Nghiên cứu kỹ thuật tách chiết silymarin từ hạt kế sữa và axit amin từ đậu tương làm nguyên liệu cho thực phẩm chức năng tăng cường chức năng gan

1 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN THỊ QUY NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT TÁCH CHIẾT SILYMARIN TỪ HA ̣T KẾ SỮA VÀ AXIT AMIN TỪ ĐẬU TƯƠNG LÀ M NGUYÊN LIỆU CHO THỰC PHẨM CHỨC NĂNG TĂNG CƯỜNG CHỨC NĂNG GAN Ngành : Sinh ho ̣c Chuyên ngành : Động vật học Mã số : 60420103 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS PHẠM VIỆT CƯỜNG Hà nội 2014 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! http://www.lrc.tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Để hồn thành ḷn văn thạc sĩ mợt cách hồn chỉnh, bên cạnh nỗ lực cớ gắng thân cịn có hướng dẫn nhiệt tình q Thầy Cơ, đợng viên ủng hợ gia đình và bạn bè suốt thời gian học tập nghiên cứu thực luận văn thạc sĩ Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Phạm Việt Cường- Phòng Cơng nghệ sinh học - Viện Hóa sinh Biển, người đã hết lòng giúp đỡ tạo mọi điều kiện tớt cho tơi hồn thành ḷn văn này Đồng thời, xin gửi lời cảm ơn tới TS Lê Thi ̣ Hồ ng Minh anh chị em phịng Cơng nghệ sinh học - Viện Hóa sinh Biển đã tận tình giúp đỡ tơi q trình nghiên cứu để hoàn thành đề tài luận văn Xin chân thành biết ơn đến toàn thể quý Thầy Cô bộ môn Vi sinh vật học đã tận tình truyền đạt kiến thức quý báu tạo mọi điều kiện thuận lợi cho śt q trình học tập nghiên cứu và thực đề tài luận văn Cuối xin chân thành bày tỏ lịng biết ơn đến gia đình, bạn bè, người đã không ngừng động viên, hỗ trợ tạo mọi điều kiện tốt cho suốt thời gian học tập thực luận văn Hà Nội, Ngày 21 tháng11năm 2014 Học viên Nguyễn Thị Quy Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC HÌ NH ẢNH MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 10 1.1 Tổ ng quan về silymarin 10 1.1.1 Cây kế sữa 10 1.1.2 Thành phầ n hóa ho ̣c của quả kế sũa 10 1.1.3 Đặc điểm tiń h chấ t flavonoid 11 1.1.4 Tác dụng sinh học kế sữa 15 1.1.4.1 Sơ lược lịch sử sử dụng kế sữa làm thuốc 15 1.1.4.2 Tác du ̣ng dươ ̣c lý silymarin ứng dụng 16 1.1.5 Mô ̣t số nghiên cứu về tách chiế t silymarin 18 1.1.6 Những thành tựu nghiên cứu chế phẩm silymarin 19 1.2 Tổ ng quan về protein đâ ̣u tương 21 1.2.1 Cây đậu tương 21 1.2.2 Thành phầ n hóa ho ̣c quả đâ ̣u tương 21 1.2.3 Protein đâ ̣u tương 21 1.2.3.1 Thành phần Protein đậu tương 22 1.2.3.2 Tính chất Protein đậu tương 22 1.2.4 Tác du ̣ng dươ ̣c lý của Protein hydrolysate đậu tương 24 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠN PHÁP 26 2.1 Vật liệu 26 2.1.1 Nguyên liệu 26 2.1.2 Hoá chất và thiế t bi 26 ̣ 2.2 Phương pháp 27 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 2.2.1 Phương pháp chiế t silymarinbằ ng dung môi hữu 27 2.2.2 Phương pháp Sắc ký HPLC 28 2.2.3 Phương pháp xác đinh ̣ hàm lươ ̣ng nhóm amin tự 29 2.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng axit amin tự 30 2.2.5 Xác đinh ̣ đô ̣ đô ̣c và hoa ̣t tính của chế phẩ m 30 2.2.5.1 Nghiên cứu tác du ̣ng sinh ho ̣c 30 2.2.5.2 Thử đô ̣c tiń h cấ p 30 2.2.5.3 Thử tác du ̣ng bảo vê ̣ gan 31 2.2.5.4 Thử tác du ̣ng lơ ̣i mâ ̣t 31 2.2.6 Phương pháp xử lý số liêụ 32 CHƯƠNG : KẾT QUẢ 33 3.1 Xây dựng quy trin ̀ h chiế t xuấ t silymarin 33 3.1.1 Nghiên cứu khảo sát dung môi để chiết xuất silymarin 33 3.1.2 Kết quả sắc kí HPLC 37 3.2 Nghiên cứu khả thủy phân protein bằ ng chế phẩ m enzyme 40 3.3 Nghiên cứu quy trình thủy phân thu nhận axit amin tự từ protein đâ ̣u tương 43 3.4 Mợt sớ đặc tính sinh học chế phẩm chứa sylimarin 48 3.4.1 Xác đinh ̣ đô ̣c tin ́ h cấ p 49 3.4.2 Tác du ̣ng bảo vê ̣ gan 50 3.4.3 Tác du ̣ng lơ ̣i mâ ̣t 53 3.4.3.1 Tác dụng lưu lượng mật 53 3.4.3.2 Tác dụng hàm lượng cắn khô bilirubin dịch mật 54 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHI 56 ̣ 4.1 Kết luận 56 4.2 Kiế n nghi 57 ̣ TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid Deoxyribo Nucleic ARN Acid Ribonucleic ALT Alanine Aminotransaminase AST Aspartate Aminotransaminase CCI4 Cacbon Tetrachlorid EtOH Ethanol MeOH Methanol NaCl Muố i Natriclorua cAMP Cyclic Adenosine Monophosphat- Chấ t truyề n tin TFN-α Tumor Necrosis Factor- Chất trung gian chính của phản ứng viêm cấ p LD50 Lethal Dose- Liề u lươ ̣ng gây cái chế t 50% của mô ̣t nhóm đô ̣ng vật dùng thử nghiê ̣m HPLC Sắ c kí lỏng hiêụ cao SKLM Sắ c kí lớp mỏng Cs Cô ̣ng sự CN Công nguyên TPCN Thực phẩm chức WHO World Health Organization- Tổ chức y tế thế giới UV Ultravioler- Phổ tử ngoại Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Kết quả khảo sát dung môi để chiết xuất silymarin 34 Bảng 3.2 Kết quả chiết xuất silymarin phương pháp khác 35 Bảng 3.3: Hàm lươ ̣ng axit amin các dich ̣ thủy phân 40 Bảng 3.4: ảnh hưởng thời gian thủy phân bột đậu tương protease lên hàm lươ ̣ng amin tự 45 Bảng 3.5: Kế t quả kiể m tra lươ ̣ng amin tự ở bước 45 Bảng 3.6: Hàm lượng axit amin tự của dich ̣ thủy phân đâ ̣u tương 46 Bảng 3.7: Hàm lượng axit amin tự của dich ̣ thủy phân đâ ̣u tương sau cô đă ̣c 47 Bảng 3.8: Liều uống chế phẩm silymarin lơ cḥt thực nghiệm thử đợc tính cấp 49 Bảng 3.9: Tác dụng chế phẩm silymarin hoạt độ enzym ALT huyết chuột thực nghiệm 52 Bảng 3.10: Tác dụng chế phẩm silymarin bilirubin huyết chuột thực nghiệm 53 Bảng 3.11: Lưu lượng mật lơ cḥt thí nghiệm 54 Bảng 3.12: Hàm lượng cắn khô dịch mật chuột thực nghiệm 54 Bảng 3.13: Hàm lượng bilirubin dịch mật chuột thực nghiệm 55 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Mô ̣t số chất chính silymarin 10 Hình 3.1: Sơ đồ quy trình chiế t suất silymarin quy mô phòng thí nghiê ̣m 37 Hình 3.2: Sắc ký đồ mẫu silymarinthu sau tách chiết theo quy trình quy mơ phòng thí nghiê ̣m 38 Hình 3.3: Sắc ký đồ mẫu silybin chuẩn 38 Hình 3.4:Sơ đồ thủy phân protein đâ ̣u tương 40 Hình 3.5: Sơ đồ quy trình thủy phân protein đâ ̣u tương 44 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Viê ̣c dùng th́c có nguồn gớc từ thảo dược phối hợp sử dụng thuốc đông dược và tân dược đươ ̣c cộng đồng rấ t coi tro ̣ng Do loại thuốc thảo dược kết hợp đông –tây y chữa bệnh mà có tác dụng phụ Vì vậy, th́c có nguồn gớc thảo dươ ̣c, đặc biệt thuốc đã dùng rộng rãi theo kinh nghiệm cổ truyền để chữa bệnh nhà khoa học giới Việt Nam quan tâm nghiên cứu Gan là mô ̣t những quan quan trọng về mặt chuyển hóa chấ t của thể người Một chức quan tro ̣ng của gan là tham gia vào q trình giải ̣c các chấ t nội sinh và ngoa ̣i sinh Trong các trường hơ ̣p bê ̣nh lý hay sự tải chấ t đô ̣c gan, tế bào gan sẽ bi ̣ hủy hoại, dẫn đến tổ n thương gan, dầ n dầ n làm các tổ n thương không hồ i phu ̣c làm cho gan bị xơ, mấ t chức giải đô ̣c Bệnh gan là mô ̣t những bệnh phổ biến cô ̣ng đồng Có nhiề u loa ̣i bênh ̣ gan đó thường gă ̣p là viêm gan siêu vi, đó một bệnh truyền nhiễm phổ biến giới, ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng thập niên Hiện có loại virus gây viêm gan : A, B, C, D, E G, phở biến nguy hiểm siêu vi B C Khoảng tỷ người giới đã nhiễm virus viêm gan B, tâ ̣p trung chủ yế u ở châu Á và châu Phi Theo báo cáo tổ chức y tế thế giới, viêm gan B là mô ̣t mười nguyên nhân gây tử vong nhiề u nhấ t, khoảng triêụ ca tử vong mỗi năm bê ̣nh này và 350 triê ̣u người mang virus này mãn tính Có khoảng 3% dân số giới nhiễm virus viêm gan C 170 triệu người mang virus mãn tính Viêṭ Nam là mô ̣t những nước có tỷ lê ̣ viêm gan B cao nhấ t thế giới Người bi ̣ viêm gan ma ̣n tính có nguy ung thư gan cao gấ p 20 lầ n so với người bình thường và 40% số họ sẽ tử vong ung thư gan [62], [63] Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Đã có chứng cho thấy silymarin kế sữa có tác dụng chữa bệnh xơ gan rượu Mợt hoạt tính triển vọng silymarin chớng ung thư, vậy sử dụng silymarin kết hợp với phương pháp hóa trị liệu Silymarin hoạt đợng chất chớng oxy hóa, bảo vệ mơ loại bỏ chất gây độc cho gan [5], [10] Protein đậu tương sử dụng rộng rãi một thành phần chức nhiều loại thực phẩm chế biến khả tạo gel tính chất hóa lý, cảm quan và dinh dưỡng cao Việc thủy phân protein hạt họ đậu cải thiện đặc tính dinh dưỡng chúng làm chậm trình hư hỏng, cải thiện cấu trúc, tăng giảm đợ hịa tan, ngăn cản tương tác khơng mong ḿn, loại mùi khó chịu thành phần đợc [27], [57] Vì vâ ̣y, để sản xuất một số loại sản phẩm tăng cường chức gan hỗ trợ điều trị bệnh liên quan đến gan Việt Nam, thay sản phẩm nhập ngoại, chính là sở để thực đề tài: “Nghiên cứu kỹ thuâ ̣t tách chiế t silymarin từ ̣t kế sữa và axit amin từ đâ ̣u tương làm nguyên liêụ cho thực phẩ m chức tăng cường chức gan.” Mu ̣c tiêu của đề tài Nghiên cứu quy trình tách chiết Sylimarin từ hạt kế sữa Nghiên cứu quy trình thuỷ phân thu nhận axit amin tự từ đâ ̣u tương Nô ̣i dung nghiên cứu  Xây dựng quy triǹ h tách chiế t silymarin từ ̣t kế sữa  Xây dựng quy triǹ h thủy phân thu nhâ ̣n axit amin tự từ đâ ̣u tương  Thử đô ̣ độc tính cấ p của chế phẩ m thu đươ ̣c  Chứng minh mô ̣t số đă ̣c tính sinh ho ̣c của chế phẩm Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 10 CHƯƠNG 1: TỞNG QUAN 1.1 Tở ng quan về silymarin 1.1.1 Cây kế sữa Kế sữa (Sylibum marianum (L.) Gaernt) là mô ̣t loài thực vật có hoa thuô ̣c ho ̣ cúc, là loa ̣i thảo số ng mô ̣t hoă ̣c hai năm, cao 30-150cm Thân thẳng và phân nhánh Lá xanh, kèm, bóng láng, thường có nhiều đớm trắng dọc theo gân, mép có dạng gai, gai màu vàng nhọn; phía ôm lấy thân; to, có phiến chia thuỳ có ćng Cụm hoa đầu đơn đợc, rợng 3-10cm Lá bắc ngồi có mợt phần phụ hình tam giác màu lục thu lại thành mợt gai to, gớc có 4-6 gai nhỏ, ngắn hơn, bên Hoa màu tím, gặp màu trắng, giớng nhau, có cánh hoa, nhị bầu ô với nỗn vịi nhuỵ phình gớc Quả bế hình bầu dục thn, dài 7-8mm, màu đen bóng có vân vàng nhiều ít, tùy tḥc vào ng̀ n giống S.marianum và điề u kiêṇ canh tác [15], [24], [26] Ra hoa vào tháng đến tháng năm thứ hai Cây có nguồn gớc Địa Trung Hải mọc hoang dại nhiều nơi giới miền Nam Trung Âu, Bắc Phi, Trung Đông, Ấn Độ, Trung Quốc, Bắc Nam Mỹ [26] 1.1.2 Thành phầ n hóa ho ̣c của ̣t kế sữa Thành phần hoá ho ̣c ̣t kế sữa là silymarin Silymarin flavonolignan là phenol tự nhiên gồ m mô ̣t phầ n flavonoid và mô ̣t phầ n lignan Dịch chiết hạt chứa khoảng 70-80% silymarin flavonolignans khoảng 20-30% thành phần không xác định, chủ yếu hợp chất polyphenol oxy hóa trùng hợp Thành phần tở hợp silymarin silybin, đồng nghĩa với silybinin Ngoài silybin hỗn hợp diastereomers A B với tỉ lệ khoảng 1:1, mợt lượng lớn flavonolygnants Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 51 làm cho hoa ̣t đô ̣ ALT đo đươ ̣c môi trường tăng Ở lô chuô ̣t cho sử du ̣ng silymarin thì hoa ̣t đô ̣ enzym ALT giảm, điề u đó có nghiã là silymarin đã có tác du ̣ng bảo vê ̣ gan Nguyễn Ngo ̣c Hồ ng và cs (2012) nghiên cứu tác du ̣ng bảo vê ̣ gan của cao chiế t ethyl acetate mô hình gan chuô ̣t bi ̣ gây đô ̣c mãn tính bằ ng CCl4 cũng đánh giá tác du ̣ng bảo vê ̣ gan dựa đô ̣ giảm hoa ̣t đô ̣ của enzyme ALT Từ tác giả cũng đưa kết luận ethyl acetate có tác du ̣ng bảo vê ̣ gan [6] Favari và cs (1997) đã nghiên cứu và chứng minh về tác du ̣ng bảo vê ̣ gan của silymarin/silybin sự chuyể n da ̣ng của các tế bào hình thành các nguyên bào sơ ̣i cho thấy, silybin nờ ng đợ 100 µmol/l đã làm giảm 75% tăng sinh tế bào hình từ gan chuột, làm giảm sự chuyể n da ̣ng của tế bào hình thành các nguyên bào sơ ̣i và giảm thành phầ n chấ t gian bào ngoại bào cầ n thiế t đố i với quá trình sơ hóa [19] Trên mơ hình gây tởn thương gan mạn carbon tetraclorid, hàm lượng colagen gan chuột gây bệnh đã tăng lên gần lần so với chứng sinh lý Silymarin với liều uống 50mg/kg thể trọng/ngày ngày đã làm giảm hàm lượng colagen gan 55% so với đối chứng bệnh lý Trong một thí nghiệm tương tự, tăng hàm lượng colagen procolagen III tắc mật chuột cống trắng đã bị giảm 30% silymarin liều 50mg/kg/ngày không thấy có thay đởi liều 25mg/kg/ngày [16] Điều cho thấy silymarin có khả ức chế hình thành colagen điều kiện cụ thể [21] Tác du ̣ng chố ng đô ̣c bảo vê ̣ gan của silymarin thông qua chế chố ng oxy hóa đã đươ ̣c Nguyễn Thi ̣ Tố Nga và cs (2005) chứng minh, silymarin có ảnh hưởng lên ̣ thố ng enzym cytochrom P450 ở gan chuô ̣t Sau 10 ngày dùng thuố c silymarin với liề u 100mg/10g thể tro ̣ng, đã làm tăng hoàm lươ ̣ng P450 (tăng 25%), giảm hoa ̣t đô ̣ enzym anilin hydroxylaza Trên đô ̣ng vâ ̣t bi ̣ nhiễm đô ̣c CCl4 có bổ sung silymarin có sự thay đổ i tích cực so với nhóm bi ̣ nhiễm đô ̣c CCl4 đơn thuầ n Silymarin có tác du ̣ng chố ng oxy hóa ở chuô ̣t tình tra ̣ng bi ̣ nhiễm đô ̣c CCl4 thông qua tác du ̣ng hoa ̣t hóa hai enzym SOD và GPx, đồ ng thời cải thiê ̣n chố ng oxy hóa toàn phầ n của thể [8] Về Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 52 khả chố ng oxy hóa của silymarin, Lê Thi ̣ Lan Oanh và Cs.(2003) đã nghiên cứu tác du ̣ng của silymarin lên hoa ̣t tính của các enzym oxy hóa peroxydaza và catalaz của máu người Kế t quả là silymarin đã kìm hãm ma ̣nh hoa ̣t đô ̣ng của hai enzym đó huyế t của nhóm máu người [10] Mô ̣t nghiên cứu khác của Altoray và cs (1992) [15] cho thấ y silymarin nồng độ 0,01 – 0,5 mmol/l silybin nồng đợ cao đã ức chế có hiệu quả tác dụng gây peroxy hoá lipid tiêu giảm glutathion allyl alcol Một điều đáng ý là nồng đợ tương đới cao khơng thấy có biểu rõ rệt tương tác silybin với cytochrom P450, cho thấy tác dụng chống độc chất nhờ vào hoạt tính chớng oxy hố qt gớc tự chúng Như vâ ̣y tác dụng bảo vệ gan silymarin đã các nhà khoa ho ̣c chứng minh mô hin ̀ h thực nghiê ̣m là thơng qua chế chớng oxy hóa, qut gớc tự do, chố ng peroxy hóa lipit, làm ổ n đinh ̣ và điề u hòa tiń h thấ m màng tế bào chố ng sự phá hoại của các tác nhân gây đô ̣c, kích thích tổ ng hơ ̣p protein gúp tái sinh tế bào gan, chố ng chuyển dạng các tế bào hình thành các nguyên bào sơ ̣i gây tích tu ̣ các sơ ̣i colagen làm xơ hóa gan dẫn đế n làm giảm hoa ̣t đô ̣ của enzym ALT Bảng 3.9: Tác dụng chế phẩm silymarin hoạt độ enzym ALT huyết chuột thực nghiệm Stt Lô chuột Chứng sinh lý Chứng Đô ̣ tăng hoạt độ Độ giảm hoạt độ Số ALT enzym ALT so enzym ALT so chuột (U/ l) với chứng sinh với chứng bệnh lý (%) lý (%) 42,3  2,57 138,02  226,29 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 53 bệnh lý Silymarin 15,54 P < 0,01 87,33  106,45 12,33 36,73 P < 0,05 Bảng 3.10: Tác dụng chế phẩm silymarin bilirubin huyết chuột thực nghiệm Stt Lô chuột Chứng sinh lý Chứng bệnh lý Silymarin Độ tăng hàm Độ giảm hàm Số Bilirubin lượng bilirubin lượng bilirubin so chuột ( mol/ l) so với chứng với chứng bệnh lý sinh lý (%) (%) 2,35  0,19 3,56  0,35 2,58  0,31 51,49 P < 0,01 9,79 27,53 P < 0,05 Như vậy, chế phẩm silymarin có tác dụng bảo vệ gan có ý nghĩa 3.4.3 Tác du ̣ng lơ ̣i mâ ̣t Thí nghiệm tiến hành chuột lang theo phương pháp ghi mục 2.2.6.4 Chỉ tiêu theo dõi là lưu lượng mật tiết Tác dụng lợi mật chế phẩm silymarin biểu thị độ tăng lưu lượng mật sau bơm chế phẩm nghiên cứu so với trước bơm và so với lô chuột đối chứng 3.4.3.1 Tác dụng lưu lượng mật Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng chế phẩm silymarin chiết lưu lượng mật trình bày bảng 3.11 Các kết quả thu cho thấy chế phẩm silymarin với liều 0,4g silymarin/kg thể trọng chuột lang, sau 30 phút đã làm tăng lưu lượng mật lên 32,26% so với chưa xử lý 36,67% Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 54 so với lô chuột đối chứng dùng nước muối sinh lý thời điểm Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với P < 0,05 Theo dõi lượng mật chảy sau dùng chế phẩm nghiên cứu 60, 90 120 phút thấy khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê so với trước xử lý Bảng 3.11: Lưu lượng mật lơ chuột thí nghiệm Lưu lượng mật (ml/100 g chuột/30 phút) Trước Stt Lô chuột Số NaCl chuột 0,9% Sau NaCl 0,9% silymarin 30 phút 60 90 120 phút phút phút 0,25 0,26 0,24  0,02  0,02  0,03 silymarin Chứng 0,31  0,04 0,30  0,02  3,23% * (P > 0,05) 0,41  0,04 Silymarin 0,31   32,25%* 0,31 0,28 0,25 0,02 36,67%**  0,03  0,03  0,02 > 0,05 > 0,05 > 0,05 (P < 0,05) P > 0,05 < 0,05 *: So với trước dùng silymarin NaCl 0,9%, **: So với đố i chứng *: Sau 30 phút, lơ thử silymarin có khác biệt có ý nghĩa so với trước xử lý so với lô đố i chứng thời điểm 3.4.3.2 Tác dụng hàm lượng cắn khô và bilirubin dịch mật Kết quả xác định hàm lượng cắn khô bilirubin dịch mật chuột trước và sau dùng nước *muối sinh lý dùng chế phẩm silymarin trình bày bảng 3.12 bảng 3.13 Bảng 3.12: Hàm lượng cắn khô dịch mật chuột thực nghiệm Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 55 Lơ cḥt STT thí nghiệm Hàm lượng cắn khô Số dịch mật (mg/ml) chuột Trước silymarin Sau silymarin NaCl 0,9% NaCl 0,9% P sau so với trước Đố i chứng 11,2  0,4 11,1  0,5 P > 0,05 Silymarin 14,4  0,3 12,4  0,4 P > 0,05 P > 0,05 P > 0,05 P Bảng 3.13: Hàm lượng bilirubin dịch mật chuột thực nghiệm Hàm lượng bilirubin Lơ cḥt STT thí nghiệm Sớ cḥt dịch mật (mmol/l) P Trước Sau silymarin sau so với silymarin hoặc NaCl trước NaCl 0,9% 0,9% Đố i chứng 11,40  1,03 10,81  1,40 P > 0,05 Silymarin 12,36  1,31 12,76  1,11 P > 0,05 P > 0,05 P > 0,05 P Kết quả cho thấy: Mặc dù sau dùng chế phẩm silymarin lưu lượng mật tăng có ý nghĩa hàm lượng cắn khô và hàm lượng bilirubin dịch mật lô chuột chứng lô dùng chế phẩm nghiên cứu, trước sau xử lý tương tự nhau, sai khác khơng có ý nghĩa thớng kê (P > 0,05) Chế phẩm silymarin chiết xuất từ kế sữa có tác dụng lợi mật rõ rệt mà chất lượng mật biểu hàm lượng cắn khô và hàm lượng bilirubin không thay đổi Như vâ ̣y chế phẩ m silymarin chiế t suấ t từ kế sữa và axit amin không gây đô ̣c, có tác du ̣ng bảo vê ̣ gan và tác du ̣ng lơ ̣i mâ ̣t Đó chính là sở để chúng Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 56 có thể đinh ̣ rằ ng silymarin từ kế sữa và axit amin từ đâ ̣u tương là nguyên liêụ tố t thích hơ ̣p để làm thực phẩ m chức tăng cường chức gan CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHI ̣ 4.1 Kết luận  Xây dựng thành cơng quy trình chiết xuất silymarin quy mơ phịng thí nghiệm, dùng ether dầu để loại dầu béo, sau chiết hồi lưu cồn 85%  Mẫu silymarin thu chiết theo quy trình phịng thí nghiệm có hàm lượng silymarin chiếm 56%, đáng ý là hàm lượng silybin chiếm cao 28,9%  Xây dựng thành công quy trình thủy phân thu nhận axit amin từ protein đậu tương bằ ng enzyme peptidase Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 57  Chứng minh đươ ̣c hỗn hợp silymarin và axit amin thu chiết theo quy trình phòng thí nghiê ̣m có một số khả năng: - Tác du ̣ng bảo vê ̣ gan có ý nghĩa - Tác dụng lợi mật rõ rê ̣t mà chấ t lươ ̣ng mâ ̣t biể u hiêṇ bằ ng hàm lươ ̣ng cắ n khô và hàm lượng birubilin vẫn không thay đổ i 4.2 Kiế n nghi ̣ Từ những kế t chúng đưa mô ̣t số kiế n nghi:̣ - Tiế p tu ̣c nghiên cứu hoàn thiêṇ quy trình tách chiế t silymarin - Tiế p tu ̣c nghiên cứu những ảnh hưởng của các liề u lươ ̣ng hỗn hơ ̣p chế phẩ m tách chiế t đố i với tác du ̣ng bảo vê ̣ gan, chố ng oxy hóa đô ̣ng vâ ̣t thí nghiê ̣m - Tiế p tu ̣c nghiên cứu sử du ̣ng silymarin và axit amin sản xuấ t thực phẩ m chức TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bộ y tế (1996), quy chế đánh giá tính an toàn và hiệu lực thuốc cổ truyền, phụ lục 3: Hướng dẫn khảo sát đợc tính th́ c truyền, (ban hành kèm theo định 371 BYT/QĐ ngày 12/3/1996 bộ trưởng bộ y tế), Hà Nội Đàm Trung Bảo (1985) Các chất chống oxy hóa sinh học, y dược học 1:23-25 Đỗ Trung Đàm (2003), Sử dụng Microsoft Excel,trong thống kê sinh học, Nxb Y học, Hà Nợi Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 58 Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985) Phương pháp nghiên cứu hoá học thuốc Nxb Y học, Hà Nội Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nguyễn Quốc Khang, Lê Thị Lan Oanh, Nguyễn Thị Tố Nga, Nguyễn Thị Ngọc Dao (2003), “nghiên cứu quy trình cơng nghệ thu nhận silymarin tạo sinh khối từ kế sữa(Silybum Marianum) trồng Việt Nam”, Di truyền học ứng dụng 4:25:31 Nguyễn Ngo ̣c Hồng, Huỳnh Ngo ̣c Thu ̣y (2012), “Tác du ̣ng bảo vê ̣ gan của cao chiết ethyl acetate từ nghề lông dày và râu mèo mô hình gan chuột bị gây đô ̣c mañ tính bằ ng carbon tetrachloride”, Tạp chí Sinh Ho ̣c, , 34(3se): 313-318 Lê Văn Viê ̣t Mẫn (chủ biên) (2010) Công nghê ̣ chế biến thực phẩm Nxb Đa ̣i ho ̣c Quố c Gia TP Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Tố Nga, Đỗ Thi ̣ Tuyên, Đoàn Văn Viêt,̣ Nguyễn Thi ̣ Ngo ̣c Dao (2006), “Tác dụng bảo vê ̣ gan và chố ng oxy hóa của hoa ̣t chấ t silymarin đươ ̣c tách chiế t từ kế sữa Silybum marianum (L.) Gaertn”, Ta ̣p chí Sinh Ho ̣c 28(3): 88-92 Hồng Thị Bích Ngọc (1991) Hố sinh gan Nxb Y học, Hà Nội, 303310 10 Lê Thị Lan Oanh, Lê Thị Việt Hồng, Hoa Thị Hằng (2003), Nguyễn Thị Ngọc Dao, Nguyễn Quốc Khang, Nguyễn Thi Hồng Gấm “ Thu nhận khảo sát một số dặc điểm sinh dược học flavonoid từ kế sữa Silybum marianum di thực vào Việt Nam” Hội nghị công nghệ sinh học tồn q́c, Hà Nợi, 1029-33 11 Vũ Thị Phương (2001) Hoá sinh hệ thống gan mật Nxb Y học, Hà Nội, 665-685 12 Nguyễn Viêṭ Thái Ki ̃ thuật trồ ng đậu tương Nxb Đà Nẵng Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 59 13 Pha ̣m Văn Thiều (2002) Cây đậu tương, kĩ thuật trồ ng và chế biế n sản phẩm Nxb Nông nghiê ̣p Hà Nô ̣i 14 Vũ Ngọc Thuý, Tào Duy Cần (1996) Sử dụng thuốc biệt dược Nhà xuất Y học, Hà Nội TÀI LIỆU TIẾNG ANH 15 Altoray I., Dalmi L., Sari B., Imre S., Balla G (1992), “The effect of silibinin (Legalon) on the free radical scavenger mechanisms of human erythrocytes in vitro”, Acta physiol Hung., 80, pp 375-380 16 Boigk G., Stroedter L., Herbst H., Waldfdschmidt J., Riecken E.O (1997), “Silymarin retards collagene accumlation in early and advanced biliary fibrosis secondary to complete bile duct oblitteration in rats”, Hepatology, 26, pp 643-649 17 Lin Chen, Jianshe Chen, Jiaoyan Ren, and Mouming Zhao (2011) “Effects of Ultrasound Pretreatment on the Enzymatic hydrolysis of soy protein Isolates and on the Emulsifying properties of hydrolysates” J Agric Food Chem., 59(6), pp 2600-2609 18 A.Dehghan, AA Mahjoor, H Bazyar and K Zangili (2010) “Effects of silymarin and food restriction on hepatic and pancreatic function in Wistar rats” Asian J Ani Veteri Ad., 5(2):136-142 19 Favari 1., perez-Alvarez V (1997), “Comparative effects of colchicine and silymarin on CCL4 –chronic liver damage in rats”, Arch Med Res., 28,pp 11-17 20 Flora K., Hahn M., Rosen H., Benner K (1998), “Milk thistle ( Silybum marianum) for the therapy of liver disease”, The American Journal of Gastroenterology, 93(2), pp 139-143 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 60 21 Fuchs E.C., Weyhenmeyer R., Weiner O.H (1997), “Effects of silibinin and of a synthetic analogue on isolated rat hepatic atellate cells and myofibroblasts”, Azrneimittelforschung, 47, pp 1383-1387 22 Galvez AF (2003) Therapeutic peptides having a motif that binds specifically to nonacetylated H3 and H4 histones for cancer therapy Patent US 2003, 027765 A1 23 Hikino H., kiso Y., Wagner O., Fiebig M (1984), Antihepatoxic action of flavonolignans from Silybum marianum fruits, Planta Medica, 50, pp 248-250 24 Hobbs C (1992), Milk thistle: The liver herb Botanical Press, Capitola 25 Hooker J.D (1880), Flora of british india, Vol III., India 26 Joyeux M., Rolland A., Fleurentin J., Mortier F., Dorfman P (1990), Tert-Butyl hydroperoxide-induced injury in isolated rat hepatocytes: a model for studying anti-hepatotoxic crude drugs, Planta Med., 56(2), pp 171-174 27 Ashraf A Khalil, Samira S Mohamed, Fakhriya S Taha and Eva Nordberg Karlsson (2006),” Production of functional protein hydrolysates from Egyptian breeds of soybean and lupin seeds” African J Biotech (10): 907-916 28 Vladimirs Kren, Daniela Walterová (2005), “Silybin and silymarin- new aspects and applications” Biomed Papers 149(1): 29-41 29 Kaczmarek F (1977).,” Concentrate from Slybum marianum (L) Gaertn Seed with a high silymarin content”, Pol 89,368 (C1 A61K35/78), Theo CA 90: 69342p 30 A.Lavanya (2007), “C Selvamurugan and B Sivasankar Immobilized trypsin-mediated production of the protein hydrolysates from non- edible protein sources L Sci” Industrial Res., 66:651-654 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 61 31 Jing Liu (2009), “Research on Microwave Heating Three Enzymes Collaborative Hydrolysis Soy protein and preparation of small molecule peptides advanced studies in Biology”, 1(7): 345-354 32 Lovati MR, Manzoni C, Gianazza E, Arnoldi A, Kurowska E, Carroll KK, Sirtori CR (2000) “Soy protein peptides regulate cholesterol homeostasis in Hep G2 cells” J Nutr 130(10):2543-2549 33 María D Mesa, Jose M Silván, Josune Olza, Ángel Gil and María D.del Castillo (2008), “Antioxidant properties of soy protein- fructooligosaccharide glycation systems and its hydrolyzates” Food Res International 41(6): 606-615 34 M Marinova1, N Thi Kim Cuc2, B Tchorbanov (2008) “Enzymatic hydrolysis of soy protein isolate by food grade proteinases and aminopeptidases of plant origin” Biotechnol & Biotechnol EQ 22/2008/3, 835-838 35 Madaus R (1980) Silymarin from plant, Ger Offen 2,914,330 (C1 C07D311/20), Theo CA 94: 90326d 36 Nakamori T (2002) “Antiobesity effects of soy proteins and soy peptides” Food Style 21; 6(5):86-88 37 Flavia M Netto and Maria Antonia M (1998) “Galeazzi Production and Characterization of Enzymatic Hydrolysate from Soy protein Isolate” Lebensmittel- Wissenschaft und-Technologie 31(7-8), , 624-631 38 Nishi T, Hara H, Tomita F (2003b),”Soybean beta-conglycinin pepton suppresses food intake and gastric emptying by increasing plasma cholecystokinin levels in rats” J Nutr, 133(2):352-357 39 Yong- ping Pei, Jian Chen, Wei- Lin Li (2009), Progress in research and application of silymarin Medicinal & aromatic plant Sci Biotech.,3(1): 1-8, Global Sci Books Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 62 40 Radek Gazak, Vladimirs Kren, Daniela Walterová (2007), “Silybin and silymarin- new aspects and applications” Current Medicinal chemistry 14, 315-318 41 Riaz, Mian N (2006) Soy Application in Food Boca Raton, FL: CRC Press ISBN 0-8493-2981-7 42 Simanek Vilim, Nina Skottova, Josef Bartek, Jitka Psotova, Pavel Kosina, Libuse Balejova and Jitka Ulrichova (1999), “Extract from Silybum marianum as a nutraceutical”: a double-blind placebocontrolled study in healthy young men Czech J Food Sci.,19(3): 106110 43 Soto C, Peréz J, Garecia V, Uria E, Vadillo M (2010), “Raya L Effect of silymarin on kidneys of rats suffering from alloxan-induced diabetes mellitus” Phytomedicine; 17(14): 1090-1094(Abstract) 44 S Subsiripaiboon and Y Puechkamut (2007) “Antioxidant capacities of papain modified soy protein isolate” International Conference on Integration of Science & Technology for Sustainable Development, Bankok, Thailand 26-27 April 2007, 349-352 45 L.N Ten, W-T Im, M-K Kim and S-T Lee A plate assay for simultaneous screening of polysaccharide and protein-degrading microorganisms Lett Appl Microbiol Med 70,397-400 46 Tuner R.A (1965), “Screening method in pharmacology”, Academic Press, Newyork and London 229-230 47 US2002/0168704 A1 Method for producing a protein hydrolysate with low bitterness 48 US4324805 Method of producing soy protein hydrolysate from fatcontaining soy protein hydrolysate Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 63 49 US2002/0132028 A1 Process for preparation of protein- hydrolysate from soy flour 50 US2010/0184132 A1 Enzymatic process for debittering of protein hydrolysate using immobilized peptidases 51 US4368195 Method for the extraction of silymarin from plant 52 US7318940 Method for isolation of silymarin from Silybum marianum seeds 53 Usman Ali Ashfaq, Tariq Javed, Sidra Rehman, Zafar Nawaz, and Sheikh Riazuddin (2011), “Inhibition of HCV 3a core gene thought silymarin and its factions” Virology J., 8:153 http://www.virologyj.com/content/8/1/153 54 Vessal G, Akmali M, Najafi P, Moein MR (2010), “Sagheb MM Silymarin and milk thistle extract may prevent the progresstion of diabetic nephropathy in streptozotocin-induced diabetic rats” Ren Fail.; 32(6):733-739(Abstract) 55 Wagner H (1980) “Plant Constituents with antihepatotoxic activity” Natural product as medicinal agents., Strasbourg 56 Wang Xin, Zheng Xianzhe, Liu Chenghai (2008) “Optimization of microwave-assisted extraction of silymarin from milk thistle seeds” Int J Agric & Biol Eng;1(1) : 75-81 57 Wenyi Wang, Sa ̣neewa G Rupasinghe, Mary A Schuler and Elvira Gonzalez de Mejia (2008) “Identification and characterization of metastases” Luâ ̣n án TS ta ̣i Trường Tổ ng hơ ̣p Albert-Ludwigs, LB Đức 2003, 108 trang 58 Wo 2009/043671A1 Use of Silybum marianum extract 59 Wu J, Ding X.(2001), “Hypotensive and physiological effect of angiotensin converting enzyme inhibitory peptides derived from soy Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 64 protein on spontaneously hypertensive rats” J Agric Food Chem 49(1):501-506 60 Hsin-Yi Yang, Jiun-Rong Chen and Le-Shin Chang (2008), “Effects of Soy protein hydrolysate on Blood Presure and Angiotensin-Converting Enzyme Activiti in Rats with Chronic Renal Failure” Hypertension Res 31: 957-963; doi: 10.1291/hypres.31.957 61 Hsiao Po- Yang Yao Hsueh Tung Pao, 16 (4), 22, 1981 62 http://suckhoe.24h.com.vn/viem-gan-b/dieu-tri-va-cham-soct1f2w43c569pc558ht5.html#gsc.tab=0&gsc.q=Viem-gan-B&gsc.page=1 63 http://benhnhietdoi.vn/tin-tuc/Viem-gan/tim-hieu-sau-hon-ve-viem-ganc_8354.html Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 65 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn