Trang 1 YỄN THỊ ĐÀTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI--- LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌCCÔNG NGHỆ SINH HỌC NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC 1B Trang 2 --- LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM S
NGUYỄN THỊ ĐÀ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI B - LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC 2006 - 2008 Hà nội 2008 NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP BACTERIOCIN CỦA MỘT SỐ CHỦNG LACTOCOCCUS PHÂN LẬP TỪ SỮA B NGUYỄN THỊ ĐÀ HÀ NỘI, 2008 Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! 17057205018541000000 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP BACTERIOCIN CỦA MỘT SỐ CHỦNG LACTOCOCCUS PHÂN LẬP TỪ SỮA 04.3898 NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ ĐÀ Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS LÊ THANH BÌNH HÀ NỘI, 2008 ii LỜI CÁM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc PGS.TS Lê Thanh Bình – Phịng Các chất hoạt tính sinh học từ vi sinh vật – Viện Công nghệ sinh học, nhiệt tình dạy bảo, truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho tơi suốt q trình nghiên cứu để tơi hồn thành luận văn Tơi xin cám ơn Th.S Hoa Thị Minh Tú - Phòng Các chất hoạt tính sinh học từ vi sinh vật – Viện Cơng nghệ sinh học, nhiệt tình giúp đỡ tơi q trình thực luận văn Tơi xin chân thành cám ơn trung tâm đào tạo sau đại học, trường Đại học Bách khoa Hà Nội; Ban Lãnh Đạo viện Công nghệ sinh học – Viện Khoa học Cơng nghệ Việt Nam tồn thể thầy cô giáo dạy dỗ tạo điều kiện cho thực luận văn Tôi xin gửi lời cám ơn tới tất anh chị, bạn đồng nghiệp Phịng Các chất hoạt tính sinh học từ vi sinh vật – Viện Công nghệ sinh học giúp đỡ suốt thời gian học tập nghiên cứu Cuối xin cảm ơn gia đình, bạn bè, người thân ln ủng hộ góp ý cho tơi suốt thời gian học tập công tác Hà Nội, ngày tháng năm 2008 Nguyễn Thị Đà iii MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa……………………………………………………………… i Lời cám ơn………………………………………………………………… ii Mục lục…………………………………………………………………… iii Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt…………………………………… v Danh mục bảng………………………………………………………… vi Danh mục hình vẽ, đồ thị……………………………………………… viii MỞ ĐẦU………………………………………………………………… Chương - TỔNG QUAN……………………………………………… 1.1 Vi khuẩn lactic………………………………………………………… 1.1.1 Giới thiệu chung…………………………………………………… 1.1.2 Sự phát sinh loài…………………………………………………… 1.1.3 Phân loại vi khuẩn lactic 1.1.4 Ứng dụng vi khuẩn lactic……………………………………… 10 1.2 Bacteriocin…………………………………………………………… 14 1.2.1 Lịch sử nghiên cứu bacteriocin………………………………… 14 1.2.2 Bacteriocin vi khuẩn lactic…………………………………… 15 Chương – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP………………………… 34 2.1 Chủng giống môi trường………………………………………… 34 1 Môi Chủ trường…………………………………………………………… i i h ật 34 2.1.2 34 2.2 Phương pháp nghiên cứu…………………………………………… 35 2.2.1 Xác định hoạt tính bacteriocin……………………………………… 35 2.2.2 Quan sát hình thái tế bào…………………………………………… 37 2.2.3 Xác định số đặc điểm sinh lý, sinh hóa ……………………… 37 iv 2.2.4 Xác định khả kháng kháng sinh nisin…………………… 39 2.2.5 Phương pháp lên men thu hồi bacteriocin dung môi……… 39 2.2.6 Xác định số đặc điểm bacteriocin………………………… 40 2.2.7 Tách chiết DNA plasmid…………………………………………… 41 2.2.8 Điện di protein gel polyacrylamide (SDS – PAGE)………… 42 Chương – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……………………………… 45 3.1 Nghiên cứu số đặc tính chủng………………………… 45 3.1.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa ……………………………… 45 3.1.2 Đặc tính kháng kháng sinh kháng nisin………………………… 47 3.1.3 Nghiên cứu nhu cầu dinh dưỡng tác động yếu tố môi trường sinh tổng hợp bacteriocin chủng………………… 54 3.2 Nghiên cứu thu hồi bacteriocin phương pháp kết tủa ethanol 72 3.3 Nghiên cứu số tính chất chế phẩm………………………… 74 3.3.1 Ảnh hưởng pH lên độ bền bacteriocin thu hồi……… 74 3.3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ lên độ bền bacteriocin thu hồi… 76 3.3.3 Ảnh hưởng kết hợp nhiệt độ pH lên độ bền bacteriocin thu hồi………………………………………………………… 78 3.3.4 Phản ứng với enzyme phân hủy protein……………………… 80 3.3.5 Phân tích điện di protein gel polyacrylamid (SDS-PAGE)…… 81 Chương - KẾT LUẬN …………………….…………………………… 83 TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………… 85 v DANH MỤC CÁC THUẬT NGỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT CHỮ VIẾT TẮT CHỮ VIẾT ĐẦY ĐỦ APS Amoni persulfate AU Activity unit – đơn vị hoạt tính bp Base pair – cặp bazơ BU Bacteriocin unit – Đơn vị bacteriocin cs Cộng DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethilenediaminetetra acetic acid G- Vi khuẩn Gram âm G+ Vi khuẩn Gram dương GRAS Generally recognized as safe – coi an toàn IU International unit – Đơn vị quốc tế LAB Lactic acid bacteria – vi khuẩn lactic MIC Minimal inhibition concentration – Nồng độ ức chế tối thiểu MRS De Man - Rogosa - Shape SDS Sodiumdodecylsulfat STT Số thứ tự TE Tris - EDTA VSV Vi sinh vật vi DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa chủng 46 Bảng 3.2 Tính nhạy kháng sinh chủng PĐ14, BV20, PĐ2.9 49 Bảng 3.3 Số lượng tế bào chủng nghiên cứu sống sót 52 môi trường bổ sung nisin nồng độ khác Bảng 3.4 Khả sinh trưởng sinh tổng hợp bacteriocin 55 chủng PĐ 14, BV20 PĐ 2.9 Bảng 3.5 Động thái sinh trưởng, sinh tổng hợp bacteriocin 56 chủng Bảng 3.6 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả sinh 60 tổng hợp bacteriocin Bảng 3.7 Ảnh hưởng pH ban đầu đến khả sinh trưởng 64 sinh tổng hợp bacteriocin Bảng 3.8 Ảnh hưởng NaCl đến khả sinh trưởng sinh 66 tổng hợp bacteriocin chủng BV20, 2.9, PĐ14 Bảng 3.9 Khả sinh trưởng sinh tổng hợp bacteriocin 68 chủng môi trường có nguồn cacbon khác 10 Bảng 3.10 Ảnh hưởng hàm lượng sacharose lên sinh 70 trưởng sinh tổng hợp bacteriocin chủng 11 Bảng 3.11 Ảnh hưởng nguồn N đến sinh trưởng sinh tổng 71 hợp bacteriocin chủng 12 Bảng 3.12 Hoạt tính bacteriocin kết tủa nồng độ ethanol 72 khác 13 Bảng 3.13 Kết thu hồi sản phẩm bacteriocin phương pháp kết tủa ethanol 73 vii 14 Bảng 3.14 Ảnh hưởng pH đến độ bền hoạt tính bacteriocin 75 15 Bảng 3.15 Ảnh hưởng nhiệt độ đến độ bền bacteriocin 77 chủng 16 Bảng 3.16.Ảnh hưởng kết hợp nhiệt độ pH lên độ bền 79 bacteriocin 17 Bảng 3.17 Ảnh hưởng số enzym lên độ bền bacteriocin 80 viii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1 Sơ đồ phát sinh vi khuẩn lactic bao gồm số vi khuẩn hiếu khí kỵ khí tùy tiện dựa hàm lượng G+C Hình 1.2 Hai đường để lên men glucose Hình 1.3 Sơ đồ đường sinh tổng hợp lantibiotics 22 Hình 1.4 Sơ đồ đường sinh tổng hợp bacteriocin nhóm II 23 Hình Quy trình xác định hoạt tính bacteriocin phương pháp 36 khuếch tán thạch Hình 3.1 Ảnh Nhuộm G kính hiển vi Olimpus CH - độ phóng 45 đại 1000 lần Hình 3.2 Đặc điểm hình thái tế bào chủng vi khuẩn lactic chụp 45 kính hiển vi điển tử (phóng đại 10.000 lần) Hình 3.3 Kết điện di plasmid chủng nghiên cứu 51 Hình 3.4 Đồ thị tỷ lệ phần trăm số tế bào sống sót mơi trường bổ 53 sung nisin nồng độ khác 10 Hình 3.5 Hoạt tính bacteriocin tế bào chủng BV20 sống sót 54 môi trường bổ sung nisin nồng độ khác 11 Hình 3.6 Động thái sinh trưởng sinh tổng hợp bacteriocin 57 chủng PĐ14 thời gian từ - 48h ni cấy 12 Hình 3.7 Động thái sinh trưởng sinh tổng hợp bacteriocin 57 chủng BV20 thời gian từ - 48h ni cấy 13 Hình 3.8 Động thái sinh trưởng sinh tổng hợp bacteriocin 58 chủng PĐ2.9 thời gian từ - 48h ni cấy 14 Hình 3.9 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả sinh trưởng, 60 phát triển sinh bacteriocin chủng PĐ14 15 Hình 3.10 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả sinh 61 ix trưởng, phát triển sinh bacteriocin chủng BV20 16 Hình 3.11 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả sinh 61 trưởng, phát triển sinh bacteriocin chủng PĐ2.9 17 Hình 3.12 Ảnh hưởng pH ban đầu đến khả sinh tổng hợp 63 bacteriocin chủng PĐ14 18 Hình 3.13 Ảnh hưởng pH ban đầu đến khả sinh tổng hợp 63 bacteriocin chủng BV20 19 Hình 3.14 Ảnh hưởng pH ban đầu đến khả sinh tổng hợp 64 bacteriocin chủng PĐ2.9 20 Hình 3.15 Hoạt tính bacteriocin chủng PĐ14 mơi trường 67 có bổ sung nồng độ muối khác 21 Hình 3.16 Ảnh hưởng PH đến độ bền hoạt tính bacteriocin 75 22 Hình 3.17: Ảnh hưởng nhiệt độ đến độ bền hoạt tính dịch kết 77 tủa 23 Hình 3.18 Ảnh hưởng nhiệt độ lên độ bền hoạt tính bacteriocin sản 78 phẩm kết tủa chủng PĐ14 24 Hình 3.19 Ảnh hưởng pH nhiệt độ lên độ bền hoạt tính 79 bacteriocin chủng PĐ14 25 Hình 3.20 Ảnh hưởng Enzym phân hủy protein độ bền 81 hoạt tính bacteriocin sản phẩm 26 Hình 3.21 Kết điện di SDS – PAGE gel polyacrylamide 82