Nghiên céu các � c �iÃm sinh hÍc và kh£ n�ng sinh tÕng hãp Enzym Endolysin có ho¡t lñc diÇt vi khu©n Staphylococcus Aureus cça dòng thñc khu©n thà NA6 pdf VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌ.
VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP Dề tài: NGHIÊN cú u CÁC ĐẶC ĐIẾM SINH HỌC VÀ KHẢ NĂNG SINH TÔNG HỢP ENZYM ENDOLYSIN CÓ HOẠT LỤC DIỆT VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AURELS CỦA DÒNG THỤC KHUẤN THÉ NA6” Người hướng dẫn : ThS Nguyễn Thị Hồng Hải Sinh viên thực : Nguyễn Thị Dung Lớp : CNSH 13-02 Hà Nội-2017 Khóa luận tơt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội MỤC LỤC LỜI MỞ ĐÀU PHẦN I: TÔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát chung tình hình ngộ độc thực phẩm 1.1.1 Tình hình ngộ độc thực phấm giới 1.1.2 Tình hình ngộ độc thực phấm Việt Nam 1.2 Vi sinh vật gây bệnh Staphylococcus aureus 1.2.1 Giới thiệu Staphylococcus 1.2.2 Staphylococcus aureus 1.2.2.1 Hình thái, đặc điểm sinh hóa 1.2.2.2 Điều kiện tăng trưởng phân bố 11 1.2.2.3 Tính kháng thuốc kháng sinh 12 1.2.2.4 Các yếu tố độc lực Staphylococcus aureus 13 1.2.2.5 Các yếu tố chống lại tự vệ tế bào 14 1.2.2.6 K.hả gây bệnh 15 1.2.2.7 Ngộ độc thực phẩm Staphylococcus aureus 16 1.2.3 Độc tố ruột enterotoxin Staphylococcus aureus 16 1.2.3.1 Đặc điểm 16 1.2.3.2 Tính chất 17 1.2.3.3 Phân loại 17 1.2.3.4 Các yeu tố ãnh hưởng đến phát triển việc tạo độc tố SE Staphylococcus aureus 18 1.2.3.5 Nhũng hoạt tính độc tố SE 19 1.2.3.6 Tần suất Staphylococcus aureus mang gcn sinh độc tố 20 Sinh viên: Nguyễn Thị Dung Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 1.3 Tổng quan enzym endolysin 21 1.3.1 Giới thiệu cnzym cndolysin 21 1.3.1.1 Khái niệm 21 1.3.1.2 Cấu tạo 21 1.3.1.3 Tính chất endolysin 22 1.3.2.4 Vai trò ứng dụng 24 1.3.3 Tổng hợp nhân tạo endolysin kháng khuẩn 24 1.3.4 ứng dụng endolysin công nghệsinh học thực phẩm 26 1.4 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến khẳ sinh enzym endolysin 28 1.4.1 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy 28 1.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy 28 1.4.3 Ảnh hưởng pH 29 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 30 2.1 Vật liệu 30 2.2 Hóa chất thiết bị 30 2.3 Phuong pháp nghiên cứu 30 2.3.1 Các môi trường nuôi cấy chủ yếu 30 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu 31 2.3.2.1 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuấn cúa thực khuẩn thể (theo Stephen, 2009) 31 2.3.2.2 Phương pháp phân tách thực khuẩn thể 32 2.3.2.3 Phương pháp nhận dạng dòng thực khuẩn thể 32 Sinh viên: Nguyễn Thị Dung Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 2.3.2.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy, thành phần môi trường tới phát triển hoạt tính cúa dịng thực khuấn the NA6 33 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Ket đánh giá hoạt tính kháng khuẩn gây bệnh Staphylococcus aureus dòng thực khuẩn thể NA6 35 3.1.1 Nguồn gốc hình thái dịng thực khuẩn thể NA6 35 3.1.2 Đánh giá hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh Staphylococcus aureus dòng thực khuẩn thể NA6 36 3.2 Xác định nguồn sinh enzym endolysin có khả ức chế vi khuẩn gây bệnh Staphylococus aureus dòng thực khuẩn thể NA6 37 3.2.1 Đánh giá khả kháng số vi khuẩn gây bệnh cùa dòng thực khuấn the NA6 38 3.2.2 Xác minh endolysin qua khã kháng endolysin dòng TKT NA6 39 3.2.3 Phân loại thực khuẩn thể NA6 39 3.3 Nghiên cứu ảnh huởng pH, nhiệt độ đến phát triển hoạt tính dịng thực khuẩn thể NA6 42 3.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 42 3.3.2 Ảnh hưởng pH 44 3.3.3 Ánh hưởng nguồn cacbon nitơ 45 3.3.3.1 Ảnh hưởng nguồn cacbon 45 3.3.3.2 Ảnh hướng nguồn Nitơ 46 PHẰN IV: KẾT LUẬN 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 Sinh viên: Nguyễn Thị Dung Khóa luận tơt nghiệp Viện • _Đại • học • Mở Hà Nội DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Những đặc tính s aureus, s epidermidis Micrococci 11 Bảng 2: Các đặc điểm endolysin để ứng dụng thực phẩm 23 Bảng 3: Đường kính vòng phân giài vi khuấn s aureus dòng thực khuẩn thể NA6 36 Bảng 4: Kiểm tra khả kháng số vi khuẩn gây bệnh dòng thực khuẩn thể NA6 38 Bảng 5: Xác minh cndolysin qua khả kháng cndolysin cùa NA6 39 Bảng 6: Độ tưong đồng đoạn gen dòng thực khuân NA6 41 Bảng 7: Ánh hướng nhiệt độ đến phát triển hoạt tính dịng TKT NA6 42 Bảng 8: Ảnh hưởng pH đến phát triển hoạt tính dịng TKT NA6 44 Bảng 9: Sự phát triền hoạt tính cứa TKT NA6 nguồn cacbon khác 45 Bảng 10: Ảnh hưởng nguồn Nitơ đến phát triển hoạt tính dịng thực khuấn thể NA6 Sinh viên: Nguyễn Thị Dung 46 Khóa luận tơt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội DANH MỤC HÌNH Hình 1: Hình thái Staphylococcus aureus Hình 2: Tụ cầu Staphylococcus aureus gram dương kính hiển vi Hình 3: Các yếu tố độc lực Staphylococcus aureus 13 Hình 4: cấu trúc điến hình vách peptidoglycan vi khuẩn Gram dương 22 Hình 5: Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn Staphylococcus aureus 35 Hình 6: Hoạt tính đối kháng với vi khuấn gây bệnh s aureus dòng thực khuẩn thể NA6 37 Hình 7: Khá ức chế vi khuẩn s.aureus cúa TKT NA6 nuôi 35°c 43 Hình 8: Khả phát triển ức chế vi khuẩn gây bệnh s.aureus dòng TKT NA6 mơi trường TSB có bổ sung 0,5% lactose Sinh viên: Nguyễn Thị Dung 46 Khóa luận tơt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội LỜI MỎ ĐÀU Hiện ngộ độc thực phẩm mối lo ngại nghiêm trọng cho sức khỏe cộng đồng toàn giới Nguyên nhân người sử dụng loại thực phấm bị nhiễm loài vi khuấn gây bệnh hay độc tố chúng Mặc dù có cơng nghệ đại, phương pháp thực hành sán xuất tốt (GMP), kiếm soát chất lượng vệ sinh an toàn sản xuất đánh giá rúi ro (HACCP), sổ lượng trường hợp bị ngộ độc bị bệnh thực phấm tăng lên suốt thập kỷ qua Ớ châu Âu, mồi năm ước tính có 380.000 người dân bị bệnh sử dụng sản phấm thực phấm nhiễm vi khuẩn, loại vi khuấn gây bệnh như: Staphylococcus aureus, Salmonella Listeria [16] Staphylococcus aureus tác nhân phố biến gây nhiễm trùng bệnh viện cộng đồng dân cư với tỷ lệ mác từ vong cao toàn giới aureus nhiễm độc thức ăn, đồ uống tiếp xúc người mang mầm bệnh dần đến viêm ruột cấp thức ăn có chứa độc tố ruột aureus, gây nước điện giãi dẫn tới sốc aureus nguyên nhân hàng đầu gây nhiễm khuấn bệnh viện, chủng s aureus gây nhiễm khuẩn bệnh viện thường có khả kháng lại nhiều kháng sinh s.aureus cịn gây hội chứng sổc nhiễm độc tiết độc tố gây sốc Theo số quan quản lý thực phẩm châu Âu, vi sinh vật gây bệnh phổ biến có nguồn gốc từ thực phẩm bao gồm Salmonella, Escherichia coli O157:H7, s aureus Listeria với số lồi khác Sử dụng chất hóa học đế bảo qn thực phẩm chấp nhận nhiều chất bảo quản hóa học làm ảnh hưởng lâu dài tới sức khỏe cộng đồng Trong số chất báo quản sinh học biết nay, endolysin thu hút quan tâm nhà khoa học có khả diệt ức chế vi sinh vật gây bệnh Sinh viên: Nguyền Thị Dung Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Endolysins (hay tên gọi khác lysins) enzym thủy phân có nguồn gốc từ thực khuấn the (bacteriophage) có tác dụng phá hủy peptidoglycan thành tế bào vi khuẩn giai đoạn cuối chu trình sinh sản thực khuẩn thề Các enzyme làm giám độ mạnh học thành tế bào dần đến dung giải tế bào giãi phóng thực khuẩn thế hệ Do có mặt endolysins chúng phân hủy lớp peptidoglycan thành tế bào cùa vi sinh vật chúng tiếp xúc, dẫn đến vi sinh vật bị chết, chúng coi chất kháng sinh thực phẩm có tính tác động chọn lọc, không thay đối đặc điếm càm quan, kết cấu thực phấm an toàn cho người Xuất phát từ lý tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm sinh học khả sinh tổng hợp enzym endolysin có hoạt lực diệt vi khuẩn Staphylococcus aureus dòng thực khuẩn thể NA6” MỤC ĐÍCH CỦA ĐÈ TÀI: Nghiên cứu đặc điếm sinh học khà sinh tống hợp enzym endolysin để dịng thực khuẩn thể NA6 có hoạt lực diệt vi khuẩn gây bệnh Staphylococcus aureus cao NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: Đánh giá hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh s aureus dòng thực khuẩn thể NA6 Nghiên cứu đặc điểm sinh học cúa dòng thực khuấn the NA6 Ảnh hường loại môi trường nuôi cấy (nguồn carbon, nitơ, muối khoáng ) đến sinh tổng hợp enzym endolysin hoạt tính kháng khuấn cúa dịng thực khuẩn the NA6 Ánh hưởng pH, nhiệt độ đến phát triền hoạt tính dịng thực khuẩn the NA6 Sinh viên: Nguyền Thị Dung Khóa luận tôt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội PHÀN I: TỎNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát chung tình hình ngộ độc thực phấm 1.1.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm giới Từ năm 1973 đến năm 1987, theo thống kê Cơ quan Kiểm soát bệnh tật (Centers for Disease Control: CDC) Atlanta (Hoa Kỳ), ước tính có khống 500 trận dịch bệnh thức ăn gây nên, ảnh hưởng trung bình khoảng 16.000 người mồi năm Tuy nhiên, số chưa đánh giá cách đầy đủ, chưa phản ánh thật tầm quan trọng cua vấn đề Tì lệ mắc bệnh hàng năm khơng rõ, theo thống kê quan y tế Hoa Kỳ, riêng Hoa Kỳ, ước tính có khoảng 6.500.000 đến 81.000.000 lượt bệnh nãm Ớ Á châu, nhiều trận dịch ngộ độc thức ăn gần ghi nhận Nhật điều làm cho nhiều quốc gia khác phải lo ngại Từ tháng dến tháng năm 2010, biến cố ngộ dộc vi khuẩn E.coỉi nhiễm từ cải Romaine lettuce xảy Michigan, New York, Tennessee Pennsylvania, Hoa Kỳ Thú phạm chúng E.coli mới, E.coli 0145 Đây chủng loại thấy nên nhà khoa học quan tâm đến E.coli 0145 gây bệnh tương tự E.coli 0157:H7 Biến cố làm cho vài chục người ngã bệnh Vào trung tuần tháng năm 2011, Châu Âu chấn động dịch bệnh ngộ độc thực phấm E.coli 0104, chủng làm hủy hoại xuất huyết niêm mạc ruột Enterohemorrhagic E.coli EHEC Đây loại thấy từ xưa Người ta nghi nguồn lây nhiễm từ dưa leo hữu organic sản xuất từ vùng Almeria Malaga, thuộc Tây Ban Nha nhập vào quốc gia Châu Âu Tính đến 30/5/2011, Đức quốc gia bị nặng với gần 400 nguời bệnh có 14 tứ vong Đan Mạch có 11 tử vong Ngồi ra, dịch bệnh thấy xuất Thụy Điển, Anh Quốc, Hà Lan Sinh viên: Nguyền Thị Dung Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Vi khuẩn nhũng nguyên nhân gây ngộ độc thực phấm nhiều Tại nước Anh, 2000 ca bị ngộ độc thực phấm riêng lẻ vi khuẩn Campylobacter jejuni chiếm 77,3 %, Salmonella 20,9 %, Escherichia coli 0157:H7 1,4 %, vi khuấn lại gây 0,1 % số ca Triệu chứng ngộ độc thực phẩm vi khuẩn thường xuất sau 12-72 sau ăn thức ăn bị nhiễm khuấn Hoa Kỳ: theo số liệu FoodNct từ năm 1996 đến 1998, CDCP ước tính ràng hàng năm có 76 triệu ca ngộ độc thực phẩm (26 nghìn ca 10 vạn dân), đó: 325 nghìn nhập viện (111/10 vạn dân); nghìn chết (1,7/10 vạn dân) Ton thất gây bới sụt giảm suất chi phí điều trị năm 1997 35 tì Mỳ kim Pháp: số vụ ngộ độc báo cáo từ năm 1999-2000 cho thấy: 32% số vụ sản phẩm sữa đặc biệt phơ mai, 22% thịt, 15% xúc xích, bánh pate; 11% cá hài sản; 11% trứng sản phẩm trứng; 9,5% gia cầm Ngộ độc s.aureus đứng hàng thứ hai sau Salmonelỉ Những thực phầm bị nhiễm tụ cầu gây ngộ độc thường gặp thịt, cá, gà sàn phẩm chúng, rau cải, trứng, nấm, sữa sản phẩm từ sữa, kcm, phomai, thực phàm lên men [39] Đài Loan: s aureus chiếm 30% số vụ dịch từ năm 1986 đến năm 1995, Vào tháng năm 2000, vụ ngộ độc thực phấm tụ cầu trường trung học Taichung County làm 10 số 356 học sinh có biểu ngộ độc 2-3 sau ăn sáng Tại Brazil, vào tháng tháng năm 1999 xảy hai vụ dịch làm 378 người bị ngộ độc dùng phomai sữa tươi có nhiễm tụ cầu [48], Tại Pháp, năm 1997 người ta tìm thấy s aureus tác nhân gây 569 tổng số 1142 vụ ngộ độc thực phẩm [44] Sinh viên: Nguyền Thị Dung Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp GTACCTATTACATGGAAGAAAGCGCTCGTTTCACCAACGGTAACCAG CCAATCACCGTTCGTAAAGTTGGTCCGTTTCTGTCTTGCCCGGTTGGT TACCAGTTTCAGCCGGGCGGTTACTGCGATTACACCGAAGTTATGCTG CAGGATGGCCACGTTTGGGTTGGTTACACTTGGGAAGGCCAGCGTTA CTACCTGCCGATTCGTACCTGGAACGGTAGCGCTCCGCCGAACCAGA TCCTGGGTGATCTGTGGGGTGAAATTAGCCTCGAG So sánh trình tự trơn ngân hàng dừ liệu NCBI chương trình BLAST để xác định mức độ tương đồng cứa dòng TKT NA6 Kết cho thấy dịng TKT NA6 có độ tương đồng tới >98% với staphylococcal phages như: phi 11, phi29 Bảng 6: Độ tuơng đồng đoạn gen dòng thục khuẩn thể NA6 Dòng TKT NA6 Chiều dài trình tự so sánh (nu) 1357 Dịng bacteriophage tương đồng Mức độ tuơng đồng (%) Staphylococcal phages phill 99 Staphylococcal phages phill 98 Theo dừ liệu NCBI thông tin dòng bacteriophage Staphylococcal phages phi 11, Staphylococcal phages phĨ29 cho thay dịng phage có hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh s aureus cao có enzym endolysin Dòng Staphylococcal phages phi 11 nghiên cứu tách chiết enzym endolysin tinh khiết enzym có hoạt tính kháng khuẩn s aureus cao Bên cạnh đó, dịng TKT NA6 có độ tương đồng cao với dịng Staphylococcal phages phil Vì vậy, dịng TKT có tiềm ứng dụng vào sàn xuất thực tế biện pháp xử lý sinh học Sinh viên: Nguyền Thị Dung 41 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng pH, nhiệt độ đến phát triển hoạt tính dịng thực khuẩn thể NA6 Theo nghiên cứu Iriarte ctv., 2007 cho thấy nhiệt độ độ ẩm có ảnh hưởng đến lớn đến tuổi thọ thực khuấn thể Khi TKT tiếp xúc với cường độ cao cúa ánh sáng mặt trời vào ban ngày giám mật độ nghiêm trọng vòng vài sau áp dụng điều kiện thực tế Thử nghiệm Ignoffo ctv dải pH đổ đánh giá tác động đến tồn thực khuẩn the cho thấy pH thấp cao có ảnh hưởng tiêu cực đến phát triển cùa TKT Tuy nhiên, nhiệt độ, độ ấm, pH tương đối khác dòng TKT khác phụ thuộc điều kiện thực thí nghiệm 3.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ Dòng thực khuẩn thể NA6 vi khuẩn s aureus nuôi lắc môi trường TSA lỏng nhiệt độ khác nhau: 25° c, 30°C, 35°c, 40°C, 45°c, tốc độ lắc 200 vòng/phút Quan sát dịch lỏng đánh giá mật độ thực khuẩn thể sau 24h nuôi cấy Bảng Ảnh hường nhiệt độ đến phát triển hoạt tính dịng TKT NA6 Nhiệt độ Mật độ TKT Mật • độ• vi khuẩn S.aurens (OD600nm) (pfu/ml) CTTN Đối chứng 25 5,3xlO8 1,8 5,3 30 2,9x1 o9 1,3 6,8 35 5,5x10'° 0,7 7,2 40 8,lxl09 1,2 6,7 45 2,5x1 o7 2,0 4,9 Sinh viên: Nguyền Thị Dung 42 Khóa luận tôt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Theo kết bảng cho thấy, ngưỡng nhiệt độ từ 30-35°C thích hợp cho sinh trưởng hoạt lực dòng TKT NA6 Nhiệt độ tối ưu 35°c Ở ngưỡng nhiệt độ thấp 20°C cao 45°c sinh trưởng hoạt lực cùa TKT NA6 giảm đáng kể Các nghiên cứu thực khuẩn thể độc lực cho thấy thực khuan thể chí nhân lên ký sinh vào tế bào vi khuẩn Đầu tiên thực khuan the (phage) phải tìm thấy chồ tiếp nhận đặc hiệu bề mặt tế bào vi khuẩn, sau enzym cuối phage làm tan tế bào vi khuẩn co bóp đẩy nhân chứa AND phage vào tế bào vi khuẩn Vó capsid lại vi khuấn Sau 2-3 phút, enzyme deoxyribonuclease phage xuất phá húy ADN tế bào vi khuẩn, mARN kèm theo hàng loạt enzym cần thiết cho phage tổng hợp ADN phagc hình thành với protein (tạo capsid) phagc tống hợp ribosome cúa tế bào Các thành phần cùa ADN lắp ghép với protein tạo thành phage Các phage hình thành sau thời gian khoảng 12 phút giài phóng phagc thường xảy phút thứ 25 Trung bình vi khuấn giâi phóng từ 100 đến vài trăm phagc Các thực khuấn thề vừa giải phóng lại tìm đến ký sinh vào tế bào vi khuẩn khác trình tồng hợp phage lại diễn trên, vi khuấn lại bị tiêu diệt Hình Khả ức chế vi khuẩn S.aureus TKT NA6 nuôi ỏ’ 35°C Sinh viền: Nguyễn Thị Dung 43 Khóa luận tơt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Theo hình cho thấy, kết nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu thực khuẩn độc lực Trong môi trường lỏng có vi khuấn phát triển, cho vào thực khuẩn thể tương ứng mơi trường vốn đục ngầu vi khuấn trở thành suốt sau vài 3.3.2 Anh hưởng pH Dòng thực khuẩn thể NA6 nuôi cấy môi trường TSB nhiệt độ 35°c dải pH khác nhau, nuôi lắc 200 vịng/phút 24 quan sát dịch lóng đánh giá mật độ thực khuan the Ket quà trình bày báng Bảng Ãnh hường cũa pH đến SỤ’ phát triển hoạt tính dịng TKT NA6 pH Mật độ TKT Mật • độ• vi khuẩn S.aureus (OD^oonm) (pfu/ml) CTTN Đối chứng l,8xio7 1,5 5,1 6,3x1 o8 1,6 7,1 2,7x10'° 0,7 7,9 2,9x1 o9 0,9 7,3 8,5x1 o6 1,9 5,2 Dịng thực khuẩn thể NA6 thích hợp với khoảng pH từ trung tính đến kiềm pH tối ưu cho sinh trưởng cùa thực khuẩn thể pH = 7,0, ức chế thu đạt kết cao cơng thức cịn lại Mặt khác, khoảng pH khảo sát, dòng thực khuẩn thể sinh trướng cho khẳ ức chế tốt, điều chứng tở dịng thực khuẩn thể có độc tính cao thích nghi với điều kiện pH khác Sinh viên: Nguyền Thị Dung 44 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 3.3.3 Anh hưởng nguồn cacbon nitơ 3.3.3.1 Anh hưởng nguồn cacbon Bảng Sự phát triển hoạt tính cua TKT NA6 nguồn cacbon khác Nguồn cacbon Mật độ TKT Mật • độ• vi khuẩn S.aureus (ODóOOnm) (pfu/ml) CTTN Đổi chứng Glucose 3,2x10'° 0,8 7,1 Sachacose 5,7x1 o8 2,1 6,5 Fuctose 2xl08 1,7 6,3 Maltose 4,9x1 o7 1,9 6,9 Lactose 6,lxl09 1,2 6,9 Dựa vào nghiên cứu trước, môi trường TSA sử dụng mơi trường bãn, có bổ sung 0,5% nguồn cacbon khác để ni cấy dịng TKT NA6 Kết cho thấy nguồn carbon khảo sát, glucose lactose nguồn cacbon phù hợp cho sinh trưởng khả ức chế vi khuẩn gây bệnh cao Sinh viên: Nguyền Thị Dung 45 Khóa luận tơt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Hình 8: Khả phát triển ức chế vi khuẩn gây bệnh s.aureus dịng TKT NA6 mơi trường TSA có bổ sung 0,5% lactose 3.3.3.2 Anh hưởng nguồn Nito’ Bảng 10 Ảnh hưởng nguồn Nitơ đến phát triển hoạt tính dòng thực khuẩn thể NA6 Nguồn nitơ Mật độ TKT Mật • độ• vi khuẩn s.aureus (Ol^óOOnm) (pfu/ml) CTTN Đối chứng Trypton 5,9x10’ 0,6 7,3 Cao thịt bò 2,6x10'° 3,1 7,1 Casein 7,lxl08 2,3 6,8 Soyton 4,3xl07 2,9 6,1 Kết quà thu bảng 10 cho thấy, với TSA môi trường nuôi cấy bố sung nguồn nitơ khác nhau, sau 24h nhân nuôi, mơi Sinh viên: Nguyền Thị Dung 46 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội trường có bổ sung cao thịt bò mật độ thực khuấn thể cao Tuy nhiên khả ức chế vi khuấn s.aureus lại so với trypton Với nguồn nitơ casein soyton cho mật độ TKT khă ức chế vi khuẩn không cao trypton cao thịt bị Vì vậy, ni TKT mơi trường TSA có bố sung 0,5% trypton tốt so với nguồn nitơ khác Sinh viên: Nguyền Thị Dung 47 Khóa luận tơt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội PHÀN IV: KẾT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ 4.1 Kết luận • Dịng thực khuấn thể NA6 có khả ức chế vi khuẩn gây s.aureus cao môi trường thạch đĩa sau 48 nuôi cấy Ngồi khả ức chế vi khuẩn chù (S.aureus), dịng NA6 cịn có khả ức chế vi khuẩn gây bệnh L isteria monocytogenes Xác định yếu tố ảnh hướng tới đến phát triến hoạt tính dịng thực khuẩn thể NA6 - Nhiệt độ tối ưu: 35-40°C - pH tối ưu: - Nguồn cacbon tối ưu glucose - Nguồn nitơ tối ưu trypton Giái trình tự gen cúa dịng thực khuấn NA6 so sánh NCBI chương trình BLAST để xác định mức độ tương đồng dòng TKT NA6 Kết cho thấy dòng TKT NA6 có độ tương đồng tới >98% với staphylococcal phages như: phi 11, phi29 4.2 Kiến nghị Được tiếp tục nghiên cứu dòng TKT NA6 đế tách tinh khiết cnzym cndolysin, ứng dụng báo quàn sữa bào quàn thực phâm Sinh viên: Nguyền Thị Dung 48 Khóa luận tôt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nưó’c Lê Huy Chính (2001), Vi sinh y học, Nhà xuất Y học, Hà Nội Bùi Thế Hiền, Tô Thị Thu Cộng (2005), Tình hình nhiễm thực phấm vi sinh vật hai xã huyện Kiến Xương tinh Thái Bình năm 2001, Trung tâm y tế dự phịng Thái Bình, Thơng tin khoa học, Cục an tồn vệ sinh thực phẩm, 2005 Nguyễn Đồ Phúc, Nguyễn Thị Kê, Trần Linh Thước (2006), Mối tương quan đậm độ sinh độc tố ruột (enterotoxin) s aureus hai môi trường nuôi cấy TSGM BHI, Y học Thành phố Hồ Chí Minh, sổ đặc biệt chuyên đề Y tế công cộng Y học dự phòng, phụ cúa tập 10, (sổ 4), tr 412-417 Nguyền Thị Kê, Nguyễn Xuân Mai, Nguyền Đỗ Phúc, Hoàng Hoài Phương, Bùi Thị Kiều Nương, Nguyễn Trần Chính, Cao Minh Nga, Cao Ngọc Nga, (2006), Khảo sát tính chất kháng kháng sinh số chúng vi sinh vật lấy qua đường tiêu hóa, Y học Thành phố Hồ Chí Minh, số đặc biệt chuyên đề Y tế công cộng Y học dự phòng, phụ cùa tập 10 (số 4), tr 406-411 Trần Linh Thước (2002), Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm Nxb Giáo dục 230 trang Tài liệu nưó'c ngồi Borysowski, J., Wcber-Dabrowska, B., & Gorski, A (2006) Bacteriophage endolysins as a novel class of antibacterial agents Experimental Biology Medicine (Maywood), 231, 366-377 Braga, L.C., Shupp, J.W., Cummings, c., Jett M., Takahashi, J.A., Carmo, L.S., Chartone-Souza E and Nascimento, M.A., (2004) Pomegranate extract Sinh viên: Nguyen Thị Dung 49 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp inhibits Staphylococcus aureus grow than dsubse quententero toxin production Journal of Ethnopharmacology 96 pp.335-339 Bremer, p J., Fletcher G c., and Osborne, c., (2004) Staphylococcus aureus, Nee Zealand Institute for Crop and Food Research