Nghiên cứu tạo dòng đuôi ái lực Carbonhydrate Binding Module 20 (CBM20) hướng đến sử dụng trong tinh chế Protein tái tổ hợp.pdf

Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TÁT THÀNH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG NGUYEN TAT THANH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TẠO DỊNG ĐI ÁI Lực CARBONHYDRATE BINDING MODULE 20 (CBM20) HƯỚNG ĐÉN SỬ DỤNG TRONG TINH CHÉ PROTEIN TÁI TỐ HỢP Sinh viên thực : Lê Thị Mỹ Phương Chuyên ngành TP.HCM, tháng năm 2018 : Công nghệ sinh học Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẮT THÀNH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG cstĩlBO KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TẠO DỊNG ĐUÔI ÁI Lực CARBONHYDRATE BINDING MODULE 20 (CBM20) HƯỚNG ĐÉN SỬ DỤNG TRONG TINH CHÉ PROTEIN TÁI TỐ HỢP Sinh viên thực : Lê Thị Mỳ Phương Mã số sinh viên :1411533017 Lớp : 14DSH02 Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Giáo viên hướng dần : TS Vũ Văn Vân TS Thân Văn Thái TP.HCM, tháng năm 2018 LỜI CẢM ƠN Thực tế sống giúp ta nhận điều khơng có thành công mà không gắn liền với hồ trợ giúp đỡ từ nhũng nguời xung quanh Dù cho giúp đỡ hay nhiều, trực tiếp hay gián tiếp Đe hoàn thành luận văn đạt kết tốt đẹp, suốt trình thực nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ q Thầy Cơ, gia đình bạn bè Trước tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Vũ Văn Vân người hướng dần đà tận tình bảo, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu suốt khoảng thời gian thực đề tài Xin gửi lời cảm ơn tri ân sâu sắc đến TS Thân Văn Thái người tạo điều kiện cho lời khuyên đắn đe hoàn thành tốt luận văn Sau cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, tất bạn bè ln bên tơi, ủng hộ cho niềm tin, động viên, hồ trợ mặt từ vật chất đến tinh thần để tơi hồn thành khóa luận cách trọn vẹn Đồng thời, xin gửi lời cảm ơn tất anh/chị Viện Kỳ thuật Công nghệ cao NTT quan tâm, hướng dần giúp đỡ suốt thời gian qua Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn! Tp Hồ Chỉ Minh, ngày thảng năm 2018 Lê Thị Mỳ Phương Khoa Công nghệ Sinh học Môi trường Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành 11 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH MỤC CÁC HÌNH ix CHƯƠNG TÓNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Ngành protein tái tổ hợp 1.2 Giới thiệu chung CBM20 1.2.1 Phân loại .4 1.2.2 Vai trò chức cùa CBM 1.2.2.1 Chức CBM 1.2.2.2 Vai trò CBM20 enzyme 1.3 Giới thiệu chung Neurospora crassa 1.3.1 Lịch sử 1.3.2 Chu kì sinh sản N crassa .8 1.3.3 Methyl hóa DNA Netưospora crassa 10 1.3.4 Hệ thống sinh học Neurospora crassa 11 1.4 Tống quan phương pháp 11 1.4.1 Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) 11 1.4.2 Colony PCR 12 1.4.3 Phương pháp CTAB (Cetyl Trimethyl Amomnium Bromide) 13 1.4.4 Phương pháp điện di 14 1.4.4.1 Đặc diêm gel agarose 14 1.4.4.2 Qui trình điện di gel agarose 15 1.4.4.3 Ưu diem nhược điếm phương pháp điện di gelagarose 16 1.4.5 Phương pháp tạo tế bào khả nạp 16 1.5 Tình hình nghiên cứu nước 18 1.5.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 18 iii 1.5.2 Tình hình nghiên cứu nước 19 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚƯ 20 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 20 2.2 Nội dung nghiên cứu 20 2.3 Thiết bị, vật liệu, hóa chất 21 2.3.1 Thiết bị dụng cụ 21 2.3.2 Hóa chất 23 2.4 Đối tượng nghiên cứu 23 2.5 Phương pháp nghiên cứu .24 2.5.1 Thiết kế mồi cho phản ứng PCR 25 2.5.1.1 Thiết kế mồi phản ứng mở vòng plasmid pGEX-4T3-GST/DOHH .25 2.5.1.2 Thiết kế mồi tách CBM20 từ NCU08746 Neurospora crassa 25 2.5.2 Chuẩn bị vật liệu chạy phản ứng ghép nối plamsid pGEX-4T3-CBM20/DOHH26 2.5.2.1 Chuẩn bị tế bào khả nạp E.coli DH5a phương pháp hóa biến nạp .26 2.5.2.2 Tách DNA tong nấm N crassa phương pháp CTAB 27 2.5.2.3 Khuếch đại trình tự CBM20 có N crassa phản ứng PCR 28 2.5.2.4 Tạo dòng tế bào E coli mang plasmid pGEX-4T3-GST/DOHH phương pháp sốc nhiệt (heatshock) 29 2.5.2.5 Phương pháp tách plasmid 29 2.5.2.6 Mở vòng plasmid pGEX-4T3-GST/DOHH, cắt bỏ trình tự GST để thay trình tự CBM20 phương pháp PCR 30 2.5.2.7 Kiểm tra diện gene phương pháp điện di 31 2.5.2.8 Phương pháp tinh sản phấm điện di (PCR) 31 2.5.3 Thực phản ứng cắt - nối bang enzyme cắt giới hạn ổữ/nHI AÍ1II 32 2.5.4 Kiểm tra diện CBM20/NCU08764 colony PCR 33 CHƯƠNG KẾT QUA VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Thiết kế mồi cho phản ứng PCR 34 3.2 Ket tách DNA tổng từ nấm N crassa 36 3.3 Kết PCR khuếch đại trình tự CBM20 36 iv 3.4 Kết PCR mở vòng plasmid pGEX-4T3-GST/DOHH 37 3.5 Kết tạo dòng tế bào chứa plasmid pGEX-4T3-CBM20/DOHH 38 3.6 Kiểm tra diện CBM20/NCƯ08764 colony PCR 39 KÉT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC 44 V TĨM TẢT Khái niệm lưc xuất thiết kế di truyền với mục đích giúp cho tinh protein enzyme hiệu hon Đe tài “Nghiên cứu tạo dịng lực carbonhydrate binding module 20 (CBM20) hướng đến ứng dụng tinh chế protein tái tổ hợp” thực từ tháng 02-8/2018 Phòng Sinh học phân tử, Viện Kỹ thuật Công nghệ cao NTT với mục tiêu tạo thành cơng dịng tế bào Escherichia coli DH5a mang trình tự đuôi lực CBM20 hướng đến ứng dụng tinh protein mục tiêu Nội dung nghiên cứu: Thiết kế mồi cho phản ứng PCR; Chuẩn bị vật liệu chạy phản ứng ghép nối plamsid pGEX-4T3-CBM20/DOHH; Thực phản ứng cắt - noi bang enzyme; Kiểm tra diện trình tự CBM20 plasmid Kết đạt được: Thiết kế thành công cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại trình tự CBM20 có nấm Neurospora crassa (N crassà) mở vòng plasmid pGEX-4T3-GST/DOHH Tách DNA tổng nấm N crassa, khuếch đại trình tự CBM20 cặp mồi đặc hiệu đong thời gắn trình tự enzyme cắt giới hạn đầu Tạo dòng tế bào E coỉi mang plasmid pGEX-4T3-GST/DOHH Tạo dòng tế bào E coli DH5a mang trình tự lực CBM20 (chứa plasmid pGEX- 4T3-CBM20/DOHH) VI SUMMARY The term of plasmid affinity tag is mentioned when genetic inventions are used to strengthen the purity of protein and enzyme more effectively The project title “Studying about creating clones affinity tag carbonhydrate binding module 20 (CBM20) targeted for use in the process of refining recombinant protein” is carried out at Molecular Biology Department, NTT- High Tech Institute with the aim of producing Escherichia coli DH5a cells containing the sequence of affinity tag CBM20 to target the protein purify (from 02-8/2018) Research contents: To design catalysts for PCR reaction; To prepare resources to activate plamsid pGEX-4T3-CBM20/DOHH sequence reaction; To cut-off and trammittion reaction through enzyme; Examine the presence of CBM20 sequence in plasmid Results: To succeed in designing a couple of effective catalysts to amplify CBM20 sequence in fungi Neurospora crassa (N crassa) and opening the circle plasmid pGEX-4T3-GST/DOHH To succeed in dividing into total DNA in fungi N crassa To succeed in producing E coli DH5a cells containing plasmid pGEX-4T3GST/DOHH To succeed in producing E coli DH5a cells containing the sequence of affinity tag CBM20 (contaning plasmid pGEX-4T3-CBM20/DOHH) DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CBM20: Carbonhydrate binding module 20 N crassa: Neurospora crassct E coli: Escherichia coli NCBI: The National Centre for Biotechnology Information PCR: Polymerase Chain Reaction dNTP: Deoxyribounucleotide triphosphate CTAB: Cetyl Trimethyl Amomnium Bromide DNA: Deoxyribonucleic Acid LB Luria Bertani V111 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc phân tử CBM20 xác định phương pháp NMR Hình 1.2 Sơ đồ loại CBM khác gắn kết với vùng khác chất nên polysaccharide Hình 1.3 Neurospora crassa Hình 1.4 Vịng đời Neurospora erassa Hình 1.5 Các giai đoạn phản ứng PCR Hình 1.6 Các bước quan trọng Colony PCR Hình 1.7 Cấu trúc phân tử agarose Hình 1.8 Sơ đồ minh họa bước trình điện di gel agarose Hình 1.9 Sơ đồ chế tượng biến nạp Hình 2.1 Một số thiết bị dùng nghiên cứu Hình 2.2 Plasmid pGEX-4T3 Hình 2.3 Vùng bảo tồn trình tự Hình 2.4 Vị trí gene CBM20 đoạn linker N crassa Hình 3.1 Mở vịng vector, loại GST Hình 3.2 Gan Restriction Enzyme vào CBM20 Hình 3.3 Kết đo DNA tổng số nấm N crassa Hình 3.4 Kết điện di sản phẩm PCR CBM20 (giếng 1); Thang đo kb (giếng 2) Hình 3.5 Kết điện di plasmid pGEX-4T3-GST/DOHH sản phẩm PCR Hình 3.6 Hình ảnh khuẩn lạc mang plasmid pGEX-4T3-CBM20/DOHH Hình 3.7 Kết điện di sản phẩm (A) Colony PCR, (B) cat enzyme (/?«/» HI A fill) IX ... nguồn protein với độ tinh cao định thực đề tài ? ?Nghiên cứu tạo dịng lực carbonhydrde binding module 20 (CBM20) hướng đến ứng dụng tinh chế protein tái tổ họp” CHƯƠNG TÓNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Ngành protein. .. ctv, 201 0) Trong đó, nghiên cứu việc sử dụng đuôi lực carbonhydrate binding module 20 (CBM20) cho thấy CBM20 có lực tương đối phù họp với trình liên kết tinh bột, có tác dụng làm tăng độ tinh protein. .. Khái niệm lưc xuất thiết kế di truyền với mục đích giúp cho tinh protein enzyme hiệu hon Đe tài ? ?Nghiên cứu tạo dịng lực carbonhydrate binding module 20 (CBM20) hướng đến ứng dụng tinh chế protein