311LD đòi hỏi lượng sucrose tối ưu cho khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chúng là 10g/l [95] trong khi đó chủng Lc lactis 354/07 (NCDO 497) cho hàm lượng nisin cao nhất trên môi trường ban đầu có hàm lượng glucose là 25g/l còn đối với chủng Lc.lactis subsp lactis NIZO 22186 lại đòi hỏi môi trường có hàm lượng glucose ban đầu là 10g/l để sinh tổng hợp bacteriocin đạt mức cao nhất [15 4] , 3

Trong một giới hạn nào đó, sự tăng hàm lượng đường thì sẽ kéo theo sự tăng cường sinh tổng hợp bacteriocin nhưng ra khỏi giới hạn đó thì càng tăng hàm lượng đường lại càng làm giảm sinh tổng hợp bacteriocin của chủng đó

Trong phân tử bacteriocin bao giờ cũng có phần protein hoạt tính, do vậy, quá trình sinh tổng hợp bacteriocin bao giờ cũng cần nguồn nguyên liệu nitơ hữu cơ hoặc nitơ vô cơ Sự thiếu hụt các thành phần này chắc chắn đem lại ảnh hưởng xấu cho quá trình sinh tổng hợp bacteriocin: khi thêm 2% cao nấm men vào môi trường để nuôi cấy Streptococcus mutants sẽ đẩy mạnh khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng [79] Đối với chủng Enterococcus

faecium ST311LD việc bổ sung hàm lượng cao nấm men là 1,25% sẽ làm tăng khả năng sinh tổng hợp bacteriocin lên 12.800AU/ml [82]

Sự có mặt của các axit amin khác nhau cũng có ảnh hưởng khác nhau đến quá trình sinh tổng hợp De Vuyst và cs đã nhận thấy rằng: sự có mặt của serin, threonin và systein hoặc cysthothionin kích thích mạnh tới quá trình lên men nisin của chủng Lc lactis subsp lactis bởi các axit amin này đều có mặt trong thành phần hóa học của nisin; sự có mặt của alanin, prolin, hydroprolin lại ức chế khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng Lc lactis subsp lactis [ ] 34

Ngoài C và N, rất nhiều yếu tố khác của môi trường cũng ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp bacteriocin

Các ion khoáng Mn2+, Mg2+ đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc của các cofactor trong quá trình trao đổi chất và năng lượng của vi sinh vật Do vậy, chúng cũng đóng một vai trò nhất định trong quá trình tổng hợp bacteriocin VD: nồng độ muối MnSO4.7H2O thấp (0.014%) đã kích thích tăng sinh tổng hợp bacteriocin plantaricin 423 [34] Trong khi đó, thêm MgSO4.7H2O vào môi trường ban đầu sẽ kích thích tăng trưởng của chủng L plantarum 423 nhưng không có ảnh hưởng gì đến sinh tổng hợp của plantaricin 423

Người ta cũng nhận thấy rằng tăng độ nhớt của môi trường lỏng bằng cách thêm agar, dextran, glycerol hoặc tinh bột cũnh làm tăng năng suất sinh tổng hợp bacteriocin của staphylococcus 1580 [34]

Việc bổ sung các vitamin cũng cho thấy chúng làm tăng khả năng sinh tổng hợp bacteriocin Khi bổ sung vitamin C vào môi trường nuôi cấy chủng Enterococcus faecium ST311LD thì thu được hoạt tính bacteriocin là 12.800AU/ml, cũng với chủng này khi bổ sung vitamin B12 và B1 thì hoạt tính thu được chỉ là 6.400AU/ml [82]

Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy

Thời gian nuôi cấy có ảnh hưởng rất nhiều đến năng suất sinh tổng hợp bacteriocin Tùy từng chủng vi khuẩn lactic mà năng suất sinh bacteriocin đạt cực đại ở các giai đoạn khác nhau trong pha log của chúng

Todorov và cs cho biết sản lượng bacteriocin ST311LD đạt cực đại sau

19 – 22h nuôi cấy sau đó giảm dần [82] Theo Schegel và Slade cho biết sản lượng streptocin STH1 đạt cực đại trong suốt pha log và giảm rõ rệt khi bắt đặt đầu pha cân bằng Ngược lại, streptococin A FF22 lại chỉ được tổng bắt - đầu tổng hợp ở cuối pha log và hoạt tính giảm dần theo thời gian nuôi cấy

Cũng như tất cả các vi sinh vật khác, sự sinh trưởng, phát triển và khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của các vi khuẩn lactic còn phụ thuộc nhiều vào độ pH ban đầu Giới hạn pH tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp bacteriocin phụ thuộc vào từng loài vi khuẩn lactic Quá trình sinh tổng hợp nisin từ Lc lactis lại đạt mức tối ưu ở pH = 6.8 và sinh tổng hợp enterocin

1146 thì tăng lên ở pH trung tính [69]

Bên cạnh pH và thời gian, nhiệt độ cũng là một nhân tố ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh tổng hợp bacteriocin Nhiệt độ nuôi cấy để đạt sinh trưởng

và phát triển tối ưu đôi khi không trùng với nhiệt độ để đạt sinh tổng hợp bacteriocin cao Theo Mitra và cs (2005) chủng Lactococcus lactis phân lập

từ sữa lên men đạt sinh trưởng cực đại ở 370C trong khi nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp bacteriocin là 300C [65]

1.2.2.6 Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên độ bền của bacteriocin từ vi

khuẩn lactic

Phần lớn các bacteriocin của vi khuẩn lactic có tính bền nhiệt vừa phải hoặc cao trong khi chúng thường thể hiện hoạt tính cao nhất ở pH axit Hevelticin V – 1289 mất hoạt tính khi xử lý ở 500C trong 30 phút, bền vững ở

pH 2.5 – 6.5 86[ ]; Plantaricin 423 là bacteriocin bền nhiệt, hoạt tính vẫn còn

khi xử lý nhiệt 1000C trong 30 phút hoặc 800C trong 60 phút [87] Enterocins của chủng Enterococcus faecium JCM 5804T cho thấy hoạt tính bền ở 1000C trong 30 phút [70]

1.2.2.7 Ứng dụng của bacteriocin của vi khuẩn lacic:

Do dặc tính bền nhiệt, bền vững trong điều kiện pH axit hoặc trung tính, bacteriocin là một giải pháp hay trong bảo quản thực phẩm lên men cũng như không lên men

Đối với thực phẩm lên men, người ta bổ sung vào đó các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ thịt có khả năng sinh bacteriocin như là giống khởi động [45] Các vi khuẩn lactic này tạo ra pH thấp và bacteriocin ức chế các VSV gây thối cũng như các VSV gây bệnh vốn có trong các sản phẩm tự nhiên Do đó, sản ph m lên men vừa có hương vị thơm ngon lại vừa an toàn ẩcho sử dụng

Đối với các sản phẩm thực không lên men (thịt, cá, rau xanh…), bacteriocin đóng vai trò là chất bảo quản, giữ cho thực phẩm được tươi sống lâu hơn do nó ức chế sự sinh trưởng và phát triển của VSV gây thối, VSV gây bệnh trong sản phẩm tự nhiên

Bacteriocin của vi khuẩn lactic không những bảo quả thực phẩm được lâu hơn, tươi hơn mà còn không tạo ra màu sắc, mùi khó chịu cho sản phảm bảo quản Hơn nữa, chúng được coi là an toàn đối với người sử dụng và làm hạn chế hiện tượng kháng thuốc [58]

Theo tác giả B Ten Brink thì bacteriocin của vi khuẩn lactic cò được

sử dụng trong các nghiên cứu phân loại

Một loại bacteriocin của vi khuẩn lactic được sử dụng như một sản phẩm thương mại trong bảo quản thực phẩm là nisin Nisin đầu tiên được sản xuất dưới dạng thương phẩm là nisin A với tên thương mại là Nisaplin Nisin được quan tâm nghiên cứu rất nhiều cả ở trong phòng thí nghiệm cũng như