Khảo sát điều kiện nuôi trồng nấm quế linh (humphreya endertii) 2

MẪU 14KHCN CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 10 CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2 1 Vật liệu nghiên cứu 2 1 1 Đối tượng nghiên cứu Giống nấm Quế Linh (Humphreya endertii) dùng để nghiên cứu, được thu mẫu từ vườn quốc gia Phước Bình 2 1 2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng cho nghiên cứu  Thiết bị Bảng 2 1 Thiết bị sử dụng trong quá trình thực hiện thí nghiệm Tên Thiết Bị Nhãn Hiệu Xuất Xứ Nồi Hấp Khử Trùng Nga Tủ Sấy MEMMERT Đức Cân Phân Tích SARTORIUS, Model CP 224S Đức Bếp Từ Midea MI B2015D.

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Giống nấm Quế Linh (Humphreya endertii) dùng để nghiên cứu, thu mẫu từ vườn quốc gia Phước Bình 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ hóa chất dùng cho nghiên cứu  Thiết bị: Bảng Thiết bị sử dụng trình thực thí nghiệm Tên Thiết Bị Nồi Hấp Khử Trùng Tủ Sấy Cân Phân Tích Bếp Từ Nhãn Hiệu MEMMERT SARTORIUS, Model: CP 224S Midea MI-B2015DE Xuất Xứ Nga Đức Đức Việt Nam Tủ Cấy Cân Hồng Ngoại Tủ Lạnh ESCO-Singapore Model MF-50 Sanyo Singapore Japan Việt Nam 10 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP  Dụng cụ: Bảng 2 Dụng cụ sử dụng trình thực thí nghiệm Ống nghiệm có nắp Đĩa petri () Que cấy móc Dao cấy, lưỡi dao cấy Bơng khơng thấm Giấy báo Bình tia Túi nilong chịu nhiệt Erlen Pipette 2ml, 5ml, 10ml Giấy lọc Đèn cồn Becher 250ml, 500ml, 1000ml Ống đong 100ml, 250ml, 1000ml Bình tăng sinh 250ml Nút cổ nắp đạy phơi nấm  Hóa chất: Bảng Hóa chất sử dụng q trình thực thí nghiệm Hóa chất Ngun liệu Bột trùn Khoai lang Pepton Khoai tây Yeast extract Khoai mỡ D – glucose Agar Agar Lúa HCl Mùn cưa NaOH Cồn 96° MgSO4 Ure 11 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.2 Mơi trường 2.2.1 Mơi trường PGA Một lít môi trường PGA gồm thành phần sau: 200g khoai tây, 20g glucose, 20g agar, lít nước Mơi trường chuẩn bị cách cắt khoai tây thành dạng hạt lựu (10*10*10mm), đun sôi 30 phút Xác khoai tây loại bỏ dịch chiết thu nhận Dịch chiết tiếp tục cho vào thêm vào 20g glucose 20g agar định mức 1000ml, tiếp tục đun sôi khuây đến agar tan hết Môi trường PGA cho vào ống nghiệm hấp khử trùng 30 phút 121ᵒC, atm 2.2.2 Môi trường tăng sinh: Mơi trường tăng sinh có thành phần giống với mơi trường thạch cần khảo sát khơng có agar Môi trường tăng sinh dạng lỏng giúp hệ sợi tơ nấm hấp thu trược tiếp chất dinh dưỡng từ môi trường làm cho hệ sợi tơ nấm tăng trưởng tốt Tất môi trường cần khảo sát chuẩn bị dạng lỏng bình chứa 50 ml môi trường Giống nấm cấy vào chai môi trường lượng giống (10*10mm), giống nấm để bề mặt môi trường ni cấy (khơng lắc làm nấm chìm mơi trường tơ nấm không hô hấp được), giống nấm nuôi ủ 14 ngày 2.2.3 Môi trường meo hạt Lúa sau mua rửa sạch, loại bỏ lúa lép Nấu lúa đến lúa bắt đầu nứt vỏ, loại bỏ dư phối trộn dinh dưỡng (các yếu tố cần ảnh hưởng đến sinh trưởng tơ nấm cần khảo sát) Lúa đóng thành chai, chai chứa 100g lúa Hấp khử trùng 60 phút 121ᵒC, atm 2.2.4 Môi trường meo giá môi: Xử lý mùn cưa: mùn cưa phơi từ đến 10 ngày (mùn khô hút nước nhiều ủ vôi, ion Ca2+ diệt bớt vi khuẩn có mùn cưa) Mùn cưa ủ vôi 12 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 24 - 48h nhằm mục đính nhờ Ca2+ nước vôi xạ khuẩn đất vừa phân hủy mùn cưa tiêu diệt bớt vi khuẩn gây hại Làm phôi: mùn cưa sau xử lý phối trộn dinh dưỡng theo tỉ lệ thích hợp Mùn cưa đóng bịch, buộc cổ, đục lỗ đậy nắp Môi trường giá môi phải đạt độ ẩm 70% pH 6.5 ~ 7.0 Môi trường giá mơi đóng bịch (500g/bịch) Sau phơi nấm hấp khử trùng 120 phút 121ᵒC, atm 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp phân lập: Quả thể nấm Quế Linh (Humphreya endertii) khử trùng bề mặt cồn 700 Tai nấm cắt đôi dao cấy (đkvt), dùng dao cấy lấy mẫu thịt nấm vô trùng bên tai nấm cho vào ống nghiệm chứa môi trường PGA (đkvt) Tơ nấm phát triển đầy ống nghiệm sau ngày nuôi cấy 2.3.2 Phương pháp cấy chuyền: Môi trường PGA chuẩn bị đĩa Petri Môi trường cấy lượng giống gốc phân lập (đkvt) Sau tuần tơ nấm phát triển đầy đĩa Petri, sử dụng làm giống để thực nghiên cứu 2.3.3 Phương pháp khảo sát phát triển hệ sợi tơ nấm Quế Linh (Humphreya endertii) môi trường meo giống cấp (meo thạch) Giai đoạn meo giống cấp giai đoạn hệ enzyme để phân giải chất nấm chưa phát triển Hệ sợi tơ nấm sử dụng chất dinh dưỡng có sẵn ngồi mơi trường làm lượng để phát triển Các yếu tố cần khảo sát bổ sung trực tiếp vào môi trường nuôi cấy hệ sợi tơ nấm 2.3.3.1 Phương pháp khảo sát pH thích hợp cho phát triển tơ nấm Nấm lớn (nấm đảm) loài nấm hoại sinh thực vật Nó kí sinh thực vật, mơ thực vật chết mùn bã thực vật phân hủy[13] Thực thí nghiệm phải tích mơi trường mơi trường có pH 5~9 Hệ sợi tơ nấm nuôi ủ môi trường PGA với pH 5~9 Mỗi đĩa mơi trường thí nghiệm cấy lượng giống 4*4mm Thí nghiệm lập lại lần Đĩa giống quan sát ngày, chiều dài tơ đượcghi nhận chụp ảnh 13 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.3.3.2 Phương pháp khảo sát dịch chiết thích hợp cho hệ sợi tơ nấm phát triển Dịch chiết từ rau củ cung cấp vitamin số khoáng thiết yếu cho phát triển hệ sợi tơ nấm Dịch chiết từ rau củ khác cung cấp chất dinh dưỡng khác Hệ sợi tơ nấm nuôi ủ môi trường PGA thay dịch chiết khoai tây thành dịch chiết khoai lang khoai mỡ Chuẩn bị môi trường: Bảng 4: Môi trường khảo sát dịch chiết Môi trường 500ml dịch Môi trường chiết 500ml dịch Môi trường chiết 500ml dịch chiết khoai tây (200g/l) khoai lang (200g/l) khoai mỡ (200g/l) 10g glucose 10g glucose 10g glucose 10g agar 10g agar 10g agar Giống nấm lên mơi trường tích Mỗi đĩa mơi trường thí nghiệm cấy lượng giống 4*4mm Thí nghiệm lặp lại lần Hệ sợi tơ nấm khảo sát ngày Thí nghiệm lặp lại lần Đĩa giống quan sát ngày, chiều dài tơ ghi nhận chụp ảnh 2.3.3.3 Phương pháp khảo sát nguồn đạm thích hợp cho hệ sợi tơ nấm phát triển Nguồn đạm cần thiết cho phát triển hệ sợi tơ nấm tất giai đoạn phát triển khác Nguồn đạm cung acid amin thiết yếu cho hệ sợi tơ nấm sử dụng để tổng hợp chất như: purin, pyrimidin, protein, chitin vách tế bào Chất đạm giúp đảm bảo tỉ lệ C/N cho nấm phát triển [14] Cách thực hiện: 14 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Bảng 5: Môi trường khảo sát nguồn đạm cho phát triển hệ sợi tơ nấm Quế Linh Môi trường Môi trường Môi trường 500ml dịch chiết 500ml dịch chiết 500ml dịch chiết khoai tây (200g/l) khoai lang (200g/l) khoai mỡ (200g/l) 10g glucose 10g glucose 10g glucose 10g agar 10g agar 10g agar 0.25g Yeast extract 0.25g Pepton 0.25g Cao trùn Giống nấm lên mơi trường tích Mỗi đĩa mơi trường thí nghiệm cấy lượng giống 4*4mm Thí nghiệm lập lại lần Hệ sợi tơ nấm khảo sát ngày Thí nghiệm lập lại lần Đĩa giống quan sát ngày, chiều dài tơ ghi nhận chụp ảnh 2.3.3.4 Phương pháp xác định tốc độ tăng trưởng hệ sợi tơ nấm Hệ sợi tơ nấm tiến hành khảo sát cách dùng thước kẻ đo chiều dài từ đầu mút đến đầu mút đối diện Trên đĩa môi trường đo đầu mút hệ sợi tơ nấm tính giá trị trung bình Thu nhận kết lập bảng tăng trưởng hệ sợi tơ nấm Giá trị trung bình vòng tăng trưởng hệ sợi tơ nấm mơi trường 2.3.3.5 Phương pháp xác định khối lượng hệ sợi tơ nấm Phương pháp xác định khối lượng hệ sợi tơ nấm giúp làm rõ tốc độ tăng trưởng hệ sợi tơ nấm đồng thời giúp so sánh khối lượng sinh khối tạo thành môi trường Khối lượng sinh khối hệ sợi tơ nấm đánh giá sau 14 ngày tăng sinh môi trường nuôi ủ Dùng giấy lọc sấy khô đến trọng lượng không đổi lọc thu sinh khối hệ sợi tơ nấm Ghi nhận khối lượng hệ sợi tơ nấm sau sấy khô tới trọng lượng không đổi 2.3.4 Phương pháp khảo sát phát triển hệ sợi tơ nấm Quế Linh (Humphreya endertii) môi trường meo giống cấp (meo lúa) Môi trường meo giống cấp giai đoạn hệ enzyme hệ sợi tơ nấm bắt đầu phát triển Nấm tiết enzyme ngồi mơi trường để giải phân chất thành hợp chất đơn giản cho nấm hấp thụ 15 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Môi trường lúa sử dụng để khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến phát triển hệ sợi tơ nấm bổ sung thành phần dinh dưỡng sau: Bảng 6: Môi trường meo hạt để khảo sát phát triển hệ sợi tơ nấm Quế Linh STT Kí hiệu MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 Thành phần Lúa + 5% Cám gạo Lúa + 5% Cám bắp Lúa + 2.5% Cám gạo + 2.5% Cám bắp Lúa + 5% Cám gạo + 0.1% Pepton Lúa + 5% Cám gạo + 0.1% Ure Giống nấm cấy môi trường lúa để khảo sát Mỗi đĩa mơi trường thí nghiệm cấy lượng giống 4*4mm Thí nghiệm lập lại lần Hệ sợi tơ nấm khảo sát 14 ngày Môi trường lúa quan sát, đo chiều dài lan tơ hệ sợi tơ nấm 2.3.5 Phương pháp khảo sát phát triển hệ sợi tơ nấm Quế Linh (Humphreya endertii) môi trường meo giá môi Môi trường meo giá môi giai đoạn hệ sợi tơ nấm phát triển tạo thể nấm Meo giá môi môi trường cuối tạo suất cho nấm Bảng 7: Môi trường giá môi thử nghiệm phát triển hệ sợi tơ nấm Quế Linh STT Kí hiệu Thành phần T1 Mùn cưa cao + 5% cám gạo T2 Mùn cưa cao su + 5% cám bắp T3 Mùn cưa cao su + 5% cám gạo + 0.5% Ure Mùn cưa cao su + 5% cám gạo + 0.5% Ure + 1% bột nhẹ 0.1% T4 MgSO4 Cấy giống: đổ giống vào bịch phôi (dkvt), quan sát, chụp ảnh đo tơ đến nấm phát triển kín bịch phơi Ở giai đoạn này, nấm sử dụng pH độ ẩm meo giá môi phát triển,nhiệt độ phịng, để nơi có bóng rân 2.3.6 Phương pháp tưới đón nấm Sau tơ nấm phát triển đầy phôi nấm, phôi nấm chuyển vào nhà trồng chăm sóc tưới đón nấm Nấm giữ độ ẩm >= 70%, giữ cho nhiệt độ nấm từ 25 - 30ᵒC tạo điều kiện ánh sáng yếu cho nấm phát triển tốt 16 ... (500g/bịch) Sau phôi nấm hấp khử trùng 120 phút 121 ᵒC, atm 2. 3 Phương pháp nghiên cứu 2. 3.1 Phương pháp phân lập: Quả thể nấm Quế Linh (Humphreya endertii) khử trùng bề mặt cồn 700 Tai nấm cắt đôi dao... hệ sợi tơ nấm 2. 3.5 Phương pháp khảo sát phát triển hệ sợi tơ nấm Quế Linh (Humphreya endertii) môi trường meo giá môi Môi trường meo giá môi giai đoạn hệ sợi tơ nấm phát triển tạo thể nấm Meo... nấm phát triển đầy phôi nấm, phôi nấm chuyển vào nhà trồng chăm sóc tưới đón nấm Nấm giữ độ ẩm >= 70%, giữ cho nhiệt độ nấm từ 25 - 30ᵒC tạo điều kiện ánh sáng yếu cho nấm phát triển tốt 16