Nghiên cứu tạo dòng và khảo sát điều kiện biểu hiện gen vptlh từ vibrio parahaemolyticus

BỘ CÔNG THƯƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌCCẤP TRƯỜNG Tên đề tài: Nghiên cứu tạo dòng khảo sát điều kiện biểu gen Vptlh từ Vibrio parahaemolyticus Mã số đề tài: 21/1SHTP 04 Chủ nhiệm đề tài: Trần Thị Huyền Đơn vị thực hiện: Viện Công Nghệ Sinh học & Thực phẩm LỜI CẢM ƠN Tôi xin gởi lời cảm ơn Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh hỗ trợ kinh phí cho đề tài nghiên cứu khoa học với mã số HD-102/DHCN Tôi xin cảm ơn Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm tạo điều kiện thuận lợi trang thiết bị để chúng tơi hồn thành nghiên cứu Các đồng nghiệp, sinh viên K12 ngành công nghệ sinh học chung sức nhiều để tơi hồn thiện đề tài Tơi xin chân thành cảm ơn tất Trân trọng., PHẦN I I THƠNG TIN CHUNG Thơng tin tổng qt 1.1 Tên đề tài: Nghiên cứu tạo dòng khảo sát điều kiện biểu gen Vptlh từ Vibrio parahaemolyticus 1.2 Mã số: 21/1 SHTP 04 1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực đề tài TT Họ tên Đơn vị cơng tác Vai trị Viện công nghệ Sinh học Thực phẩm Chủ nhiệm đề tài Viện công nghệ Sinh học Thực phẩm Thành viên tham gia (Học hàm, học vị) Trần Thị Huyền (Tiến sĩ) Hà Phương Trang (Sinh viên) 1.4 Đơn vị chủ trì: Viện Cơng nghệ Sinh học Thực phẩm 1.5 Thời gian thực hiện: 18 tháng 1.6 1.5.1 Theo hợp đồng: từ tháng 03 năm 2021 đến tháng 03 năm 2022 1.5.2 Gia hạn (nếu có): đến tháng 12/2022 1.5.3 Thực thực tế: từ tháng năm đến tháng năm Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có): khơng 1.7 Tổng kinh phí phê duyệt đề tài: Năm mươi lăm triệu đồng (55 triệu đồng) II Kết nghiên cứu Đặt vấn đề V parahaemolyticus vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) tôm sú Đặc biệt, theo nghiên cứu trước đây, hầu hết gen liên quan độc tố vi khuẩn V parahaemolyticus có khả chịu nhiệt, hai gen ldh tlh chứa nhiều đặc điểm trình tự tương đồng Tháng năm 2020, Hoàng Tân Quảng cộng Viện công nghệ sinh học, Đại học Huế xác định xác định gen độc tố trh, tdh, tlh Trong gen độc tố tlh cho có mặt 14 chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoạt tử gan tụy cấp tính (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease – AHPND) bệnh dẫn đến tỉ lệ chết 100% cho tôm sú dẫn đến thiệt hại kinh tế cho ngành ni tơm sú Châu Á nói chung (Zhang et al., 2001) Người ta cho "hemolysis" loại độc làm ly giải tế bào màng hồng cầu với giải phóng hemoglobin độc tố phân bố rộng rãi loài Vibrio spp Mầm bệnh từ V parahaemolyticus phụ thuộc vào diện tác nhân độc lực bao gồm haemolysin phụ thuộc lecithine (ldh), hemolysin chịu nhiệt (tlh), hemolysin bền nhiệt (tdh) hemolysin liên quan tdh (trh) (Michael et al., 2007) Tất gen liên quan độc tố vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus có khả chịu nhiệt, hai gen ldh tlh chứa nhiều đặc điểm trình tự tương đồng Gen ldh mã hóa cho độc tố ldh nói chung có số chủng vi sinh vật có khả thủy phân phosphatidylcholine (PC) thành lysophosphatidylcholine (LPC) sau thủy phân LPC thành glycerophosphorylcholine (GPC) Ngược lại, gen Vptlh V parahaemolyticus cho gen độc tố chuyên biệt mã hóa cho độc tố Vplth có khả có tác động gây hoạt động tan huyết tế bào hồng cầu hoạt hóa yếu tố tan máu, độc tố đánh nguyên nhân gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) tôm, sú (Jyoti et al., 2014) Hiện chưa có nghiên cứu liên quan đến hoạt động ức chế lên độc tố tan huyết Vptlh gây bệnh xuất huyết lở loét tôm nuôi Việt Nam vi khuẩn V parahaemolyticus Gen Vptlh trình tự nucleotide có chiều dài đầy đủ 1,5 kb mã hóa tồn phân tử protein hemolysin chịu nhiệt (thermolabile hemolysin) gọi Vptlh với trọng lượng phân tử 47,5 kDa (Taniguchi et al., 1986) Tuy nhiên, nghiên cứu khác báo cáo hai trường hợp đột biến xóa oligonucleotide chiều dài gen Vptlh, cụ thể trình tự sau đột biến chứa trình tự nucleotide từ 1007 đến 1586 vùng khác chứa trình tự nucleotide từ 642 đến 1586 không tạo không sản xuât độc tố tán huyết tế bào E coli et al (Taniguchi et al., 1986) Gần đây, nghiên cứu sản xuất protein tái tổ hợp Vptlh từ gen Vptlh có chiều dài gen đầy đủ từ vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus nghiên cứu tổng hợp tế bào E coli (Luis et al., 2021; Zhao et al., 2011) Mặc dù trạng thái biểu Vptlh tái tổ hợp biểu tế bào E coli lại dạng khơng hịa tan hay dạng thể vùi, đặc tính gây tượng tan huyết tế bào hồng cầu Vptlh thực sau hồi tính cách sử dụng thêm hợp chất guanidine Theo sau đó, kết nghiên cứu phản ứng tán huyết Vptlh tổng hợp đồng khẳng định khả gây tán huyết độc tố Vptlh haemolysin phụ thuộc lecithin hoạt tính tan máu cần hai chất enzym phospholipase, chẳng hạn phosphatidylcholine lecithin (Luis et al., 2021; Zhao et al , 2011) Điều dẫn đến giả thuyết hoạt động tán huyết Vptlh phụ thuộc vào hoạt động phospholipase) Bên cạnh đó, cấu trúc tổng quát 3D Vptlh xác định có chứa hai vùng chức (domain) vùng C- domain vùng N-domain, nhiên vai trò chức cho vùng chưa có giải thích rõ ràng cho việc vùng thực hoạt tính phospholipase hoạt tính tán huyết (Abraham et al., 2017) Để xác định vùng chức mã hoá cho độc tố tan huyết cho loài vi khuẩn V parahaemolyticus (Vptlh), vùng trình tự gen Vptlh có kích thước 448-450bp mã hoá cho vùng chức đầu C lựa chọn để nghiên cứu nghiên cứu Bằng phương pháp PCR với hai đọan mồi chuyên biệt sử dụng để khuếch đại phần đoạn trình tự DNA mã hố cho vùng chức đầu C gọi tên VpTLH Kết sản phẩm PCR thu nhận tinh sau tiến hành cắt hai đầu hai loại enzyme giới hạn khác (NdeI BamH1), lúc cắt plasmid vòng pET-11a-His-tag trở thành mạch thẳng hai loại enzyme cắt giới hạn Hai sản phẩm cắt enzyme giới hạn liên kết enzyme T4 ligase để tạo plasmid tái tổ hợp pET-11a-HistagVptlh Gen VpTLH mã hố thành protein VpTLH có kích thước giả định 23.6 kDa tiến hành khảo sát điều kiện phù hợp cho biểu tế bào chủ E coli BL21 (DE3) Sau bước khảo sát xác định điều kiện phù hợp cho biểu hiện, protein VpTLH tinh dựa gắn thêm có chứa axit amin histidine phương pháp sắc ký lực với cột Ni-NTA chun biệt với protein có histidine Kết thu nhận protein VpTLH bước đầu quan trọng ứng dụng nghiên cứu chết hoạt động độc tố Vptlh gây tan máu tế bào hồng cầu tế bào bị nhiễm vi khuẩn V parahaemolyticus, từ ứng dụng kiếm dẫn xuất làm giới hạn hay giảm hoạt lực độc tố VpTLH, hạn chế dịch bệnh vi khuẩn V parahaemolyticus gây tôm sú nuôi Việt Nam giới Mục tiêu 2.1 Mục tiêu tổng quát Mục tiêu tổng quát đề tài: "Nghiên cứu tạo dòng khảo sát điều kiện biểu gen VpTLH mã hóa cho độc tố tan huyết Vibrio parahaemolyticus" 2.1 Mục tiêu cụ thể -Tạo dòng vùng gen VpTLH từ trình từ gen đầy đủ Vptlh Vibrio parahaemolyticus vào tế bào chủ E coli BL21(DE3) -Khảo sát điều kiện biểu protein VpTLH -Tinh thu nhận protein VpTLH Phương pháp nghiên cứu Nội dung 1: Tổng quan gen tlh chi Vibrio nghiên cứu vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus (Vptlh) nói riêng Là lồi vi khuẩn kỵ khí tùy tiện, vi khuẩn V parahaemolyticus mọc tốt môi trường kiềm mặn, nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng 37oC, không phát triển nhiệt độ 15oC Chúng phân lập cát, bùn, nước biển, hải sản phân người mắc bệnh ăn hải sản (Michael et al., 2007) Môi trường nuôi cấy V.parahaemolyticus cần bổ sung muối để phát triển, nồng độ muối cho phép môi trường nuôi cấy thường 1-2 % TCBS môi trường chọn lọc cho lồi vi khuẩn Trên mơi trường TCBS, sau 18-24 ni cấy, chúng hình thành khuẩn lạc màu xanh, trịn, lồi, đường kính – 5mm (Tuan Tran Anh et al., 2014) Tìm kiếm xác định trình tự gen tlh vi khuẩn V parahaemolyticus ngân hàng gen (NCBI), trình tự nucleotide dung để thiết kế đoạn mồi cho quy trình thu nhận gen Vptlh Chủng vi khuẩn V parahaemolyticus cho thí nghiệm cung cấp từ viện nuôi trồng thủy sản II - Kết dự kiến: Đã tập hợp tư liệu dạng phương pháp tạo dòng, biểu khảo sát hoạt tính gen độc tố Vptlh nghiên cứu Xây dựng thuyết minh đề tài Nội dung 2: Thực phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để thu nhận tinh phần mục tiêu VpTLH có chiều dài khoảng 448bp Thiết lập kiểm tra quy trình chạy PCR đặc hiệu thu nhận đoạn gen mục tiêu VpTLH sau tinh sản phẩm PCR Tiến hành thực quy trình phản ứng PCR cho thu nhận gen mục tiêu VpTLH cặp mồi đặc hiệu công bố trước (Huyen Tran Thi et al., 2019) Đoạn mồi chiều xuôi (tlh-F: 5’-GGG GCA TAT GAA AGC GGA TTA TGC AGA AGC ACT G -3’) đoạn mồi chiều ngược (tlh-R: 5’-GGG GGG ATC CGC TAC TTT CTA GCA TTT TCT CTG C-3’) với phần in đậm trình tự cặp enzyme cắt giới hạn NdeI BamHI Cặp mồi sử dụng thí nghiệm PCR với mẫu DNA chuẩn bị từ chủng V parahaemolyticus, sử dụng 10µl FastDigest Green Buffer 10X (Thermo ScientificTM), 0,5µl primer forward 10µM, 0,5µl primer reverse 10µM 1µl mẫu DNA cho phản ứng PCR 20µl Các điều kiện PCR bao gồm bước biến tính ban đầu 94oC phút, 30 chu kỳ 94oC 30 giây, 52oC 30 giây 72oC phút, bước kéo dài cuối 72oC 10 phút Sau thực phản ứng PCR hoàn tất, tiến hành kiểm tra sản phẩm PCR phương pháp điện di agarose 1.5% dùng để kiểm tra kết diện gen mục tiêu VpTLH Gel agarose pha với công thức 0.75g agarose 50ml dung dịch đệm TAE 1X để nồng độ gel cuối đạt 1.5% Agarose hịa tan hồn tồn TAE, 8µl thuốc nhuộm safeview bổ sung đổ vào khuôn gel Sau gel đông (15 phút), gel đặt vào điện di DNA dung dịch điện di (TAE 1X) đổ ngập miếng gel Tiến hành nạp sản phẩm sau chạy PCR vào giếng theo tỉ lệ 8µl mẫu 2µl loading dye 4X Thời gian điện di diễn 30 phút 100V Kết thúc trình điện di, sử dụng hệ thống đọc gel để xem kết Vùng gen VpTLH sau khuếch đại thành công phương pháp PCR tiến hành tinh làm giàu kit tách sản phẩm PCR (Toppure ® Genomic DNA extraction kit) Đầu tiên, bổ sung 30µl nước cất khơng có enzyme nuclease vào tube nhựa chứa sẵn 30µl sản phẩm PCR đảm bảo tổng thể tích tube 60µl, bổ sung 400µl dung dịch PRB khuấy đảo nhanh giây để hỗn hợp khơng dính lên thành tube mang ly tâm lạnh nhiệt độ 4oC với tốc độ 12000 vòng/phút Sau hai phút ly tâm, thu dịch Bổ sung tiếp tube hỗn hợp 500µl dung dịch PWB tiếp tục ly tâm Tương tự sau phút thu dịch Cuối bổ sung 50µl EB, ủ phút ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút phút Dịch sau ly tâm chạy điện di phân tích gel agarose 1.5% bảo quản -20oC - Kết dự kiến: Xuất dải band vị trí khoảng 448bp so với thang chuẩn 1kb Bioline gel agarose 1.5%, chiều dài gen mục tiêu VpTLH khuếch đại phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu Nội dung 3: Nối gen mục tiêu VpTLH vào plasmid pET-11a (His-tag) Thu nhận plasmid tái tổ hợp mang gen VpTLH chuyển plasmid tái tổ hợp vào tế bào chủ E coli BL21(DE3) Sử dụng enzyme nối T4 ligase để gắn nối gen mục tiêu (VpTLH) vào plasmid pET11a (His-tag) Dựa vào phương pháp hóa biến nạp, sàng lọc khuẩn lạc giải trình tự để tạo dòng kiểm tra diện gen mục tiêu VpTLH có hai dịng tế bào chủ E coli NEB-turbo BL21(DE3) Sau có sản phẩm plasmid gen VpTLH cắt hai enzyme cắt giới hạn chúng tơi tiếp tục phản ứng nối T4 ligase, hỗn hợp ủ ủ 4oC khoảng thời gian 20 để tạo thành plasmid tái tổ hợp pET11a-Histag-Vptlh Sử dụng phương pháp hoá biến nạp để đưa plasmid tái tổ hợp vào tế bào chủ E coli NEB-turbo BL21(DE3) Quy trình biến nạp sau: chuẩn bị môi trường 50ml Luria –Bertani broth (LB) đĩa môi trường LB agar có bổ sung amppicilin với nồng độ 50µg/ml Lấy tube 1.5ml chứa 50µl tế bào khả nạp E coli NEB-turbo BL21(DE3) bảo quản tủ -80oC đặt đá rã đơng hồn tồn Thêm 7µl plasmid tái tổ hợp pET-11a-HistagVpTLH trực tiếp vào tube chứa tế bào chủ trên, tiến hành ủ nhanh đá 20 phút Tiếp đến, tube sốc nhiệt 42oC vào 20 giây ủ lại đá phút Cuối bổ sung vào tube lượng 943µl mơi trường LB tiến hành nuôi lắc 37oC 30 phút đến Sau khoảng thời gian ni tăng sinh, hút 100µl dịch nuôi cấy lỏng tiến hành trãi lên đĩa petri chứa môi trường LB 50μg kháng sinh ampicilin để kiểm tra tế bào chủ có chứa plasmid tái tổ hợp Trong khoảng thời gian từ 16 đến 20 nuôi ủ, đĩa petri tiến hành kiểm tra sàng lọc khuẩn lạc Kết kiểm tra diện gen mục tiêu VpTLH có hai dòng tế bào chủ E coli NEB-turbo BL21(DE3) xác định so sánh với đĩa đối chứng âm có diện tế bào chủ không mang plasmid Những khuẩn lạc riêng lẻ có đĩa mơi trường LB/amp huyền phù với 100µl nước cất vơ trùng ủ nhiệt độ 95oC 10 phút Sau tiến hành ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút, thu dịch để sử dụng để tiến hành PCR Sản phẩm PCR cuối tiến hành điện di gel agarose 1.5% Sau chạy điện di, sử dụng hệ thống đọc gel để xem kết Sản phẩm PCR xuất band thu nhận tiến hành giải trình - Kết dự kiến: Biến nạp thành công plasmid tái tổ hợp pET-11a-Histag-VpTLH vào tế bào chủ E coli NEB-turbo BL21(DE3) Xác định diện gen mục tiêu Vptlh phần mềm Clustawl so sánh với trình tự gen VpTLH từ ngân hàng liệu NCBI Nội dung 4: Khảo sát điều kiện biểu protein tái tổ hợp His-tag-VpTLH Tìm kiếm điều kiện phù hợp để biểu protein tái tổ hợp His-tag-VpTLH từ plasmid tái tổ hợp pET-11a-Histag-VpTLH tế bào BL21(DE3) Khảo sát điều kiện liên quan nhiệt độ, nồng độ chất cảm ứng IPTG thời gian nuôi cấy đến sinh tổng hợp protein tái tổ hợp His-tag-VpTLH Thí nghiệm khảo sát điều kiện biểu protein His-tag-VpTLH thực cách nuôi tăng sinh khuẩn lạc E coli BL21 (DE3) vào 5ml môi trường LB chứa ampicilin 37oC 20 Sau đó, hút vào 2ml dịch ni cấy vào bình tam giác chứa 100ml mơi trường LB/amp, tiếp tục nuôi lắc vi khuẩn 37oC từ 1,5 - mật độ vi khuẩn đạt giá OD bước sóng 600nm khoảng từ 0,5 đến 0,6, thực hút 1ml dịch nuôi cấy để làm đối chứng âm (khơng có ảnh hưởng chất cảm ứng) Sau đó, tiến hành bổ sung chất cảm ứng IPTG với hai nồng độ khảo sát (0.5 mM) vào bình tam giác nuôi cấy tiến hành khảo sát ảnh hưởng hai ngưỡng nhiệt độ 15oC 37oC đến sinh tổng hợp protein tái tổ hợp His-tag-VpTLH Trong trình khảo sát hai điều kiện nhiệt độ khác nhau, hút 1ml dịch môi trường nuôi cấy tai thời điểm sau nuôi cấy bắt đầu tính từ lúc thêm IPTG, lập lại bước hút ml dịch nuôi cấy vi khuẩn sau khoảng thời gian từ giờ, sau 20 nuôi cấy Lượng tế bào thu nhận sau khoảng thời gian tương ứng điều kiện nhiệt độ khác phương pháp ly tâm 6000 vòng/phút Cặn vi khuẩn huyền phù dung dịch ly giải tiến hành phá hủy màng tế bào máy siêu âm với tần số 25kHz thiết lập Sau khoảng chu kỳ phá vỡ tế bào máy siêu âm, dịch huyền phù tiến hành ly tâm lạnh tốc độ 13000 vòng/phút thời gian phút Dịch phần tách riêng tiến hành chạy điện di SDS-PAGE cho xác định diện protein tái tổ hợp His-tag-VpTLH Nội dung 5: Tinh protein tái tổ hợp His-tag-VpTLH Thu nhận protein tái tổ hợp His-tag-VpTLH tinh Phương pháp sắc ký lực cột Ni-NTA Nguyên tắc phương pháp dựa liên kết lực protein tái tổ hợp His-tag-VpTLH có chứa His, có khả liên kết chuyên biệt với hạt resin có gắn Ni2+ diện cột Ni-NTA Dựa vào đặc điểm để thu nhận protein có His, protein khác loại bỏ bơm qua cột Sinh khối tế bào thu sau khảo sát điều kiện biểu vượt trội thu nhận cách ly tâm 6000 vòng/phút, 20 phút, nhiệt độ phịng, sau hịa tan với 5ml đệm liên kết với axit niken-nitrilotriacetic (Ni-NTA) chứa 5mM imidazole, sau mang ly giải sóng siêu âm với tần số thiết lập 25kHz dịch huyền phù tiến hành ly tâm lạnh tốc độ vòng 3000 vòng/ phút, 30 phút, 4oC thu dịch Quá trình tinh His-tag-VpTLH thực cách sử dụng Hispur Ni-NTA resin 3ml theo hướng dẫn nhà sản xuất (Thermo) VpTLH tinh cách rửa giải hai lần với lần rửa wash buffer (25mM Tris-HCl pH 7.5, 250mM NaCl, 3mM βmercaptoethanol, 15mM imidazole) với tỉ lệ 2:1 so với thể tích cột, tiếp với lần rửa thứ (25mM Tris-HCl pH 7.5, 250mM NaCl, 3mM β-mercaptoethanol, 50mM imidazole) với tỉ lệ 2:1 so với thể tích cột, cuối VpTLH thu dịch đệm thu nhậnn (25mM Tris-HCl pH 7.5, 250mM NaCl, 3mM β-mercaptoethanol, 300mM imidazole) Độ tinh khiết VpTLH sau q trình tinh phân tích chạy điện di SDS-PAGE 12% - Kết dự kiến: Sau trình tinh qua cột Ni-NTA, diện protein tái tổ hợp His-tag-VpTLH xác định diện dải có kích thước xấp xỉ 50kDa so với thang chuẩn gel SDS-PAGE Nội dung 6: Kiểm tra hoạt tính protein His-tag-VpTLH Sau tìm kiếm thu thập thơng tin hoạt tính độc tố His-tag-VpTLH, thực thí nghiệm kiểm tra hoạt tính tan máu phospholipase vùng gen VpTLH Thí nghiệm kiểm tra hoạt tính tan máu phospholipase protein His-tagVpTLH khảo sát phương pháp khuếch tán giếng thạch sau: Chuẩn bị môi trường đĩa thạch môi trường thạch máu bổ sung 3% máu cừu môi trường LB bổ sung 1% nhũ tương lịng đỏ trứng Sau đó, sử dụng Oxford cup có đường kính 6mm để đục giếng đĩa thạch 50 protein His-tag-VpTLH bổ sung vào giếng, giếng bổ sung đệm TBS (Tris buffer saline) không protein giếng đối chứng âm (Boguang et al., 2007) Hiệu giá tan máu prptein His-tag-VpTLH đánh giá hồng cầu cừu Hồng cừu tách từ máu cừu cách thực ly tâm 3000 vòng/phút, phút, 4°C loại bỏ phần huyết tương bên Phần hồng cầu rửa lần với đệm PBS (0.9%) (Phosphate buffer saline) Sau đó, hịa tan hồn tồn 100 µl hồng cầu với 900 µl đệm PBS Bổ sung 300 uL His-tag-VpTLH với nồng độ khác (25, 50, 75 and 100 µg) vào tube 1.5 ml, bổ sung 2% hồng cầu cừu đệm TBS cho thể tích cuối đạt 1ml Đồng hỗn hợp ủ 60 phút Sau đó, tiến hành ly tâm 3000 vòng/phút, phút 4°C, thu phần dịch Hiệu giá tan huyết đo bước sóng 490nm máy đo quang UV-VIS 0.2% Tween-20 sử dụng làm đối chứng dương đệm PBS sử dụng làm đối chứng âm thí nghiệm % Hiệu giá tan huyết tính tốn theo cơng thức sau: 𝐴 −𝐴 Hiệu hóa tan huyết (%) = 𝐴 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑙𝑒 −𝐴𝑁𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑒 × 100 (Zhang et al., 2007) 𝑝𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑒 𝑁𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑒 Trong đó: Asample: giá trị đo quang mẫu protein bước sóng 490nm Anegative: giá trị đo quang mẫu đối chứng âm bước sóng 490nm Apositive: giá trị đo quang mẫu đối chứng dương bước sóng 490nm Các nghiệm thức thực lần Các số liệu xử lí thống kê ANOVA one-way phần mềm Statgraphics Centurion XV Tất liệu trình bày dạng chênh lệch thống kê trung bình ± SE (n=3) (*p