Mục tiêu nghiên cứu Xác định sự tương quan giữa tính chất methyl hóa bất thường vượt mức trên vùng promoter gen APC, DAPK trong bệnh ung thư vú trên thế giới và ở Việt Nam, tập trung vào
TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
Gen Polyposis Coli Adenomatous (APC)
Hình I.1 Vị trí gen APC trên nhiễm sắc thể số 5
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/324) Gen Polyposis coli adenomatous (APC) là gen ức chế khối u, định vị trên nhiễm sắc thể số 5 (5q21 – q22) (Polakis et al., 1997), gồm 15 exon (GeneCards, NCBI) Gen
APC mã hóa protein APC (2853 amino acid) tham gia vào con đường truyền tín hiệu
Wnt (con đường kinh điển), giúp duy trì ổn định các vi ống trong kì trung gian và quá trình nguyên phân, kiểm soát sự tăng sinh, biệt hóa, di cư và chu trình chết theo chương trình (Apoptosis) của tế bào (McCartney et al., 2008) Protein APC trực tiếp tham gia vào cơ chế điều hòa âm hoạt động của b-catein, liên quan giải phóng quá trình phiên mã Tcf/Lef (McCartney et al., 2008).
Gen Death-Associated Protein Kinase (DAPK)
Hình I.2 Vị trí gen DAPK trên nhiễm sắc thể số 9
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1612) Gen Death-Associated Protein Kinase (DAPK) thuộc nhóm gen điều hòa chu trình tế bào, định vị trên nhiễm sắc thể 9q21.33 (Truong et al., 2014), gồm 30 exon
(GeneCards, NCBI) DAPK là một protein kinase đa chức năng liên quan đến quá
2 trình điều hòa apoptosis, autophagy, membrane blebbing và phản ứng viêm (Huang et al., 2018), đóng vai trò trong việc điều khiển tế bào chất theo chương trình (Truong et al., 2014).
Epigenetics và sự methyl hóa vượt mức trên DNA
Epigenetics là những thay đổi ở mức độ biểu hiện kiểu gen mà không làm thay đổi trình tự DNA (Chen et al., 2014) Epigenetics bao gồm sự methyl hóa DNA, biến đổi histone (H3, H4, H2A và H2B) và microRNAs (miRNAs) (Chen et al., 2014) Trong tế bào thường, các cơ chế epigenetics đóng vai trò ổn định cấu trúc nhiễm sắc thể và điều hòa quá trình sao chép DNA, sửa chữa sai hỏng cấp độ DNA, phiên mã và biểu hiện gen (Crider et al., 2012)
Một số tác nhân dẫn đến biến đổi bất thường trong cơ chế Epigenetics: yếu tố môi trường: kim loại nặng, thuốc trừ sâu, khí thải động cơ điezen, khói thuốc lá, hydrocarbon dạng vòng thơm; yếu tố nội sinh: nội tiết tố, chất phóng xạ, vi rút và vi khuẩn … (Weinhold et al., 2006)
Methyl hóa DNA và đảo CpG
Sự methyl hóa DNA là phản ứng hóa học xúc tác bởi enzyme DNA methyltransferases DNMTs tạo thành 5-methlcytosine, gắn nhóm methyl (CH3) vào phân tử cacbon số 5 của cytosine thuộc các cặp dinucleotide CpG (Moore, 2013) Sự methyl hóa là biến đổi Epigenetics, xảy ra ở động vật có vú (Kulis et al., 2010)
Sự methyl hóa DNA đóng vai trò bất hoạt nhiễm sắc thể X, in dấu gen và hình thành khối u (AKM, Maruf Raza, 2016) Sự methyl hóa DNA bất thường dẫn đến sự hình thành và diễn tiến của cơ chế sinh ung thư (Crider et al., 2012; MKA et al., 2016)
Sự methyl hóa DNA vượt mức tại vùng khởi đầu của gen ức chế khối u, làm ức chế quá trình phiên mã và giảm tăng sinh tế bào (Wajed et al., 2001) Sự methyl hóa DNA dưới mức làm ức chế im lặng trong phiên mã, kiểm soát hoạt động của protooncogenes và tăng khả năng tăng sinh tế bào (Wajed et al., 2001) Do đó, sự methy hóa DNA ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát triển và hoạt động của tế bào (Kulis et al., 2010)
3 Đảo CpG hiện diện trên vùng trình tự promoter thuộc các gen chức năng (gen giữ nhà: “housekeeping gene”), có kích thước khoảng 100-1000bp với tỷ lệ GC lớn hơn 50% (Goldman et al., 2001; Virani et al., 2012) Cơ chế methyl hóa DNA diễn ra trên các đảo CpG liên quan đến sự điều hòa biểu hiện gen, im lặng gen, in dấu gen, bất hoạt nhiễm sắc thể X và sự hình thành khối u (Takai et al, 2002) Tính chất methyl hóa vượt mức trên đảo CpG thuộc vùng promoter các gen kiểm soát cơ chế sinh ung (tumour suppresor gen) là dấu chứng sinh học đối với các bệnh lý ung thư.
Dấu chứng sinh học
Dấu chứng sinh học là các phân tử sinh học: protein, acid nucleic (DNA hoặc RNA), polysaccharide hiện diện trong máu, các chất dịch, hoặc các mô, biểu thị đặc trưng tình trạng bình thường hay bất bình thường của cơ thể con người (National Cencar Institute, 2016) Một số dấu chứng sinh học tiềm năng được ứng dụng trong tiên lượng, chẩn đoán và khảo sát đáp ứng điều trị đối với một số bệnh lý ở người: CA-
125 (Cancer Antigen-125) đối với ung thư buồng trứng; CEA (Carcinoembryonic antigen) trong ung thư đại trực tràng và CA 15-3 (Cancer Antigen 15-3) trong ung thư vú (Paczesny et al, 2015; MJ et al., 2017).
Ung thư vú
Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), ung thư vú là bệnh lý gây tử vong cao thứ hai ở phụ nữ, với khoảng 2,1 triệu ca mắc mới và 670.000 trường hợp tử vong trên toàn cầu mỗi năm Tại Việt Nam, năm 2018 ghi nhận khoảng 15.229 ca ung thư vú mới được phát hiện.
Ung thư vú là dạng ung thư biểu mô, chủ yếu liên quan đến vùng nội mô của tuyến sữa hoặc tiểu thùy và ống dẫn sữa (Ataollahi et al., 2015) Ung thư vú là một bệnh đa giai đoạn: I, IIA, IIB, III, và IV (Ataollahi et al., 2015), xảy ra ở phần lớn phụ nữ mãn kinh biểu hiện cao trên thụ thể estrogen (ER) Thụ thể estrogen âm tính với ung thư biểu mô tuyến vú, đóng vai chính trong phát triển ung thư vú theo hướng (1) các chất chuyển hóa ER có thể làm biến đổi hoặc tạo ra các gốc tự do gây đột biến DNA, (2)
Yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGF) và thụ thể estrogen (ER) tăng sinh trong tế bào tiền ung thư và ung thư Các yếu tố gây ra ung thư vú bao gồm: nồng độ hormone cao, chế độ ăn uống không cân bằng dinh dưỡng.
Tình hình nghiên cứu tính chất methyl hóa trên gen APC và DAPK đối với bệnh
Hiện nay, trên thế giới có nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng phương pháp MSP (Methylation-specific PCR) phân tích tính chất methyl hóa trên gen APC hoặc DAPK trên bộ mẫu ung thư vú Các kết quả nghiên cứu này bộc lộ tần số methyl hóa trên gen APC hoặc DAPK dao động, biến thiên đối với bộ mẫu ung thư vú thuộc quần thể người bệnh khác nhau
Tiêu biểu là công trình nghiên cứu của Swellam và cộng sự (2015) dựa vào phương pháp MSP, xác định tần số methyl hóa gen APC là 93,38% trên tổng số 121 mẫu bệnh phẩm ung thư vú và 0% trên tổng số 66 mẫu lành ở Ai Cập Theo công trình nghiên cứu của Begam và cộng sự (2018) sử dụng phương pháp MSP (Methylation-specific PCR) xác định tần số methyl hóa gen APC là 38% trên tổng số 50 mẫu bệnh phẩm ung thư vú và 0% trên tổng số 45 mẫu lành ở Ấn Độ
Tần số methyl hóa gen DAPK có sự khác biệt giữa các khu vực Nghiên cứu của Xhu và cộng sự (2017) tại Trung Quốc ghi nhận tần số methyl hóa là 53,33% trên 15 mẫu bệnh phẩm ung thư vú Trong khi đó, ở Ấn Độ, nghiên cứu của Yadav và cộng sự (2018) báo cáo tần số methyl hóa gen DAPK là 55% trên 60 mẫu bệnh phẩm ung thư.
Phương pháp phân tích tính chất methyl hóa DNA
− Phương pháp Methylation-specific PCR (MSP) và Nested MSP
Phương pháp phản ứng chuỗi polymerase (PCR) đặc hiệu metyl hóa (MSP) là một kỹ thuật có độ nhạy và độ đặc hiệu cao để phát hiện metyl hóa tại các vị trí đảo CpG cụ thể (Herman et al., 1996) MSP sử dụng phương pháp xử lý bisulfit và phản ứng PCR với hai cặp mồi đặc hiệu: một cặp nhắm vào alen đã metyl hóa và cặp còn lại nhắm vào alen chưa metyl hóa (Herman et al., 1996).
Nested - MSP là phương pháp phân tích tính chất methyl hóa DNA trên vùng gen mục tiêu, được mô tả bởi Plamisamo và cộng sự vào năm 2000 Nested - MSP được thực hiện dựa trên sự cải tiến của phương pháp MSP, gồm có:
- Phản ứng PCR thứ nhất: sử dụng một cặp mồi khuếch đại phổ quát trình tự DNA mục tiêu ở trạng thái allele bị methyl hóa và trạng thái allele không bị methyl hóa Sản phẩm PCR này là DNA bản mẫu cho hai phản ứng PCR riêng biệt tiếp theo
- Phản ứng PCR thứ hai và thứ ba lần lượt sử dụng một cặp mồi đặc hiệu với trạng thái allele bị methyl hóa và cặp mồi còn lại đặc hiệu với trạng thái allele không methyl hóa, theo đúng nguyên tắc của phản ứng MSP
− Phương pháp Bisulfite sequencing PCR
Bisulfite sequencing-PCR (BSP) là phương pháp do Frommer và cộng sự mô tả vào năm 1992 BSP được thực hiện dựa vào phản ứng PCR kết hợp giải trình tự, phản ứng PCR khuếch đại trình tự DNA mục tiêu đã được biến đổi bisulfite bằng một cặp mồi có tính phổ quát cho trạng thái allele bị methyl hóa và trạng thái allele không bị methyl hóa (Frommer et al., 1992).
Phương pháp phân tích tổng hợp (Meta-analysis)
Meta-analysis là phương pháp thống kê, cho phép đánh giá ước số chính xác dựa vào bộ dữ liệu gồm kết quả nghiên cứu độc lập, khác nhau (Crombie et al., 2009; Lee et al., 2018) Phân tích tổng hợp thường được sử dụng trong những công trình nghiên cứu thực chứng, nhằm tìm hiểu/khảo sát/đánh giá các công cụ chẩn đoán hoặc pháp đồ điều trị lâm sàng hoặc các yếu tố tác động đến tình trạng bệnh lý, (Crombie et al., 2009) Phân tích tổng hợp bao gồm giai đoạn thu thập tài liệu có hệ thống (NCBI, cơ sở dữ liệu Google scholar); trích suất dữ liệu và phân tích (Rodseth et al., 2016)
❖ Phân tích tổng hợp (Meta-analysis) gồm các bước tiến hành cơ bản:
- Đặt ra câu hỏi và từ khóa giúp giải quyết các vấn đề phân tích tổng hợp (dựa theo PICO_Participant-Intervention-Comparator-Outcomes)
- Tìm kiếm công trình nghiên cứu dựa trên các cơ sở dữ liệu: PubMed/Medline, Google Scholar,…
- Đọc tóm tắt và tiêu đề của các công trình nghiên cứu
- Chọn lọc công trình nghiên cứu và trích dẫn dữ liệu dựa trên phần nội dung công trình nghiên cứu
- Xác định tính chất bất đồng (I 2 -Index of heterogeneity) trong bộ dữ liệu
Đánh giá biến số phụ thuộc thông qua phương pháp thống kê sử dụng chỉ số tỷ suất chênh Odds Ratio (OR) và mô hình ảnh hưởng ngẫu nhiên "Random Effects Model" hoặc mô hình ảnh hưởng bất biến "Fixed Effects Model" Kết quả được thể hiện dạng đồ thị "Forest Plot".
- Xác định tính thiên vị trong đồ thị “Funnel plot”
- Tiến hành phân chia nhóm phân tích và kiểm tra kết quả phân tích tổng hợp
VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu
Chúng tôi sử sụng một số phầm mềm và các công cụ trực tuyến:
- NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
- Genecard (http://www.genecards.org/)
- Google (https://www.google.com.vn/)
- BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)
- MethPrimer (http://www urogene.org/methprimer/)
Phương pháp nghiên cứu
II.2.1 Khai thác dữ liệu và phân tích tổng hợp
Chúng tôi tập trung thực hiện các nội dung nghiên cứu như sau:
PubMed or PubMed Central (National Center for Biotechnology Information–NCBI) and Google are databases that can be used to search for and gather scientific data (scientific articles) using keywords such as APC, DAPK, DNA methylation, and breast cancer.
Thực hiện đầy đủ các bước cơ bản trong quy trình phân tích tổng hợp đã được trình bày ở nội dung 1.7 Trong bước trích xuất dữ liệu, tập trung vào các tiêu chí khai thác thông tin về tính chất methyl hóa trên vùng promoter gen mục tiêu APC.
Gen DAPK và APC có vai trò quan trọng trong ung thư vú Các phương pháp sinh học phân tử như MSP, MS-HRM có thể xác định mức độ methyl hóa của gen DAPK, APC trên nhóm bệnh nhân ung thư vú cụ thể.
- Gen mục tiêu: APC, DAPK
- Số lượng mẫu bệnh phẩm; Số lượng mẫu đối chứng
- Số mẫu bệnh phẩm hoặc mẫu đối chứng xuất hiện tính chất methyl hóa trên gen APC, DAPK
- Tần số xuất hiện tính chất methyl hóa trên gen mục tiêu APC, DAPK trên bộ mẫu bệnh phẩm hoặc bộ mẫu đối chứng
- Chỉ số: chỉ số độc hại (Hazard ratio – HR), tỷ suất chênh (Odds ratio – OR),… với khoảng tin cậy 95% (Confidence intervals – Cis)
- Phương pháp nghiên cứu: MSP, MS-HRM,…
- Thông tin mẫu bệnh phẩm: loại mẫu (blood, tissue,…)
- Thông tin bệnh nhân: độ tuổi, quốc tịch – chủng tộc
- Đặc điểm bệnh học ung thư vú: giai đoạn bệnh (stage), phân độ mô học
(grade), kích thước khối u (tumor size),…
- Chỉ số hóa mô miễn dịch: ER, PR, HER/NEU2,…
II.2.2 Khảo sát trên máy tính
Chúng tôi tập trung thu thập trình tự mục tiêu thuộc gen APC (Adenomatous Polyposis Coli) và DAPK (Death-Associated Protein Kinase) gồm có: vùng promoter, vị trí các đảo CpG, dựa trên nguồn dữ liệu Genbank (NCBI) và GeneCards Đồng thời, chúng tôi dựa vào một số công cụ tin sinh học (nội dung II.1) để kiểm tra độ đặc hiệu, vị trí hoạt động, thông số vật lý của các cặp mồi phù hợp với phương pháp MSP hoặc Nested MSP trong quy trình phân tích tính chất methyl hóa trên vùng promoter gen APC, DAPK đối với bệnh ung thư vú
II.2.3 Khảo sát thực nghiệm
− Tách chiết DNA bộ gen người Để thu nhận DNA bộ gen người từ các mẫu bệnh phẩm ung thư vú hoặc mẫu lành, đều ở dạng mẫu mô đúc paraffin, nội dung chuyên đề khóa luận áp dụng phương pháp sử dụng xylen để loại bỏ paraffin và phương pháp phenol/chloroform (pH = 8) kết hợp việc sử dụng dung dịch ly giải tế bào (chất tẩy mạnh: SDS kết hợp với proteinase K) để tách chiết DNA bộ gen người từ các mẫu mô.
- Máy ly tâm lạnh; Máy vortex
- Xylene; Dung dịch ly giải: SDS 10%, NaCl 5M, Tris HCl 10mM (pH=8,0), EDTA 1M (pH=8), Proteinase K; Phenol bão hòa, Chloroform; Dung dịch Amonium acetate 5M; Ethanol tuyệt đối (99%), Ethanol 70%, Ethanol 50%
- Cắt nhỏ mẫu bệnh phẩm cho vào eppendof loại 1,5 ml
- Bổ sung 1 ml dung dịch xylen, lắc đều sau đó ly tâm 13.000 vòng/phút trong 2 phút Sau đó thu cặn, bỏ dịch nổi
- Bổ sung 1 ml dung dịch ethanol tuyệt đối, lắc đều sau đó ly tâm 13.000 vòng/phút trong 2 phút Sau đó thu cặn, bỏ dịch nổi
- Bổ sung 1 ml dung dịch ethanol 70%, lắc đều sau đó ly tâm 13.000 vòng/phút trong
2 phút Sau đó thu cặn, bỏ dịch nổi
- Bổ sung 1 ml dung dịch ethanol 50%, lắc đều sau đó ly tâm 13.000 vòng/phút trong
2 phút Sau đó thu cặn, bỏ dịch nổi Để khô trong 30 phút
- Bổ sung một thể tích phù hợp hỗn hợp dung dịch ly giải tế bào (NaCl 5M, Tris-HCl 1M, pH=8; dung dịch đệm EDTA 0,5M, pH=8; SDS 10%, và nước cất hai lần) Bổ sung 10 àl proteinase K (nồng độ 20 ng/ml) Trộn đều hỗn hợp ủ 56℃ trong 24-48 giờ
- Bổ sung một thể tích (l) phù hợp của dung dịch phenol:chloroform (tỷ lệ 1:1), trộn đều Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 3 phút Chuyển phần dịch nổi phíatrên sang ống eppendorf sạch
- Bổ sung một luợng dung dịch chloroform với thể tích tương đương với thể tích dịch nổi thu đuợc, trộn nhẹ Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 3 phút Chuyển phần dịch nổi phía trên sangống eppendorf sạch
- Bổ sung một luợng ammonium acetate (NH4OAc) 5M và một luợng ethanol tuyệt đối theo tỷ lệ 0,2: 2,5 thể tích so với thể tích dịch nổi
- Trộn đều Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4℃ Loại bỏ phần dịch nổi, thu tủa
- Bổ sung một thể tích ethanol 70% trữ lạnh để rửa sạch kết tủa Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút ở 4℃ Thu tủa, loại bỏ dịch nổi (dung dịch ethanol) Để khô trong 30 phút
- Hũa tan kết tủa DNA trong 30-50 àl nuớc cất hai lần vụ trựng Bảo quản DNA ở 4℃ đến -20℃
❖ Kiểm tra chất lượng DNA bộ gen bằng phương pháp đo quang phổ
Để xác định nồng độ, hàm lượng và độ tinh sạch của DNA trong bộ gen sau khi tách chiết, phương pháp đo mật độ quang học ở bước sóng 260 nm và 280 nm được ứng dụng Lý do là vì DNA hấp thụ mạnh ánh sáng ở bước sóng 260 nm, trong khi protein hấp thụ mạnh ánh sáng ở bước sóng 280 nm.
- Nồng độ DNA được xác định dựa vào độ hấp thụ A260 (Absorbance (OD260)) A260 OD = 50 àg/ml DNA sợi đụi (Gallagher., 2011)
Cụng thức xỏc định nồng độ DNA: C (àg/ml) = 50 x A260 x d
Chú thích: A260: độ hấp thụ của dung dịch DNA ở bước sóng 260 nm; A280: độ hấp thụ cực đại của protein ở bước sóng 280 nm; d: độ pha loãng
- Độ tinh sạch của DNA được đánh giá thông qua tỷ lệ A260/A280, dung dịch DNA sạch, không nhiễm protein thường có tỷ lệ A260/A280 = 1,8-2
- Máy đo quang phổ và cuvette;
❖ Biến đổi DNA bằng sodium bisulfite (Bộ kit EZ DNA Methylation-Gold)
To prepare Conversion Reagent EZ1, add 900 µl of double distilled water, 300 µl of EZ2 solution, and 50 µl of EZ3 solution to a CT Conversion Reagent tube Mix thoroughly for 10 minutes.
- Bổ sung 130 àl dung dịch CT Conversion Reagent (EZ1) vào 20 àl dung dịch DNA đóhỳt vào eppendorf 250 àl, trộn đều Sau đú đua vào chu trỡnh luõn nhiệt nhu sau: 98℃: 10phút, 64℃: 150 phút, 4℃: ∞
Cho 600 µl EZ4 vào cốc Zymo-spin™IC (C1), sau đó thêm dung dịch DNA (đã chạy chu trình nhiệt) vào C1, trộn đều Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 30 giây ở nhiệt độ phòng Sau đó, đổ bỏ lớp dịch trên.
- Bổ sung 100 àl EZ5 vào cột C1, ly tõm 13.000 vũng/phỳt trong 30 giõy, ở nhiệt độ phòng Đổ bỏ dung dịch sau ly tâm
- Bổ sung 200 àl EZ6 vào cột C1, để nhiệt độ phũng 15-20 phỳt, ly tõm 13.000 vòng/phút trong 30 giây Đổ bỏ dung dịch sau ly tâm
- Bổ sung 200 àl EZ5 vào cột C1, ly tõm 13.000 vũng/phỳt trong 30 giõy, ở nhiệt độ phòng (lặp lại 2 lần)
- Đặt cột C1 vào Eppendorf 1,5 ml, thờm 10 àl EZ7, ly tõm 13.000 vũng/phỳt trong
30 giây, ở nhiệt độ phòng Thu dung dịch DNA đã đuợc biến đổi bisulfite, bảo quản ở -20℃
❖ Phản ứng MSP và Nested-MSP
Phương pháp Nested-MSP, gồm ba phản ứng PCR riêng biệt:
Phản ứng PCR đầu tiên khuếch đại toàn bộ vùng trình tự mục tiêu bao gồm vùng promoter của gen APC hoặc DAPK, bao phủ các vị trí "điểm nóng" Sản phẩm của PCR này đóng vai trò là khuôn DNA cho hai phản ứng PCR riêng biệt tiếp theo.
• Phản ứng PCR thứ hai sử dụng một cặp mồi đặc hiệu cho trạng thái DNA bị methyl hóa (Methylation: M);
• Phản ứng PCR thứ ba sử dụng một cặp mồi đặc hiệu cho trạng thái DNA không bị methyl hóa (Unmethylation: U);
- Thành phần phản ứng PCR: Master mix 2X (Bioline); Các cặp mồi; Nước cất hai lần, mẫu DNA
Tất cả phản ứng PCR trong quy trình Nested MSP được thực hiện với tổng thể tích 50 μl Thành phần phản ứng PCR và chương trình luân nhiệt được thể hiện trong Bảng II.1 và hình II.2
Bảng II.1 Thành phần phản ứng PCR trong quy trình Nested MSP
Chú thích: x: thể tích DNA phù hợp, yP-(25+0,5+0,5+x)
Hình II.1 Chu trình luân nhiệt cho phản ứng Nested-MSP
Chú thích: Ta (Temperature annealing): nhiệt độ lai tối ưu với từng cặp mồi trong quy trình Nested-
MSP; x: số chu trình luân nhiệt; NC (Number of cycle): số chu kì
KẾT QỦA-THẢO LUẬN
Khai thác dữ liệu
Hình III.1 Quy trình chọn lọc bài báo trong phân tích tổng hợp trên gen APC và DAPK
Tổng số công bố khoa học
Bộ dữ liệu gen APC 43 11 32 9 23 4 19 3 16
Bộ dữ liệu gen DAPK 35 7 28 8 20 5 15 1 14
Dựa vào các cơ sở dữ liệu của National Center for Biotechnology Information – NCBI (PubMed, PubMed Central,…), Google scholar, Google,…và sử dụng các từ khóa:
DAPK, APC, DNA methylation, breast cancer,…được cập nhật đến tháng 3 năm 2019, chúng tôi chọn lọc được bộ dữ liệu công trình nghiên cứu liên quan đến tính chất methyl hóa vùng promoter gen APC, DAPK (tính chất methyl hóa gen APC, DAPK):
− Bộ dữ liệu gồm 16 công bố khoa học ca chứng (Case control) về tính chất methyl hóa gen APC trên bệnh ung thư vú (bảng III.1);
− Bộ dữ liệu 14 công bố khoa học ca chứng (Case control) về tính chất methyl hóa gen DAPK trên bệnh ung thư vú (bảng III.3);
Trên hình III.1 mô tả quy trình chọn lọc các công bố khoa học để đưa vào phân tích tổng hợp, dựa theo các tiêu chí trích xuất dữ liệu Các phương pháp phân tích tổng hợp được thực hiện theo mô hình phân tích ảnh hưởng cố định hay bất biến (Fixed, F) hoặc mô hình phân tích ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random, R) với khoảng tin cậy 95%CI (CI: > 1: và/hoặc xấp xỉ 1), dựa vào tính chất đồng nhất hoặc bất đồng nhất của bộ dữ liệu.
III.2 Kết quả phân tích tổng hợp gen APC
Trong bộ dữ liệu gồm 16 nghiên cứu khoa học ca chứng về tính chất methyl hóa trên gen APC, tổng số mẫu ung thư vú là 998 mẫu (616 mẫu mô, 382 mẫu máu) và tổng số mẫu lành 642 mẫu (159 mẫu máu, 483 mẫu mô), thông tin chi tiết thể hiện ở bảng III.1
Từ đó, chúng tôi chọn lọc bộ dữ liệu (13 công bố khoa học) đưa vào phân tích chỉ số
OR, để phản ánh độ chênh của tính chất methyl hóa trên gen APC xuất hiện ở bộ mẫu bệnh phẩm ung thư vú và bộ mẫu lành và chỉ số RR phản ánh nguy cơ mắc ung thư vú đối với các trường hợp có sự xuất hiện tính chất methyl hóa trên gen APC
Bộ dữ liệu đưa vào phân tích chỉ số OR tổng số và RR tổng số thể hiện tính bất đồng nhất về tần số tính chất methyl hóa trên gen APC lần lượt với giá trị I 2 = 80,99% và I 2 84,66% Từ đó, việc phân tích chỉ số OR và RR theo mô hình phân tích ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random effects model, R) với khoảng tin cậy 95% CI, kết quả được trình bày trong hình III.2 và III.3
(Tác giả, năm) Quốc Gia Chủng tộc Phương pháp
Mẫu bệnh ung thư vú Mẫu lành
Tổng mẫu Mẫu methyl hóa
Begam 2018 Ấn Độ Châu Á MSP Mô 19 50 0 45
Swellam, 2015 Ai Cập Châu Phi MSP Máu 113 121 0 66
Pang, 2014 Úc Châu Mỹ MS-HRM Mô 39 80 0 15
Jung, 2013 Hàn Quốc Châu Á MS-MLPA Mô 19 60 0 60
Truong, 2011 Việt Nam Châu Á MSP Mô 28 32 30 32
Jing, 2010 Trung Quốc Châu Á MSP Máu 14 50 0 50
Brooks, 2010 Hoa Kỳ Châu Mỹ QMSP Mô 1 49 4 96
Matuschek, 2010 Đức Châu Âu QMSP Máu 25 85 2 22
Auwera, 2010 Ai Cập Châu Mỹ QMSP Mô 36 56 26 56
Ahmed, 2010 Ai Cập Châu Âu MSP Máu 23 26 1 12
Auwere, 2009 Bỉ Châu Âu QMSP Máu 60 100 0 9
Zhen, 2007 Trung Quốc Châu Á MSP Mô 28 76 0 76
Hoque, 2006 Senegal Châu Phi QMSP Mô 14 93 5 38
Dulaimi, 2004 Hoa Kỳ Châu Mỹ MSP Mô 15 34 14 34
Muller, 2003 Úc Châu Mỹ MSP Mô 14 36 0 10
Jin, 2001 Nhật Bản Châu Á MSP Mô 18 50 0 21
III.2.1 Chỉ số OR và RR tổng số phản ánh tính chất methyl hóa trên gen APC trong bộ dữ liệu ca chứng về ung thư vú
Trên bộ dữ liệu gồm 13 nghiên cứu khoa học ca chứng, chỉ số OR tổng số phản ánh độ chênh của tính chất methyl hóa trên gen APC xuất hiện ở bộ mẫu bệnh phẩm ung thư vú và bộ mẫu lành với giá trị OR = 21,357 (95%CI = 5,641 – 80,806; P
