Trong giới hạn nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát sự biểu hiện bất thường của miRNA-141 bằng phương pháp Stem-loop realtime PCR trên ung thư vòm họng, để có thêm cơ sở khoa học về việc k
GIỚI THIỆU
Tính cấp thiết của đề tài
MicroRNA (miRNA) là các phân tử RNA nhỏ, không mã hóa thông tin di truyền Trong tế bào động vật và tế bào người, miRNA kiểm soát sự biểu hiện của gen mục tiêu bằng cách ức chế dịch mã hoặc làm suy giảm các mRNA mục tiêu thông qua liên kết với 3′UTR của mRNA mục tiêu Do đó, microRNA vai trò tham gia các cơ chế điều hòa sự biểu hiện gen ở cấp độ phiên mã, điều hòa sự hoạt động của các gen liên quan đến các chức năng sinh học nội bào phát triển, biệt hóa, tăng sinh và sự chết theo chương trình Ở động vật có vú, miRNA được phiên mã bởi RNA polymerase II từ các intron của gen mã hóa protein dưới dạng bản phiên mã sơ cấp (primary transcript named primary miRNA, pri-miRNA) ở thể “đơn cistronic” hoặc “đa cistronic”, khi đó được gọi là miRNA sơ cấp (pri-miRNA) ở đầu 5' và có gắn vùng đầu (Cap) 5'- methyl-7-guanosine và ở đầu 3’ có đuôi poly (A) Sau khi phiên mã, pri-miRNA-
141 trải qua ít nhất ba lần biến đổi trước khi trở thành dạng miRNA trưởng thành Sau đó, miRNA-141 trưởng thành liên kết với protein argonaute để tạo thành phức hợp miRNA-protein được gọi là phức hợp im lặng do RNA gây ra (RISC), miRNP hoặc phức hợp enzyme RNAi (can thiệp RNA) và có khả năng tác động đến sự biểu hiện gen liên quan đến con đường sinh ung thư (Fariyike et al., 2019) Bên cạnh các miRNA khác, miRNA-141 được nhận thấy là có sự biểu hiện tăng trong nhiều loại ung thư, trong đó có ung thư vòm họng
Tại nước ta, ung thư vòm họng là loại u ác tính có số ca mắc nhiều nhất trong các loại ung thư vùng hầu họng Số liệu năm 2020 cho thấy tỷ lệ phần trăm mắc bệnh này là 3,3% và tỷ lệ tử vong là 3,0% Các con số trên không ngừng lại ở đó mà nó có xu hướng không ngừng gia tăng và trở thành một trong những nguy cơ tiềm ẩn đe dọa đến sức khỏe cộng đồng Trong các nghiên cứu trước đây, các nhà nghiên cứu đã đưa ra nhiều nguyên nhân gây ra ung thư vòm họng Các nguyên nhân được chứng minh: sự xâm nhiễm của Epstein-Barr Virus (EBV), các yếu tố liên quan đến vật liệu di truyền (như DNA người, các gene và các phân tử tham gia vào điều hòa con đường tín hiệu liên quan đến ung thư vòm họng) và lối sống, tập quán ăn uống
Một trong những yếu tố tham gia đến quá trình di truyền bên trong cơ thể là sự vận hành và chuyển biến của các phân tử miRNAs Bên cạnh đó còn có sự biểu hiện quá mức của một số miRNA, chẳng hạn như miR-141, miR-155, v.v…, dẫn đến ung thư đã được các nhà khoa học trên thế giới chứng minh Do đó, phân tử miRNAs được coi như là dấu chứng sinh học (biomarker) (Thuan et al.,2018) Các phương pháp định lượng bằng Realtime-PCR và các biến thể của Realtime-PCR, chẳng hạn Stem-loop realtime PCR (Chen et al., 2009) đã được nghiên cứu và phát triển trở thành một phương pháp được sử dụng trong việc tiên lượng, phát hiện sự biểu hiện bất thường của các miRNAs mục tiêu Chính vì vậy, phát hiện sớm sẽ mở ra nhiều cơ hội sống sót cho các bệnh nhân ung thư ung thư vòm họng
Dấu chứng sinh học (biomarkers) là các phân tử biểu hiện một dữ kiện sinh học để đo lường, đánh giá một quá trình sinh lý, bệnh lý Đây có thể là các chỉ số sinh hóa, các yếu tố liên quan đến di truyền (DNA, gen, miRNA…), protein Trong số các dấu chứng sinh học về di truyền, miRNA là một dấu chứng đang được các nhà khoa học quan tâm Có nhiều loại miRNA liên quan đến ung thư, trong đó có ung thư vòm họng Trong phạm vi nghiên cứu của bài này, chúng tôi khảo sát miRNA-141 Việc chọn lựa phân tử mục tiêu làm dấu chứng sinh học, và hoặc đưa vào nghiên cứu để đánh giá là dấu chứng sinh học tiềm năng trên một loại bệnh ở người, cần phải đảm bảo một số tiêu chí: 1) khả năng tiếp cận trong nghiên cứu và các quy trình xét nghiệm phân tử trên phân tử mục tiêu, ví dụ: cần có thông tin khoa học về vai trò, chức năng của miRNA mục tiêu trong các hoạt động sinh học nội bào ở trạng thái bình thường hoặc trạng thái bất thường-sinh ung, sự tương tác của miRNA trên gen, vùng 5’-UTR,…., 2) phân tử mục tiêu có tính đặc hiệu cao và độ nhạy cao, với biểu hiện đặc trưng gắn liền với trạng thái bất thường hoặc khởi phát và diễn tiến bệnh, diễn ra cơ chế sinh ung, và cần được nhận diện sớm trước khi có những thay đổi và tổn thương thật sự ở cấp độ mô bệnh học, 3) sự bảo tồn và sự biểu hiện thường trực trong tế bào người của phân tử mục tiêu,…., 4) có thể thu nhận và phát hiện ở mô ngoại vi, ví dụ: phát hiện từ mẫu máu hoặc thể dịch, có thể áp dụng phương pháp xâm lấn hoặ ckhong xâm lấn, 5) sự hiểu hiện ổn định trong
4 hoặc trên bề mặt tế bào, cấu trúc mô, 6) dấu chứng sinh học tiềm năng cho phép dự đoán, xác định vị trí tổn thương hoặc khởi phát sinh ung, 7) có thể đánh giá được mức độ bảo tồn hoặc tiến hóa của phân tử mục tiêu làm dấu chứng sinh học tiến hóa của mục tiêu miRNA trên bộ gen người, trình tự cDNA của miRNA càng được bảo tồn thì khả năng nó tương ứng với các trình tự RNA chức năng, được phiên mã càng cao (Condrat et al., 2020)
Sự biểu hiện quá mức của một số miRNA đã được biết đến là nhân tố gây ung thư (Oncogene), như là UTVH Bên cạnh sự biểu hiện bất thường của một số miRNA trong ung thư nói chung và UTVH nói riêng, như là miR-18a và miR-18b,
… trong đó có miRNA-141 Sự biểu hiện quá mức của miRNA-141 trong UTVH có liên quan đến việc tăng sự phát triển, di cư và xâm lấn của tế bào, cũng như làm mất khả năng điều hòa chu kỳ tế bào và giảm quá trình chết theo chương trình MiRNA-
141 có vai trò điều hòa giảm các gen mục tiêu giả định phosphatase và gen tương đồng tenin (PTEN), protein liên quan đến ubiquitin 1 (UBAP1) và bromodomain chứa 3 (BRD3) trong NPC Ngoài ra, sự biểu hiện của miR-141 được điều hòa bởi các gen gây ung thư c-Myc, liên quan đến cơ chế sinh ung thư (Spence et al., 2006)
Từ đó, trong phạm vi nghiên cứu đề tài này, chúng tôi khảo sát sự biểu hiện bất thường (tăng biểu hiện) miRNA-141 ở người, đặc biệt là các người bệnh UTVH
Tuy nhiên, nền khoa học nước ta chưa có nhiều nghiên cứu về các tính chất và sự biểu hiện của các miRNAs và ung thư nói chung, và miRNA-141 nói riêng trên người mắc ung thư vòm họng ở Việt Nam Do đó, đề tài “Khảo sát tính chất biểu hiện bất thường của miRNA-141 bằng phương pháp Stem-loop realtime PCR ” được thực hiện, nhằm đánh giá được sự biểu hiện bất thường (tăng bất thường) của miRNA-141 bằng kỹ thuật mới là Stem-loop realtime PCR, và trong phạm vi nghiên cứu của một luận văn thạc sĩ, nghiên cứu sẽ tập trung trên ung thư vòm họng
Mục tiêu nghiên cứu
Khảo sát sự biểu hiện của miRNA-141 bằng phương pháp Stem-loop realtime PCR, tập trung trên ung thư vòm họng với nhóm mẫu lành và nhóm mẫu của bệnh nhân
Phân tích tổng hợp nhằm xác định tính chất biểu hiện của miRNAs ở bệnh ung thư vòm họng dựa trên các công trình nghiên cứu trên thế giới và trong nước
Khảo sát sự biểu hiện của miRNA-141 ở mẫu sinh thiết khối u vòm họng và mẫu dịch phết lành người Việt Nam bằng kỹ thuật realtime PCR có sử dụng mồi Stem-loop 141
So sánh mức độ biểu hiện của miRNA-141 ở mẫu sinh thiết khối u vòm họng và mẫu lành thu nhận từ người Việt Nam.
Giả thuyết nghiên cứu
Tính chất biểu hiện của miRNA-141 trong mô tế bào ung thư có sự khác nhau như thế nào so với tế bào bình thường?
Sự biểu hiện bất thường này có được ứng dụng như là một dấu hiệu sinh học chuyên biệt ở bệnh nhân ung thư vòm họng tại Việt Nam hay không?
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: Phân tử miRNA-141 và sự biểu hiện miRNA-141 trên mô lành và mô tế bào ung thư
Phạm vi nghiên cứu: Bệnh ung thư vòm họng
Trong nghiên cứu này, bộ mẫu bao gồm: bộ mẫu sinh thiết mô vòm họng cho mẫu bệnh và bộ mẫu phết họng cho mẫu lành (không xâm lấn) từ những người đến khám tại Bệnh Viện Chợ Rẫy, Thành phố Hồ Chí Minh Toàn bộ bộ mẫu được sử dụng cho bài nghiên cứu này đều lấy lại từ bộ mẫu của các nghiên cứu trước đây (đã
6 được thông qua và cho phép của Hội Đồng Y Đức của bệnh viện Chợ Rẫy TPHCM: 516/BVCR-HDDD).
Phương pháp nghiên cứu
Cỡ mẫu nghiên cứu
Cỡ mẫu nghiên cứu xác định theo công thức ước tính hệ số tương quan
Trong đó: Z(1-α)/2 là giá trị tới hạn mức (1-α)/2 theo phân phối chuẩn tắc X~N (0;1), với α = 5% thì Z(1-α)/2=1,96 Sử dụng p = 0,57 dựa vào kết quả nghiên cứu trong đề tài luận án: Nghiên cứu một số tính chất phân tử của bệnh ung thư vòm họng ở người Việt Nam của tác giả Lao Đức Thuận (Lao, 2020) d: Độ chính xác mong muốn = 0.1 (10%) n: cỡ mẫu
Kết luận n = 37,6 do đó cỡ mẫu được chọn là ≥ 38 mẫu.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Kết quả từ bài luận văn này sẽ góp phần là một minh chứng khoa học và là tiền đề trong việc đẩy mạnh hơn nữa các kỹ thuật xét nghiệm chẩn đoán, nhằm tầm soát và điều trị nhằm tiêu diệt khối u trên bệnh nhân ung thư vòm họng tại Việt Nam dựa trên dấu ấn sinh học, điển hình là miRNA-141.
Kết cấu của luận văn
Danh mục hình và đồ thị
Danh mục từ viết tắt
Chương 2: Tổng quan tài liệu
Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Chương 4: Kết quả và biện luận
Chương 5: Kết luận và kiến nghị
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu
Chúng tôi đã được phép sử dụng bộ mẫu đã được thu nhận từ các nghiên cứu trước tại thành phố Hồ Chí Minh Bộ mẫu được khảo sát trong bài luận văn này có số lượng như sau: một bộ 50 mẫu sinh thiết mô vòm họng của người đã được xác định ung thư vòm họng và bộ 50 mẫu dịch phết làm đối chứng hay còn gọi là mẫu lành (mẫu dịch phết được lấy theo hướng không xâm lấn) của người được xác định không mắc ung thư vòm họng và tất cả nhóm người tham gia lấy mẫu trên đều đến khám tại Bệnh Viện Chợ Rẫy Sau khi được khám và được chỉ định thực hiện các xét nghiệm sàng lọc cũng như siêu âm chẩn đoán hình ảnh như: làm giải phẩu sinh thiết mẫu bệnh xác định type theo các tiêu chuẩn quốc tế (WHO), nội soi khoang mũi để phát hiện các loại tổn thương và hình dạng vết thương; kết quả CT scan, MRI, X-quang… nhằm xác định kích thước và sự xâm lấn của khối u, người bệnh được chẩn đoán và kết luận có mắc UTVH hay không
Bộ mẫu được kế thừa từ bộ mẫu của các nghiên cứu trước đây của cùng nhóm nghiên cứu của giảng viên hướng dẫn: TS Lao Đức Thuận ( Bộ mẫu thu nhận đã được thông qua và cho phép của Hội Đồng Y Đức của bệnh viện Chợ Rẫy TPHCM: 516/BVCR-HDDD)
1.2 Các công cụ, trang thiết bị và hoá chất
Pippette các loại Đầu tip các loại
Máy Vortex (Vortex ZX3, Velp Ý)
Máy ly tâm lạnh (Hettich Universal 320R, Đức)
Bộ dụng cụ điện di DNA (Biorad)
Bộ dụng cụ đọc kết quả điện di
Máy Realtime PCR (MyGo, Pro®)
Tủ thao tác sinh học
Máy đo quang phổ (Scanning UV/VIS, Smart Spec, BioRad)
Bộ hóa chất tách chiết RNA theo phương pháp phenol/chloroform và sử dụng TRIzol
SensiFAST™ cDNA Synthesis Kit (Bioline, BIO-65054)
Taqman®Pri-miRNA Assays (Applied Biosystems, 4427012) SensiFAST™ Sybr®No-ROX Kit (Bioline, BIO-98002)
TaqMan® Gene Expression Master Mix (ThermoFisher Scientific, 4369016) RiboLock RNase Inhibition (40 U/àL) (ThermoFisher Scientific, EO0381)
Khai thác dữ liệu - Phân tích: Tìm kiếm thông tin, thu thập số liệu từ các nghiên cứu khoa học, trích dẫn trước đây như:
NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
Pubmed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/.pubmed)
Phần mềm online: http://faculty.vassar.edu/lowry/odds2x2.html
1.3 Quy trình thực hiện khảo sát sự biểu hiện miRNA-141
Sơ đồ khảo sát giá trị biểu hiện của miRNA-141 và khuếch đại chứng nội U6 trên các mẫu:
(*) Các kết quả đánh giá biểu hiện miRNA-141 được lưu lại và xử lý số liệu thống kê bằng phần mềm MedCalc (Tỷ lệ biểu hiện, chỉ số Odds ratio-OR và
Phương pháp nghiên cứu
Tìm kiếm các bài báo bằng cách sử dụng các từ khóa chính hay các từ quan trọng như: “microRNA”, ‘microRNA-141’, “Nasopharyngeal carcinoma cancer”,
“Stem-loop”, “Real-Time PCR” trên các công cụ tìm kiếm và trên các cơ sở dữ liệu lớn như: NCBI (Pubmed, Pubmed Central, …), BioMed Central, Nature, Globocan…
2.2 Phương pháp khảo sát trình tự mồi
Mồi Stem-loop đặc hiệu miRNA-141: Cấu trúc, trình tự bộ mồi Stem-loop và trình tự mồi xuôi, mồi ngược đặc hiệu với miRNA-141 được sử dụng lại từ những nghiên cứu trước đây
Dựa trên cơ sở dữ liệu miRbase, trình tự miR-141 trưởng thành có mã số truy cập là MIMAT0004598, ID has-miR-141, có vị trí từ nt 59 – nt 80, trình tự là 5’- UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG – 3’, chiều dài 22 nts Quy trình phát hiện
26 miR-141 (trưởng thành) trên khối u vòm họng dựa trên trình tự hsa-miR-141 mà được sử dụng là trình tự tham chiếu để tiến hành thiết kế hệ thống mồi để khuếch đại, phát hiện miR-141 bao gồm: mồi thân cuộn riêng biệt với hsa- miR-141, mồi xuôi và mồi ngược đặc hiệu với mồi Stem-loop Trình tự mồi Stem-loop đặc hiệu với miR-141, mồi xuôi, mồi ngược chi tiết tại bảng 3.1
Bảng 3.1: Trình tự Stem-loop, mồi xuôi, mồi ngược được thiết kế (Thuy, 2019)
StL-miR-141 Stem-loop TCTACCCAGCATAGGTCACGCTTATGGAGCCTG
2.3 Phương pháp phần thực nghiệm
Chuẩn bị 50 mẫu bệnh và 50 mẫu lành và thực hiện như sau
Bước 1: Hút 1ml TRIzol cho mẫu có 50-100mg mô
Bước 2: Ủ 5 phút để phân ly hoàn toàn phức hợp nucleoprotein
Bước 3: Cho 0,2 ml chloroform, đậy nắp kín và lắc
Bước 4: Ly tâm ống 15 phút với 12.000 vòng (ly tâm lạnh) Sau ly tâm, hỗn hợp tách lớp
Bước 5: Chuyển pha nước chứa RNA phía trên qua ống khác
Bước 6: Cho 0,5ml isopropanol vào ống chứa pha nước
Bước 8: Ly tâm ống 10 phút với 12.000 vòng (ly tâm lạnh)
Bước 9: Hút bỏ dịch nổi, giữ lại phần tủa trắng đóng ở đáy ống
Bước 10: Cho 1ml ethanol 75% vào ống, lắc nhanh ống
Bước 11: Ly tâm ống 5 phút với 7500 vòng ở 4°C
Bước 12: Hút bỏ phần dung dịch nổi phía trên
Bước 13: Làm khô RNA tự nhiên khoảng 5-10 phút
Bước 14: Tỏi tạo huyền phự RNA bằng cỏch cho 20-50 àL nước RNase-free vào ống chứa RNA khô
Bước 15: Ủ ống trong bể nhiệt 55°C trong 10 phút
Bước 16: Thu nhận được dung dịch RNA, thực hiện các phản ứng tiếp theo Bảo quản mẫu ở nhiệt độ -20 0 C
2.3.2 Thực hiện phản ứng PCR chuyển đổi RNA sang cDNA:
2.3.2.1 Phản ứng RT-PCR và chuyển đổi RNA sang cDNA
Quy trình thực hiện với bộ SensiFAST™ cDNA Synthesis Kit:
Lấy các sinh phẩm đặt trên khay đá trong phòng xét nghiệm để các hóa chất ổn định trước khi tiến hành pha dung dịch hỗn hợp phản ứng (master mix)
Trộn nhẹ nhàng buffer 2X, các tuýp mồi, enzyme Ly tâm nhanh đảm bảo các hóa chất được kéo xuống đáy tuýp Trong lúc tiến hành trộn hỗn hợp luôn giữ ống eppendorf và các hóa chất trên đá
1) Chuẩn bị các dụng cụ và các ống tuýp sạch
2) Tính toán tổng số phản ứng (n) trong một lần pha hỗn hợp
3) Pha hỗn hợp phản ứng
Bảng 3.2: Thành phần master mix cho 1 phản ứng
Nước khụng chứa nuclease 9 àL
4) Sau khi cho các thành phần vào tuýp (eppendorf) 1,5ml, hút lên xuống nhẹ nhàng
5) Quay ly tâm nhanh 5 giây để kéo hỗn hợp dưới đáy ống, luôn đảm bảo lạnh
6) Sắp cỏc tuýp 0,2 trờn khay , chia 15 àl hỗn hợp vào mỗi tuýp
7) Cho 5àl nước khụng chứa nuclease vào giếng chứng õm (sao cho đủ 20àl), đậy nắp tuýp
8) Cho mỗi 5àl nucleic acid của mẫu vào từng tuýp theo thứ tự, đậy nắp từng tuýp ngay sau đó
9) Đặt các tuýp vào máy luân nhiệt PCR và sau đó phản ứng RT-PCR được thực hiện theo chu trình nhiệt ở bảng 3.3
Bảng 3.3: Chu trình nhiệt cho phản ứng RT – PCR
2.3.2.2 Pha phản ứng khuếch đại miRNA-141
Quy trình thực hiện với bộ SensiFAST™ Sybr®No-ROX Kit:
Các sinh phẩm đặt trên khay đá trong phòng xét nghiệm để các hóa chất ổn định trước khi tiến hành pha hỗn hợp phản ứng Trộn nhẹ nhàng buffer 2X, các tuýp mồi, enzyme Ly tâm nhanh đảm bảo các hóa chất được kéo xuống đáy tuýp Trong lúc tiến hành trộn hỗn hợp luôn giữ ống eppendorf và các hóa chất trên đá
1) Chuẩn bị các dụng cụ và các ống tuýp sạch
Tên phản ứng Nhiệt độ Thời gian
2) Tính toán tổng số phản ứng (n) trong một lần pha hỗn hợp
3) Pha hỗn hợp phản ứng
Bảng 3.4: Thành phần master mix cho 1 phản ứng
Nước khụng chứa nuclease 9 àL
Stem-loop (Stl-miRNA) 1 àL
1) Sau khi cho các thành phần vào tuýp 1,5ml, hút lên xuống nhẹ nhàng
2) Quay ly tâm nhanh 5 giây để kéo hỗn hợp dưới đáy ống, luôn đảm bảo lạnh
3) Sắp cỏc tuýp 0,2 trờn khay , chia 15 àl hỗn hợp vào mỗi tuýp
4) Cho 5àl nước (nuclease – free water) vào giếng chứng õm (sao cho đủ 20àl), đậy nắp tuýp
5) Cho mỗi 5àl nucleic acid của từng mẫu vào từng tuýp theo thứ tự, đậy nắp từng tuýp ngay sau đó
6) Cho các tuýp phản ứng (plate phản ứng) cho vào máy luân nhiệt PCR và sau đó phản ứng khuếch đại miRNA-141 được thực hiện theo chu trình nhiệt ở bảng 3.3
2.3.3 Phản ứng Real-time PCR
Quy trình thực hiện với bộ SensiFAST™ Sybr®No-ROX Kit:
Các sinh phẩm đặt trên khay đá trong phòng xét nghiệm để các hóa chất ổn định trước khi tiến hành pha hỗn hợp phản ứng Trộn nhẹ nhàng buffer 2X, các tuýp
30 mồi, enzyme Ly tâm nhanh đảm bảo các hóa chất được kéo xuống đáy tuýp Trong lúc tiến hành trộn hỗn hợp luôn giữ ống eppendorf và các hóa chất trên đá
1) Chuẩn bị các dụng cụ và các ống tuýp sạch
2) Tính toán tổng số phản ứng (n) trong một lần pha hỗn hợp
3) Pha hỗn hợp phản ứng
Bảng 3.5: Thành phần master mix cho 1 phản ứng
Nước khụng chứa nuclease 7 àL
Mồi ngược U6 1 àL cDNA 1 àl
1) Sau khi cho các thành phần vào tuýp 1,5ml, hút lên xuống nhẹ nhàng
2) Quay ly tâm nhanh 5 giây để kéo hỗn hợp dưới đáy ống, luôn đảm bảo lạnh
3) Sắp cỏc tuýp 0,2 trờn khay , chia 19àl hỗn hợp vào mỗi tuýp
4) Cho 1àl nước (nuclease – free water) vào giếng chứng õm (sao cho đủ 20àl), đậy nắp tuýp
5) Cho mỗi 5àl nucleic acid của từng mẫu vào từng tuýp theo thứ tự, đậy nắp từng tuýp ngay sau đó
7) Cho các tuýp phản ứng (plate phản ứng) vào máy Realtime (MyGo,Pro), sau đó phản ứng khuếch đại U6 được thực hiện theo chu trình nhiệt ở bảng 3.6
Bảng 3.6: Chu trình nhiệt cho phản ứng real-time RT – PCR
2.3.3.2 Phản ứng phát hiện miRNA-141
Quy trình thực hiện với bộ 2XSensiFASTSybrNo-Ro kit:
Phản ứng phát hiện miRNA-141 gồm các thành phần theo bảng 3.7, các bước thực hiện như mục 2.3.3.1 và theo chu trình nhiệt ở bảng 3.6
Bảng 3.7: Thành phần master mix cho 1 phản ứng
Mồi ngược StL-R 1 àL cDNA 1 àl
Tên phản ứng Nhiệt độ Thời gian
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BIỆN LUẬN
Khai thác số liệu từ các bài báo được công bố
Các dữ liệu chiết xuất từ các bài báo liên quan đến miRNA-141 trong chẩn đoán ung thư vòm họng (cập nhật đến năm 2023)
Bảng 4.1: Tóm tắt dữ liệu đã khai thác từ các bài báo liên quan đến miRNA-141
Tác giả, năm Phương pháp nghiên cứu Loại mẫu Biểu hiện
(Luo et al., 2012) Microarray Mô Tăng
Liu et al., (2016) IHC, ISH Mô Tăng
Thuy Huyen Ai Le et al., (2018) qRT-PCR Sinh thiết Tăng
(Zhou et al., 2021) Fluorescence Quantitative
Ghi chú: qRT-PCR: quantitative Real-Time reverse transcription–polymerase chain reaction; IHC: immunohistochemical; ISH, in situ hybridization; FFPE: Formalin Fixed Paraffin Embedded
Kết quả cho thấy rằng:
Năm 2008, các nhà khoa học thuộc Viện Ung thư Quốc Gia (National Cancer Insitute, NIC) đã công bố các dữ liệu đầu tiên liên quan đến mối liên hệ giữa miRNA và ung thư vòm họng (Sengupta et al., 2008) MicroRNA (miRNA) được biết đến với nhiệm vụ và chức năng rất cần thiết trong việc tham gia vào các chu kỳ sinh học của con người và các biểu hiện của chúng liên quan đến chức năng ức chế ung thư hay gây ung thư trên người Với các tư liệu khoa học đã được kiểm chứng
34 trước đây, chúng ta biết được rằng: các miRNAs có các chức năng và nhiệm vụ khác nhau như một số miRNA thì tham gia vào việc ức chế sinh ung còn số khác thì gây ung thư trên người Điển hình như một công bố của nhà khoa học Sengupta và các cộng sự của ông (Sengupta et al., 2008) đã chỉ ra: miRNA-29c thực hiện chức năng ức chế khối u và gây cản trở sự phát triển của các u đó tại vùng ung thư vòm họng
Tiềm năng của miRNA nói chung và miR-141 nói riêng rất rộng lớn nhưng cho đến nay các nhà khoa học chỉ nghiên cứu chúng ở mức hạn chế Đặc biệt, mối quan hệ giữa các miRNAs và các bệnh lý ung thư điển hình như miRNA-141 có chức năng sinh ung thì vẫn chưa được nghiên cứu nhiều trên thế giới cũng như trong nước Sự biểu hiện bất thường của miRNA-141 có thể tiên lượng và dự đoán cho nhiều loại ung thư Đối với ung thư vòm họng thì miRNA-141 tham gia vào quá trình sinh ung thư trên người Do đó, miRNA-141 được coi như là một dấu chứng sinh học cần thiết trong quá trình tầm soát và chẩn đoán ung thư Trong các nghiên cứu trước đây cho thấy rằng việc knockdown c-MYC và sự biểu hiện lại của SPLUNC1 trên hệ thống miRNA của một dòng tế bào ung thư vòm họng gây ra sự thay đổi không nhỏ đối với các miRNAs Trong hệ thống miRNA nói trên thì miR-
141 là một trong nhiều yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến ung thư vòm họng (Zhang et al, 2010) Zhang và các cộng sự (2010) đã chứng minh rằng: miRNA-141 tăng lên trong các mẫu bệnh ung thư vòm họng so với các mẫu trong biểu mô vòm họng bình thường Bên cạnh đó, nhóm tác giả cũng chỉ ra rằng việc ức chế của miRNA-
141 có thể ảnh hưởng đến chu kỳ tế bào, quá trình tăng trưởng, tự hủy, di cư và xâm lấm trên các tế bào ung thư vòm họng và các phân tử BRD3, UBAP1 và PTEN là đích đến của miRNA-141 Từ các thử nghiệm trên của nghiên cứu, nhóm tác giả đã kết luận miRNA-141 và các gen liên quan đến khối u như BRD3, UBAP1, SPLUNC1 và PTEN tạo thành mạng lưới dẫn đến sự phát triển ung thư vòm họng Nhìn chung, các công trình nghiên cứu đều cho thấy rằng miRNA-141 đều có sự biểu hiện tăng vượt mức ở bệnh UTVH Ngoài ra, nguồn mẫu sử dụng chủ yếu là mô sinh thiết hay mô được lưu trữ bảo quản trong Paraffin Phương pháp sử dụng là
Realtime PCR (2/5 công trình), và các phương pháp khác (3/5 công trình) Trong các phương pháp sử dụng, Stem-loop Realtime PCR với các ưu việt về khả năng phát hiện nhưng chưa được áp dụng trong việc phát hiện sự biểu hiện bất thường của miRNA-141.
Kết quả khảo sát bộ mồi
Trình tự miR-141 được tải xuống từ ngân hàng miRNA (http://www.mirbase.org/) với mã số truy cập là MI0000457 Trong tế bào nhân thật, RNA trong nhân đi qua hai giai đoạn để hình thành các phân tử miRNA trưởng thành: đầu tiên quá trình xảy ra trong nhân để hình thành cấu trúc dạng kẹp tóc gọi là pre-miRNA có phần trình tự của miRNA-141 trưởng thành (phần tô đỏ ở bảng 4.2); sau đó pre-miRNA di chuyển ra ngoài nhân để hình thành các phân tử miRNA trưởng thành có chiều dài khoảng từ 19-24 nucleotide
Bảng 4.2: Trình tự và cấu trúc kẹp tóc pre-miR-141
Trình tự có cấu trúc kẹp tóc
Mạch chính miRNA-141 có khả năng bắt cặp bổ sung với trình tự mạch bổ sung hay còn gọi là mạch passenger về hai bên của cấu trúc phân tử pre-miR-141 Cấu trúc này chỉ tồn tại trong nhân cho đến khi di chuyển ra tế bào chất thì cấu trúc kẹp tóc pre-miR-141 tháo xoắn, tách mạch, có protein chuyên trách đến phân hủy một trong hai mạch và mạch còn lại là miRNA-141 trưởng thành tiếp tục tham gia vào quá trình điều hòa biểu hiện gen Trên ngân hàng dữ liệu mirbase, trình tự miR-
141 trưởng thành có mã số truy cập là MIMAT0004598, ID hsa-miR-141, có vị trí từ nt 59 – nt 80, chiều dài 22 nts, có trình tự là:
Phân tích đặc điểm mồi StL-miR-141
Trước hết, chúng tôi khảo sát tính chất vật lý và cấu trúc cuộn của mồi StL- miR-141 Cấu trúc mồi này cũng có trình tự 5’ TCTACCCAGCATAGGTCACGCTTATGGAGCCTGGGACGTGACCTATGCT
G – 3’ và sử dụng chương trình IDT Oligoanalyzer (https://sg.idtdna.com/calc/analyzer) để kiểm tra các đặc tính của StL-miR-141 Sau khi phân tính khảo sát, chúng tôi thấy rằng: chiều dài L = 50 nts; nhiệt độ nóng chảy
Tm (Melt temp) = 71,1 o C; tỷ lệ GC %GC = 56% và xuất hiện hai giả thuyết cấu trúc (A) và (B)(hình 4.1) của mồi StL-miR-141 Hai cấu trúc này đều là cấu trúc kẹp tóc với hai đầu: đầu cuộn tròn phía trên (hình 4.1) và đầu cuộn 5’-3’ phía dưới (hình 4.2)
Hình 4.1: Phần khác nhau của hai cấu trúc kẹp tóc của StL-miR-141
Hình 4.2: Phần giống nhau của hai cấu trúc kẹp tóc của StL-miR-141
Trên hình 4.1, chúng ta thấy phần cấu trúc khác nhau của hai cấu trúc mồi StL-miR-141 Cả hai cấu trúc đều lộ đầu 3’-TCTACC- 5’ thể hiện ở hình 4.2, đây chính là vị trí đặc hiệu để bắt cặp với miR-141 trưởng thành Hai cấu trúc khác nhau thì sẽ có tính chất vật lý tương ứng khác nhau như bảng 4.3
Bảng 4.3: Tính chất vật lý của hai cấu trúc mồi StL-miR-141
Theo kết quả phân tích về hai mức năng lượng này thì cấu trúc (A) được hình thành dễ dàng hơn so với cấu trúc (B) (ΔG(A)< ΔG(B)) Chính vì vậy mà mồi StL- miR-141 được thiết kế tương đồng với cấu trúc thứ cấp của pre-miRNA (có cấu trúc kẹp tóc) Ngoài ra, khả năng tự bắt cặp của mồi StL-miR-141 hầu như không có vì
38 theo phân tích thì cấu trúc tự bắt cặp (Self-Dimer) nhỏ hơn -1,47
Về độ nhạy của mồi StL-miR-141, như đã phân tích ở trên thì trình tự
3’TCTACC5’ bắt cặp tốt với sáu Nu tương đồng của trình tự hsa-miR-141
5’AGAUGG3’ (phần được tô vàng, hình 4.3)
Phản ứng RT-PCR để thực hiện chuyển miR-141 thành cDNA nhờ việc bắt cặp với mồi StL-miR-141 trong phản ứng Trong hỗn hợp phản ứng, enzyme Reverse Transciptase thực hiện chức năng kéo dài tại vị trí đầu 3’ của mồi StL-miR-
141, các Nu tương ứng kéo dài tiếp nối với mồi thể hiện bởi phần gạch đỏ phía dưới trên hình 4.3 Sản phẩm cuối cùng được tạo thành có trình tự
Tiếp theo, chúng tôi kiểm tra tính đặc hiệu của mồi StL-miR-141 Chúng tôi thực hiện kiểm tra độ tương đồng của hsa-miR-141 với một vài trình tự miRNAs như: hsa-miR-200a, hsa-miR-200b, hsa-miR-200c, hsa-miR-429 Trước tiên, chúng tôi lấy các trình tự trưởng thành của hsa-miR-200a, hsa-miR-200b, hsa-miR-200c, hsa-miR-429 trên ngân hàng miRNAs với các mã số truy cập tương ứng lần lượt là: MIMAT0001620, MIMAT0004571, MIMAT0004657 và MIMAT0001536 Tiếp theo phân tích trên phần mềm Bioedit bằng cách đưa tất cả trình tự trên vào phần mềm, chọn chế độ sắp gióng cột với trình tự hsa-miR-141, kết quả được thể hiện ở hình 4.4
Hình 4.3: Vị trí bắt cặp giữa mồi StL-miR-141 với trình tự hsa-miR-141
Trên hình 4.4, ở phần tô đen, chúng ta thấy các trình tự của từng miRNA không tương đồng với sáu Nu (AGAUGG) của hsa-miR-141 Từ đó ta có thể chứng minh rằng đoạn mồi StL-miR-141 đầu 3’ 3’TCTACC5’
Như vậy mồi StL-miR-141 đặc hiệu, chuyên biệt với hsa-miR-141
Phân tích đặc điểm mồi StL-F và StL-R
Dựa trên chương trình phân tích đặc điểm vật lý của mồi theo IDT Oligoanalyzer (https://sg.idtdna.com/calc/analyzer), chúng tôi đưa ra được kết quả của trình tự mồi StL-F và StL-R Kết quả trên được thể hiện ở bảng 4.4
Bảng 4.4: Các đặc điểm của mồi StL-F và StL-R Đặc điểm Mồi StL-F Mồi StL-R
Nhiệt độ nóng chảy Tm
Năng lượng ΔG của cấu trúc kẹp tóc (Hair spin)
Năng lượng ΔG của cấu trúc tự bắt cặp (Self-dimer)
Năng lượng ΔG của cấu trúc dị bắt cặp (Hetero- dimer) (Kcal.mole -1 )
Hình 4.4: Kết quả sắp gióng cột giữa các trình tự miR-141/200A/200B/200C/429
Theo kết quả phân tích tính chất vật lý trên bảng 4.4, chúng ta thấy chiều dài, tỷ lệ GC, nhiệt độ nóng chảy và năng lượng tự do để tạo nên cấu trúc thứ cấp đều đạt so với quy định Với các điều kiện tính chất vật lý trên, bộ mồi được tạo ra có cấu trúc thứ cấp phù hợp do đó khả năng bắt cặp của chúng sẽ nhạy hơn trong phản ứng Từ đó chúng tôi so sánh sản phẩm khuếch đại bằng cặp mồi StL-F và StL-R trên sản phẩm khuếch đại của mồi Stem-loop là 71 bps (Hình 4.5)
Hình 4.5: Kết quả kiểm tra sự tương đồng giữa cặp mồi StL-F, StL-R với sản phẩm khuếch đại của mồi Stem-loop StL-miR-141
Về độ đặc hiệu, chúng tôi tiến hành kiểm tra thông qua chương trình BLAST (NCBI: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), bằng cách đưa trình tự cặp mồi StL-
F, StL-R lên trang NCBI và cho chạy Trên cơ sở dữ liệu Genbank khi dùng bộ mồi này để tạo sản phẩm khuyếch đại, kết quả không hiện lên trình tự nào tương đồng
Do đó, có thể nói rằng cặp mồi StL-F, StL-R chuyên biệt với sản phẩm khuyếch đại của mồi Stem-loop StL-miR-141
Tổng hợp lại kết quả khảo sát mồi: bộ mồi StL-miR-141, StL-F, StL-R hoàn toàn nhạy và đặc hiệu với phản ứng phát hiện sự hiện diện miR-141 trên mẫu ung thư vòm họng, và hoàn toàn phù hợp trong việc sử dụng cho nghiên cứu.
Kết quả tách chiết miRNAs
Chúng tôi chiết xuất thu nhận miRNAs từ tất cả 50 mẫu mô sinh thiết NPC và
50 mẫu dịch phết tế bào vòm họng của người lành theo đúng quy trình thể hiện ở phần Phương pháp phần thực nghiệm (2.3), đặc điểm nhóm mẫu bệnh và nhóm mẫu lành được mô tả ở phụ lục 1 Dưới đây, chúng tôi đưa đại diện một số kết quả vài mẫu sau khi tách chiết theo bảng 4.5
Bảng 4.5: Kết quả tách chiết miRNAs một số mẫu sinh thiết và một số mẫu phết
N: mẫu mô sinh thiết NPC
P: dịch phết vòm họng của mẫu lành Độ tinh sạch của mẫu sau khi được tách chiết được lựa chọn xem xét dựa trên giá trị OD A260/ A280 Chênh lệch giữa hai khoản OD này thường dao động trong mức cho phép là 1,8 ≤ A260/ A280 ≤ 2,1 Khi các mẫu nằm trong giá trị cho phép chứng tỏ là độ tinh sạch của các mẫu sau tách chiết tốt và có thể đảm bảo được rằng
42 không có các yếu tố khác ảnh hưởng đến kết quả cuối cùng Thực nghiệm đã cho thấy tất cả các mẫu đều đặt độ tinh sạch trong ngưỡng cho phép và có thể sử dụng tiếp cho các kỹ thuật sau.
Khảo sát sự biểu hiện miRNA-141 trên bộ mẫu mô NPC và bộ dịch phết người lành
Tổng số miRNA của mẫu sinh thiết UTVH và mẫu dịch phết vòm họng được tách chiết bằng bộ kit TRIzol Việc kiểm tra sự biểu hiện của miR-141 được thực hiện với bộ mồi thân cuộn Chứng nội cho phản ứng được sử dụng là U6snRNA Kết quả kiểm tra chứng nội ở các mẫu thí nghiệm được thể hiện ở hình 4.6
Sau khi phân tích kết quả, giá trị trung bình chu kỳ ngưỡng của U6snRNA ở mẫu sinh thiết UTVH và mẫu lành lần lượt là: 29,41 và 29,95 Ngoài ra, kết quả cũng cho chúng tôi thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa giá trị trung bình chu kỳ ngưỡng U6snRNA trên mẫu sinh thiết và mẫu lành (p=0,1) Bên cạnh đó, khi quan sát các tín hiệu đường cong trên màn hình thì thấy rất rõ ràng hình 4.6 Với các lý do trên, các giá trị U6 thu được của các mẫu đều đạt yêu cầu và tin cậy Đây cũng là chứng nội có giá trị được đưa vào các phần mềm để tính toán các giá trị biểu hiện của miRNA-141 ở các mẫu thực nghiệm trong bài này
Kết quả khuyếch đại gene miRNA-141 được thể hiện ở hình 4.7
Hình 4.6: Kết quả khuyếch đại gene chứng nội U6snRNA ở các mẫu thí nghiệm
Chú thích: (A) chu kỳ khuếch đại; (B) đường cong nóng chảy của gene U6snRNA
Bảng 4.6: Kết quả tính chất biểu hiện của miRNA-141 ở các mẫu
Nhóm mẫu Biểu hiện miRNA-141
Bệnh (n = 50) 15 (30) 35 (70) Lành (n = 50) 33 (66) 17 (34) Chỉ số OR 4,53 p 0,0004
Chú thích: N (Negative): âm; P (Positive): dương
Kết quả khảo sát tính chất biểu hiện của miRNA-141 được ghi nhận trong bảng 4.6 Chúng ta thấy tỷ lệ mẫu có biểu hiện miRNA-141(70%) trong nhóm mẫu bệnh UTVH cao hơn hẳn so với nhóm mẫu lành (chiếm 34%) và sự chênh lệch này có ý nghĩa (p=0,0007) Điều đó có nghĩa rằng có sự tồn tại miRNA-141 trong các mẫu bệnh UTVH và việc coi miRNA-141 như là một yếu tố nhằm xác định và phát
Hình 4.7: Kết quả Real-time PCR (A) và Điện di (B) trên một số mẫu đại diện UTVH
Chú thích: (L)thang điện di; (N)chứng âm
44 hiện sớm UTVH là có thể MiRNA-141 chính là dấu chứng sinh học
Dựa vào sự biểu hiện miRNA-141 ở các nhóm mẫu (bệnh, lành), đề tài tiếp tục xử lý số liệu kết quả theo hướng phân tích giá trị OR và RR Các kết quả phân tích được dựa theo Hệ thống điểm của giá trị OR và RR của MedCalc (2018), ở bảng 4.7
Theo kết quả phân tích, giá trị OR là 4,53 (p = 0,0004) là độ chênh lệch về sự biểu hiện miRNA-141 ở nhóm mẫu bệnh cao gấp 4,53 lần so với nhóm mẫu lành, từ đó có thể nhận định rằng: nếu đối tượng bệnh nhân cho kết quả dương tính với miRNA-141 sẽ có khả năng mắc UTVH cao gấp 4,53 lần so với đối tượng âm tính (không có biểu hiện miRNA-141) Kết quả trên được chấp nhận với độ tin cậy cao (p = 0,0004) Giá trị RR là 2,06 (p = 0,0009) nghĩa là nếu có biểu hiện miRNA-141 sẽ làm tăng nguy cơ cao mắc UTVH gấp 2,06 lần, so với không có biểu hiện miRNA-141 Các kết quả phân tích OR, RR đều có được xác định với giá trị p
khả năng mắc UTVH tăng cao
Có biểu hiện miRNA-141 làm tăng nguy cơ cao mắc UTVH
Không có độ chênh về sự biểu hiện miRNA-141 giữa người mắc ung thư vòm
Không có mối liên hệ nào giữa biểu hiện miRNA-141 và UTVH
Giá trị OR (*) Giá trị RR (*) họng và người khỏe mạnh
=> không có khả năng mắc UTVH
Có độ chênh âm về sự biểu hiện miRNA-141 giữa người mắc UTVH và người khỏe mạnh
=> khả năng mắc UTVH thấp hoặc không có khả năng mắc bệnh
Có biểu hiện miRNA-141 làm giảm nguy cơ cao UTVH
Chú thích: (*): giá trị p phù hợp (p 0,05) Tỷ lệ biểu hiện miRNA-141 ở nam và nữ lần lượt là 48% và 22%, cao nhất ở độ tuổi 40-60 với tỷ lệ 34% Tuy nhiên, tính chất biểu hiện của miRNA-141 lại có mối tương quan chặt chẽ với đặc điểm lâm sàng là giai đoạn bệnh Theo như bảng 4.7, chúng ta thấy tỷ lệ mẫu của người bệnh UTVH có biểu hiện miRNA-141 cao nhất là ở giai đoạn IV (20/50 mẫu, chiếm 40%), tiếp đến là giai đoạn 2 (15/50 mẫu, chiếm 30%), p