GIỚI THIỆU
TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Ngành nấm ở Việt Nam đang rất phát triển, tổng sản lượng nấm ăn và nấm dược liệu trong cả nước trung bình 100.000 tấn/năm trong đó xuất khẩu hàng năm chiếm 35%, tiêu thụ trong nước chiếm khoảng 65% tổng sản lượng cả nước Xét về sản lượng nuôi trồng, nấm bào ngư cho sản lượng cao trong các loài nấm được nuôi trồng trên thế giới và cũng là một trong các loài nấm trồng phổ biến tại Việt Nam đặc biệt ở các tỉnh phía Nam (Đinh Minh Hiệp và cs, 2020)
Nấm bào ngư là thực phẩm ăn ngon và có nhiều giá trị dinh dưỡng nên các nghiên cứu chỉ chú trọng đến điều kiện, kỹ thuật nuôi trồng mà chưa có nhiều báo cáo đánh giá tác dụng của các hoạt chất sinh học có trong nấm Các nghiên cứu hiện nay ghi nhận tác dụng của các hoạt chất sinh học có trong nấm bào ngư giúp làm hạ lượng cholesterol trong máu, ngăn chặn xơ vữa động mạch bằng cách ức chế hydroxymethylglutaryl-coenzyme reductase HMG-CoA (Su, 1999)
Lovastatin được tìm thấy đầu tiên vào năm 1979 trên vi nấm thuộc chủng
Aspergillus terreus và đã được đưa vào nghiên cứu để sản xuất lovastatin (Pandey và cs, 2019) Sau đó các chủng nấm Monascus ruber, Penicillium brevicompactum và
Pleurotus ostreatus được ghi nhận có khả năng sản xuất lovastatin (Endo, 1992; Bobek và cs, 1997)
Chủng Aspergillus cho hàm lượng lovastatin cao nhưng cũng đồng thời tạo ra một loạt chất độc hại (terrein, patullin, citrinin, citreoviridin), nên đòi hỏi phải có quá trình tinh sạch phức tạp để thu được lovastatin (Pandey và cs, 2019), trong khi chủng
Pleurotus là nấm ăn nhưng có nhiều hoạt chất sinh học có khảnăng hỗ trợ phòng và điều trị một số bệnh Với mục đích xác định hoạt chất có giá trị dược liệu trên nấm bào ngư nên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Khảo sát khảnăng sinh tổng hợp lovastatin của nấm bào ngư Pleurotus sp trong điều kiện nuôi trồng” để hướng tới nghiên cứu các sản phẩm chức năng có nguồn gốc từ nấm bào ngư.
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Khảo sát sự sinh tổng hợp lovastatin của chủng nấm bào ngư Pleurotus sp được chọn khi nuôi trồng ở các điều kiện khác nhau.
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
• Khảo sát sự tăng trưởng hệ sợi nấm của các chủng nấm bào ngư Pleurotus spp khi nuôi cấy trong các môi trường dinh dưỡng khác nhau
• Khảo sát lovastatin trong hệ sợi của các chủng nấm bào ngư Pleurotus spp khi nuôi cấy trong môi trường Ohta
• Khảo sát lovastatin trong quả thể chủng nấm bào ngư Pleurotus sp được chọn khi nuôi trồng ở các điều kiện khác nhau (cơ chất, pH, nhiệt độ).
Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
Đề tài hướng đến việc sàng lọc những loài nấm Pleurotus có khả năng sinh tổng hợp lovastatin cao nhất, ghi nhận các điều kiện phù hợp để nuôi trồng nấm nhằm giảm thời gian nuôi trồng, cải thiện năng suất và chất lượng của nấm
Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần hoàn chỉnh thêm qui trình nuôi trồng nấm bào ngư giúp hình thành nguồn sản phẩm có chất lượng an toàn và chứa nhiều hoạt chất sinh học tốt cho sức khỏe con người.
CƠ SỞ LÝ THUYẾT
TỔNG QUAN VỀ NẤM BÀO NGƯ
2.1.1 Hệ thống phân loại và khu vực nuôi trồng nấm bào ngư
Chi Pleurotus được phân loại theo hệ thống như sau:
Giới (Regnum) : Nấm (Fungi) Ngành (Phylum) : Nấm đảm (Basidiomycota) Lớp (Class) : Nấm tản (Agaricomycetes)
Bộ (Ordo) : Nấm tản (Agaricales)
Họ (Familia) : Nấm sò (Pleurotaceae) Chi (Genus) : Nấm sò (Pleurotus)
Nấm bào ngư gồm nhiều loài thuộc Chi Pleurotus Theo chữ Hylạp Pleurotus có nghĩa mang một bên (Pleuron - bên cạnh) và mũ nấm có hình dạng như vỏ sò (otes
- lỗ tai) Do có hình dạng giống vỏ sò cũng được gọi là nấm bào ngư (nấm sò) Chi Pleurotus có tới 39 loài khác nhau về màu sắc, hình dạng như nấm bào ngư xám (P sajor - caju), bào ngư trắng (P florida), bào ngư tím (P ostreatus), … (Đinh Xuân
Nấm bào ngư được trồng ở nhiều ở các nước Châu Âu, Châu Á và các nước nhiệt đới, trong đó có Việt Nam Trước đây, nấm bào ngư chủ yếu mọc hoang dại và được gọi với nhiều tên tùy theo vùng miền: miền Bắc gọi là nấm chân dài (nấm hương trắng), nấm sò, còn nấm dai thường được gọi phổ biến ở miền Nam (Nguyễn Lân Hùng, 2005)
Xét về sản lượng nuôi trồng, nấm bào ngư cho sản lượng cao so với các loại nấm ăn khác được nuôi trồng trên thế giới Tại Việt Nam, nấm bào ngư được nuôi trồng phổ biến đặc biệt là các tỉnh phía Nam Những chủng nấm bào ngư được trồng nhiều là chủng bào ngư xám, bào ngư trắng, bào ngư Nhật Gần đây có thêm nhiều chủng nấm bào ngư thương mại như nấm hoàng kim (nấm bào ngư vàng), nấm tiểu yến, nấm đùi gà (nấm bào ngư vua), nấm bào ngư hồng
Nguồn: Kirk P.M., Cannon P.F., et al (2008)
Nguồn: Viện công nghệ sinh học ứng dụng
H椃nh 2.1 Các loài nấm bào ngư Pleurotus (a) bào ngư hồng – P salmoneo – tramineus; (b) bào ngư trắng- P florida; (c) bào ngư vàng – P citrinopileatus; (d) bào ngư xám – P pulmonarius
Nấm bào ngư được khuyến khích trồng ở các nước đang có nền kinh tế phát triển nhằm cung cấp nguồn thức ăn chứa protein thực vật Việc nuôi trồng nấm bào ngư giúp ích cho việc tận dụng các chất thải nông nghiệp làm nguyên liệu nuôi trồng, giải quyết tình trạng gây ô nhiễm và góp phần cung cấp cho đất nguồn ni tơ hữu cơ tốt cho sự phát triển của hệ vi sinh vật (Nguyễn Hữu Hỷ và cs, 2015)
2.1.2 Các yếu tốtác động đến sựsinh trưởng và phát triển của nấm bào ngư
Nấm bào ngư thúc đẩy quá trình của sự chuyển hóa các chất xơ, phân hủy polysaccaride tự nhiên ở nguyên liệu nuôi trồng để cung cấp nguồn dưỡng chất cần thiết cho nấm tăng trưởng như cacbon, nitrogen, vitamin và khoáng chất (Bellettini và cs, 2019)
Carbohydrate có trong các cơ chất như gỗ, mùn cưa và rơm rạ, chứa khoảng
60 - 70% cellulose và hemicellulose Trong các giai đoạn phát triển của nấm, cellulose, hemicellulose bị thủy phân nhờ các enzym có trong sợi nấm, chúng được vận chuyển vào các tế bào sợi sau đó chuyển hóa thông qua một loạt các con đường carbohydrate (Deepalakshmi và cs, 2014; Kalac và cs, 2013; Maftoun và cs, 2015) Bên cạnh việc thủy phân thông qua quá trình đường phân nhằm cung cấp năng lượng cho sự phát triển, các chất chuyển hóa có thể được tổng hợp thành các polysaccharide, tham gia vào cấu tạo thành tế bào như glucan và chitin hoặc thành glycogen, arabitol, trehalose hoặc mannitol (Maftoun và cs, 2015)
Các số liệu công bốtrong đề tài chỉ rõ mục đích khi sử dụng các chất thải nông nghiệp như rơm rạ, lúa mì, lõi bắp, bã hạt cà phê và mạt cưa thì đều tác động đến tốc độ sinh trưởng và phát triển của nấm bào ngư trên các rác thải của ngành nông nghiệp (Hussain và cs, 2002; Pant và cs, 2006; Dias và cs, 2003; trích bởi Bellettini và cs,
2019) Owaid và cs (2015), so sánh năng suất và hiệu suất sinh học khi nuôi cấy trên nguyên liệu có bổ sung chất dinh dưỡng cho kết quả cao so với cơ chất thông thường Điều đó cho thấy khi bổ sung các dưỡng chất cần thiết, yêu cầu về thành phần nguyên liệu nuôi trồng và sự sai lệch về hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin mang đến hiệu quả trong nuôi trồng (Kuhad và cs, 1997; trích bởi Bellettini và cs, 2019)
Khi nguyên liệu được cung cấp các dưỡng chất cần thiết thì giá thể nuôi trồng dễ bị nhiễm khuẩn do chất nền có nhiều dưỡng chất phù hợp cho sự sinh sôi và phát triển của các vi sinh vật có lợi sẽngăn cản sựsinh trưởng của sợi như nấm mốc xanh,
Trichoderma hoặc Aspergillus Nên giữ lớp nền khô ráo, cần thiết để sợi nấm sinh trưởng (Mejıa và Alberto, 2013)
Ngoài nguồn cacbon, nitơ cũng quan trọng trong protein, acid nucleic, sự tổng hợp purine, pyrimidin và polysaccharide (Drozdowski và cs, 2010; Abdullah và cs, 2015; trích bởi Bellettini và cs, 2019), là những thành phần cấu tạo nên thành tế bào của các loại nấm, phổ biến nhất là nitrat (NO 3- ) (Singh và cs, 2008) Ngược lại chỉ có
1 số ít loài sử dụng được nitrit vì gây độc đối một số loài Có thể dùng urê là nguồn cung cấp nitơ cho nguyên liệu trồng nấm (Miles và Chang, 2004; Gil - Ramirez và cs, 2013; trích bởi Bellettini và cs, 2019)
Tỷ lệ giữa cacbon và nitơ (C/N) tốt nhất từ 20 - 30%, và nhỏ hơn 50% (Bellettini và cs, 2019) Để gia tăng chất lượng, khối lượng sợi nấm thì bổ sung thêm bột ngũ cốc vào nguyên liệu là cần thiết trong quá trình nuôi trồng Bột ngũ cốc chứa nhiều đạm nitơ hữu cơ thích hợp cho sự gia tăng chất lượng, tăng sản lượng nấm thu được góp phần mang lại lợi ích kinh tế cao Có thể điều chỉnh, thay đổi số lượng và chất lượng của chất bổ sung để phù hợp với từng chủng nấm, từng chu kỳ phát triển cũng như giai đoạn sinh trưởng (Donini và cs, 2009)
Những chất khoáng cần thiết đối với nấm gồm phospho, lưu huỳnh, kali, magne, silic, nhôm, sắt và kẽm (Miles và Chang, 2004), nó được nấm hấp thụ dưới dạng vô cơ với nồng độ rất thấp (0,001 - 0,5 ppm), tham gia kích thích sản xuất các enzym, tham gia vào quá trình tổng hợp vitamin và các quá trình trao đổi khác của nấm (Fanadzo và cs, 2010) Nếu bổ sung quá nhiều sẽ tác động đến năng suất của nấm (Fanadzo và cs, 2010), làm chết sợi nấm, việc bổ sung quá mức sẽ làm giảm hương vị của nấm và tăng khả năng nhiễm khuẩn (Upadhyay và cs, 2002; Yildiz và cs, 2002; Lima và cs, 1975; trích bởi Bellettini và cs, 2019)
Môi trường là yếu tố chính ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến tốc độ tăng trưởng, phát triển của nấm qua các thời kỳ Môi trường nuôi trồng chính bao gồm nhiệt độ, độẩm, pH, ánh sáng và độ thông thoáng xung quanh và vệ sinh tại khu vực nuôi trồng
CÁC NGHIÊN CỨU VỀ LOVASTATIN Ở NẤM
Lovastatin là nhóm thuốc statin lần đầu tiên được cục Quản lý thực phẩm và dược Hoa Kỳ chấp nhận đưa vào sử dụng năm 1987 Lovastain được phát hiện đầu tiên ở chủng nấm Aspergillus terreus và được nghiên cứu rộng rãi trên các chủng nấm khác như Penicillium, Doratomycetes, Eupenicillium, Gymnoascus, Phoma Trichoderma và Pleurotus sp (Endo và cs,1986; Wasser và cs, 2002) Lovastatin có tác dụng tăng tính cơ sinh học của xương tại vùng tổn thương, giảm tai biến tim mạch bao gồm cả cơ tim, nhồi máu, đột quỵ bằng cách ngăn chặn xơ vữa động mạch ở những bệnh nhân có hoặc không có triệu chứng của bệnh động mạch vành (Seenivasan và cs, 2008; Radha và cs, 2013)
2 H椃nh 2.2 Công thức phân tửcủa lovastatin
Tên thông thường: Mevinolin, Monacolin K Trọng lượng phân tử: 404,5 g/mol
Lovastatin là một trong những chất thuộc nhóm statin, có tác dụng ức chế enzym hydroxymethylglutaryl - coenzyme reductase (HMG - CoA), men này chuyển HMG - CoA thành mevalonate, bước giới hạn tốc độ trong quá trình sinh tổng hợp cholesterol được hình thành từ dihydromonacolin L (DML) Dihydromonacolin L có công thức phân tử là C 19 H33O3, trọng lượng phân tử là 306,4g/mol Dihydromonacolin- L có hai hydroxyl, một liên kết đôi và một nhóm methyl tại vị trí C-6 được chuyển hóa từ methyl hoặc methionine (Kennedy và cs,1999)
3 H椃nh 2.3 Sơ đồ sinh tổng hợp lovastatin của nấm A terreus
Sự tổng hợp DML đầy đủ bao gồm 8 chu trình tổng hợp polyketide với khoảng
35 bước Dihydromonacolin L (DML) được xây dựng bởi LovB tổng hợp polyketide lặp đi lặp lại có tính khử cao (HR - iPKS), hợp tác với LovC, một enoyl reductase hoạt động trong trans (Wang và cs, 2021) Polyketide được hình thành dựa trên quá trình ngưng kết từ các đơn vị acetyl CoA hoặc malonyl CoA thông qua các vùng mã hóa enzyme ketosynthase (KS), ketoreductase (KR), dehydratase (DH), methyl transferase (MT) (Campbell và cs, 2010).
Nguồn: https://www researchgate net/profile/Hedwich - Kuipers
4 H椃nh 2.4 Con đường sinh tổng hợp cholesterol bị ức chế bởi statin Để gia tăng hiệu suất và hàm lượng lovastatin có trong nấm bào ngư thì việc chọn lựa và tối ưu hóa thành phần của nguyên liệu, nhiệt độ nhà trồng và độ pH của cơ chất là điều cần thiết khi thiết lập quy trình nuôi trồng lovastatin Trong các chất dưỡng chất được bổ sung vào cơ chất thì cacbon và nitơ đóng vai trò quan trọng trong quá trình ủ, vì những chất dinh dưỡng này tham gia vào quá trình chuyển hóa và tăng sinh khối (Alarcón và cs, 2006) Các nghiên cứu chỉ ra rằng việc sử dụng nguồn cacbon phân hủy chậm như lactose, tinh bột và glycerol hiệu quả với quá trình tổng hợp lovastatin (Bizukojc và cs, 2009), nhưng nếu sử dụng nồng độ glucose trên 70g/l thì nó sẽ ức chế biểu hiện nhóm gen lovastatin làm cho hàm lượng lovastatin giảm (Zhang và cs, 2020; Mulder và cs, 2015) cho rằng nitơ hữu cơ tốt nhất cho sản xuất lovastatin có trong dịch chiết nấm men, bột bắp và đậu nành, nhưng nếu sử dụng quá nhiều cũng gây cản trở sự tổng hợp Ngoài ra sự sinh tổng hợp còn tùy thuộc vào chủng, điều kiện nuôi cấy và nguyên liệu nuôi trồng (Casas López và cs, 2003; Goswami và cs, 2012)
Một số kỹ thuật dùng để định lượng lovastatin như sắc ký quang phổ tử ngoại (UV - VIS), sắc ký khối phổ (LC - MS), và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (qHNMR) Tsianta và cs (2021), chỉ ra hạn chế khi sử dụng sắc ký quang phổ tử ngoại (UV - VIS) khi đo các thành phần có trong nấm như (ergothioneine, lovastatin), các chất tồn tại và hấp thụ cùng một bước sóng hoặc các bước sóng gần nhau Mặt khác Dirk và cs, 2012 đã chứng minh phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (qHNMR) hiệu quả trong việc đo lường lượng statin do kỹ thuật này có sự lựa chọn cao, tùy thuộc vào sự dịch chuyển hóa học để xác định tổng số statin mà không cần chuẩn đối chiếu cụ thể của từng chất (Lam và cs, 2022)
Lachenmeier và cs, 2012 phát hiện có sự cộng hưởng ở tại các đỉnh ở vùng giữa trường (δ 6,05 - 6,01 ppm, δ 5,90 - 5,84 ppm, δ 5,61 - 5,56 ppm, δ 5,37 - 5,32 ppm, δ 4,39 - 4,34 ppm) và vùng hợp chất béo (δ 2,85 - 2,76 ppm, δ 2,63 - 2,56 ppm, δ 2,44 - 2,33 ppm, δ 1,98 - 1,93 ppm, δ 1,64 - 1,57 ppm, δ 0,91 - 0,85 ppm) khi so sánh phổ của dung dịch chuẩn lovastatin với phổ của dung dịch gạo mốc Tuy nhiên, những cộng hưởng trong vùng hợp chất béo này không thích hợp để định lượng bởi các tín hiệu chồng chéo mạnh với các hợp chất nền Xem xét các tín hiệu trong vùng giữa thì tại đỉnh δ 5,37 - 5,32 ppm thích hợp để định lượng lovastatin vì độ nhạy tốt nhất và tín hiệu này khôngbị nhiễu
Phổ qHNMR của lovastatin (chất chuẩn) ở hình 2.5 thể hiện bốn vùng tín hiệu đặc trưng của lovastatin 5,99 - 5,97 ppm, 5,79 - 5,76 ppm, 5,52 - 5,51 ppm, và 5,39 – 5,37 ppm
(Nguồn:Trương Thị Kiều Chinh, 2020)
5 H椃nh 2.5 Phổ đồ 1H NMR của lovastatin, 300 MHZ, CDCl3
2.2.2 Các nghiên cứu về lovastatin ở vi nấm và nấm lớn
❖Các nghiên cứu về lovastatin ở vi nấm
Các nghiên cứu khoa học về chất ức chế HMG - CoA reductase được các nhà khoa học trên thế giới phát hiện lovastatin có trên chủng Aspergillus terreus (Alberts và cs, 1980; Endo và cs, 1986) báo cáo rằng lovastatin đã được tìm thấy ở một số loài nấm bao gồm các chủng Penicillium, Doratomycetes, Eupenicillium, Gymnoascus, Phoma Trichoderma (Radha và cs, 2013; Negishi và cs, 1986) và phát hiện 17 chủng của chi Monascus có khả năng sinh lovastatin (Radha và cs, 2013)
Miyake và cs (2006) khảo sát ảnh hưởng của việc cung cấp dưỡng chất trong cơ chất đến sản xuất lovastatin của Monascus pilosus Mục tiêu của nghiên cứu là tìm ra một số nguồn cacbon và nitơ trong cơ chất ảnh hưởng sản xuất lovastatin Kết quả, maltose là nguồn cung cacbon duy nhất để tăng sản lượng lovastatin, cacbon từ glucose ức chế sản xuất lovastatin M pilosus yêu cầu nồng độ peptone nitơ hữu cơ phù hợp để kích thích sản xuất lovastatin
Bizukojc và cs (2011) đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của nồng độ glycerol và lactose đến sự tổng hợp lovastatin của nấm Aspergillus terreus ATCC 20542 Ghi nhận khi bổ sung cùng lúc hai chất này (10g lactose + 15g glycerol) sẽ cho lượng lovastatin (122mg/l) cao hơn so với việc sử dụng riêng lẻ (< 40 mg/l)
Osman và cs (2011) nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố vật lý và hóa học đến sản xuất lovastatin ghi nhận khi nuôi cấy ở điều kiện lắc sẽ gây trở ngại cho sự sản xuất lovastatin Nồng độ lovastatin sau khi cụ đặc đạt 188,3àg/ml khi ủ ở 30⁰C, trong 8 ngày ở pH 8,5 và trong môi trường yến mạch
Bizukojc và cs (2012) nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường đến sản xuất lovastatin (axit mevinolinic) trên nấm Aspergillus terreus ATCC20542, cho biết nếu nguyên liệu có độ pH axit (4 - 5,5), thì lượng lovastatin thu được thấp so với giá trị pH ban đầu của môi trường bằng 7,5 - 8,5
Nguyễn Thiên Phú và cs (2016) đã ghi nhận các chủng nấm sợi được phân lập và tuyển chọn ở rừng ngập mặn Cần Giờ có khả năng tạo lovastatin thuộc loài
Hassan và cs (2019) nghiên cứu các yếu tố tác động đến sự tổng hợp lovastatin như pH, nguồn cacbon, nguồn nitơ và các điều kiện tự nhiên của nấm Aspergillus terreus PU – PCSIR 1, kết quả nghiên cứu cho thấy pH 5,5, nhiệt độ 28⁰C trong 14 ngày và bổ sung thêm đậu nành, glycerol vào môi trường thu được lượng lovastatin là 2860mg/kg
❖Các nghiên cứu về lovastatin ở nấm lớn
Năm 1995, Nina Gunde - Cimerman và các cộng sự khảo sát hàm lượng lovastatin ở quả thể với các kích cỡ khác nhau (2cm, 5cm, 10cm, 15cm) Kết quả cho thấy chất chất ức chế HMG - CoA reductase có nhiều trong quả thể nấm Pleurotus ostreatus có đường kính 10 cm
Alarcón và cs (2003) khảo sát hàm lượng lovastatin có trong nấm Pleurotus ostreatus trên môi trường lỏng và môi trường rơm lúa mì, kết quả cho thấy hàm lượng lovastatin khi nuôi trồng Pleurotus ostreatus trên môi trường lỏng cao hơn khi nuôi trồng trên môi trường rơm lúa mì
Alarcón và cs (2006) ghi nhận sự tổng hợp lovastatin trên nấm Pleurotus ostreatus bị tác động bởi tỷ lệ C: N có trong nguyên liệu nuôi trồng
Atli và cs (2012) sàng lọc tính dược lý trên các nấm lớn ở Thổ Nhĩ Kỳ cho biết các chủng P ostreatus (OBCC 1031 - 5,8 mg/L) và chủng Omphalotus olearius
(OBCC 2002 – 4 mg/l) đều sinh lovastatin
Năm 2012, Chen và cs nghiên cứu thành phần lovastatin, γ - aminobutyric acid và ergothioneine trong quả thể và hệ sợi của nấm Số liệu nghiên cứu ghi nhận nấm
Pleurotus ostreatus (Nhật) và nấm Agaricus bisporus có hàm lượng lovastatin trong quả thể là 606,5mg/kg và 565,4 mg/kg) (Chen và cs, 2012)
VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Các chủng nấm Pleurotus được thu thập từ các trang trại trồng và sản xuất meo giống ở các tỉnh phía Nam được liệt kê ở bảng sau:
6 Bảng 3.1 Danh sách các chủng nấm bào ngư được khảo sát
TT Tên nấm Ký hiệu Số lượng Địa điểm thu mẫu
3 Nấm tiểu yến YTM1 1 Tp.HCM
4 Nấm bào ngư vàng VTM1 1 Vĩnh Long
5 Nấm bào ngư hồng HTM1 1 Vĩnh Long
Phạm vi nghiên cứu: Các chủng nấm Pleurotus được thu thập từ các tỉnh phía
Nam và quy mô thực hiện ở điều kiện phòng thí nghiệm.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Khảo sát thực nghiệm theo tiến trình như sau:
➢ Khảo sát sự tăng trưởng hệ sợi nấm của 12 chủng nấm bào ngư Pleurotus spp khi nuôi cấy trong các môi trường dinh dưỡng khác nhau nhằm xác định môi trường phù hợp cho nhân giống và giữ giống các chủng nấm
➢ Khảo sát lovastatin trong hệ sợi của 12 chủng nấm bào ngư Pleurotus spp khi nuôi cấy trong môi trường Ohta nhằm xác định hệ sợi của các chủng nấm có sinh tổng hợp lovastin hay không
➢ Từ kết quả phân tích lovastatin trong quả thể của 12 chủng nấm bào ngư
Pleurotus spp được thu thập từ các trại trồng nấm và kết quả của thí nghiệm trên chọn ra chủng nấm có khả năng sinh tổng hợp lovastatin cho khảo sát nuôi trồng
➢ Khảo sát lovastatin trong quả thể chủng nấm bào ngư Pleurotus sp được chọn khi nuôi trồng ở các điều kiện khác nhau (cơ chất, pH, nhiệt độ) để xác định ảnh hưởng của các yếu tố nuôi trồng đối với sự sinh tổng hợp lovastatin của chủng nấm
❖Phương pháp vi sinh cơ bản: thực hiện theo tài liệu Thí Nghiệm Công Nghệ
Sinh Học Tập 2 - Thí nghiệm Vi Sinh Vật Học của Nguyễn Đức Lượng và cs (2006)
- Kỹ thuật pha môi trường
- Kỹ thuật phân lập mẫu quả thể nấm
- Kỹ thuật nuôi cấy sinh khối nấm
❖Kỹ thuật thu mẫu hệ sợi và quả thể
- Hệ sợi khi nuôi cấy trong điều kiện lỏng, được lọc qua qua giấy lọc
- Quả thể được thu hái khi bắt đầu phun bào tử
- Hệ sợi và quả thểđược sấy khô ở 45⁰C đến khi trọng lượng không đổi
❖Phương pháp nuôi trồng nấm: Chủng nấm được nuôi trồng tạo quả thể trên môi trường mạt cưa cao su Phương pháp này được thực hiện dựa trên tài liệu Công nghệ nuôi trồng nấm tập 1, 2 của Nguyễn Lân Dũng (2003)
❖Phương pháp xác định hàm lượng lovastatin trong mẫu nấm: Mẫu khô của hệ sợi hoặc quả thể nấm được gửi đi phân tích tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Hóa hữu cơ, khoa Hóa trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQG Tp.HCM bằng phương pháp phổ cộng hưởng tử hạt nhân (qHNMR)
3.2.3.1 Kh ả o sát s ự tăng trưở ng h ệ s ợ i n ấ m c ủ a các ch ủ ng n ấm bào ngư Pleurotus spp khi nuôi c ấy trong các môi trường dinh dưỡ ng khác nhau
Mẫu nấm được thu thập tại các trang trại trồng và sản xuất meo nấm ở các tỉnh phía Nam, mẫu nấm tươi sau khi thu hái được bảo quản trong các túi giấy, phân lập trên môi trường PDA (potato dextrose agar) và làm thuần qua vài lần cấy chuyền.Các môi trường khảo sát có chứa các thành phần tự nhiên như cà rốt, giá đỗ được chọn mua tại các siêu thị trên địa bàn thành phố
Các giống nấm được chuẩn bị trên đĩa petri chứa môi trường PDA sau 7 ngày nuôi cấy, được đục lỗ tròn có diện tích 20mm 2 tại rìa tăng trưởng của tơ nấm Sau đó lấy các miếng thạch có tơ nấm cấy chuyển vào đĩa petri đường kính 90 cm chứa 20 ml môi trường của từng nghiệm thức Đo diện tích tơ nấm sau 9 ngày nuôi cấy và xử lý bằng phần mềm Image J (National Institutes of Health, Hoa Kỳ)
Các loại môi trường sử dụng trong thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.2
7 Bảng 3.2 Thành phần môi trường thạch
TT Môi trường Kí hiệu Thành phần môi trường
1 Thạch khoai tây PDA (Potato dextrose agar)
2 Thạch SD SDA (Sabouraud dextrose Agar)
3 Thạch cà rốt CGA (Carrot glucose Agar)
4 Thạch giá đỗ BGA (Beansprout
Giá đỗ 200 g/L, glucose 20 g/L, agar 15g/L Sau khi khảo sát trên môi trường thạch, tiếp tục thực hiện thí nghiệm nuôi cấy trên môi trường lỏng với các thành phần tương tự thí nghiệm ở môi trường thạch Thành phần môi trường được trình bày ở bảng 3 3
8 Bảng 3.3 Thành phần môi trường lỏng
Sử dụng bình nuôi cấy chứa 40 ml môi trường đã được chuẩn bị Nuôi cấy điều kiện lỏng tỉnh Hệ sợi sau 14 ngày nuôi cấy được thu nhận và sấy khô ở nhiệt độ
60 o C đến khối lượng không đổi để xác định khối lượng
Các thí nghiệm đều tiến hành ở điều kiện nhiệt độ phòng nuôi cấy là 25 o C, tối hoàn toàn Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) với 3 lần lặp lại Số liệu được phân tích bằng phần mềm Minitab 9.0, sử dụng phương pháp so sánh Turkey với độ tin cậy 95%
3.2.3.2 Kh ả o sát lovastatin trong h ệ s ợ i c ủ a các ch ủ ng n ấm bào ngư Pleurotus spp khi nuôi c ấ y trong môi trườ ng Ohta
Các chủng nấm được nuôi cấy hoạt hóa trên môi trường PDA trong 4 ngày Sau đó các chủng nấm được nuôi cấy trong 5 bình tam giác chứa 40 ml môi trường Ohta (Ohta,1990) Điều kiện nuôi cấy: môi trường lỏng, 27⁰C, lắc 100 vòng, trong tối
Môi trường có pH 5, hấp ở 121⁰C trong 7 phút
Sau 14 ngày nuôi cấy, thu hệ sợi bằng giấy lọc và sấy khô ở 45⁰C đến khi trọng lượng không đổi và đem mẫu đi phân tích hàm lượng lovastatin tại bộ môn Hóa Hữu cơ thuộc khoa Hóa trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh
TT Môi trường Kí hiệu Thành phần môi trường
1 Khoai tây PDA (Potato dextrose Broth)
2 SD SDA (Sabouraud dextrose Broth)
3 Cà rốt CGA (Carrot glucose Broth)
3.2.3.3 Kh ả o sát lovastatin trong qu ả th ể ch ủ ng n ấm bào ngư Pleurotus sp khi nuôi tr ồ ng ở các điề u ki ệ n khác nhau
Hiện nay, các cơ sở trồng nấm bào ngư ở Thành phố Hồ Chí Minh sử dụng mùn cưa từ cây cao su làm nguyên liệu để trồng vì đây là nguồn nguyên liệu dễ tìm, bổ sung dinh dưỡng dễ dàng và thời gian thu hái nấm nhanh hơn gỗ Do đó, đề tài chọn mùn cưa cây cao su làm cơ chất nuôi trồng Chủng nấm bào ngư được lựa chọn dựa trên kết quả phân tích lovastatin trong quả thể của 12 chủng nấm bào ngư Pleurotus spp được thu thập từ các trại trồng nấm và từ thí nghiệm 3.2.3.2
Chuẩn bị môi trường nhân giống cấp 2 có công thức gồm: 97% lúa, 2 % cám gạo và 1% thạch cao Tất cả nguyên liệu được phối trộn, đóng bịch và hấp tiệt trùng ở 121 o C trong 45 phút Sau quá trình hấp, làm nguội trong 24 tiếng Meo giống nấm cấp 2 sẽ được cấy vào mỗi bịch phôi tùy theo yêu cầu của từng nghiệm thức Bịch phôi sau khi cấy, được ủ trong phòng tối ở nhiệt độ 25 o C Mỗi nghiệm thức gồm 16 bịch có khối lượng 500g/bịch