Nghiên cứu tạo dòng vi khuẩn vibrio parahaemolyticus nhược độc phục vụ chế tạo vắc xin phòng bệnh hoại tử gan thận trên một số loại cá biển

VIỆN DẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG VI KHUÁN VIBRIO PARAHAEMOLYTICVS NHƯỢC ĐỘC PHỤC VỤ CHÉ TẠO VẢC-XIN PHÒNG BỆNH HOẠI TỦ GAN THẢN TRÊN MỘT SÓ LOẠI CÁ BIẾN Giáo viên hướng dẫn : ThS Nguyễn Thị Thu Hiền Sinh viên thực : Dàm Thận Quảng Lớp: 11-02 Hà Nội - 2015 LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin chân thành cám ơn thầy cô giáo, cán hộ thuộc Khoa Công nghệ sinh học - Viện Đại học Mớ Hà Nội tạo điêu kiện thuận lợi cho em thực tập hồn thành đề tài Em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sac tới ThS Nguyễn Thị Thu Hiền Giáng viên Khoa Công nghệ Sinh học, Viện Đại Học Mớ Hà Nội, người trực tiếp tận tình hướng dan dìu dắt em suốt trình em thực tập hồn thành đề tài Em khơng thê quên gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, anh chị khóa trước, bạn bè ln hên em, tận tình giúp đỡ, vũ động viên suốt thời gian em thực tập hồn thiện đề tài Trong q trình thực tập khơng tránh khỏi sai sót, kính mong thầy giáo, anh chị bạn đóng góp ý kiến đế em tiếp thu hồn thiện Em xin chân thành cám ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Sinh viên Đàm Thận Quáng MụC LụC MỞ ĐÀU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu .2 Mục tiêu chung 1.2.1 1.2.2 1.3 Mục tiêu cụ thể Ý nghĩa đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn 1.4 Tính mới, tính độc đáo tính khả thi đề tài CHƯƠNG ITÓNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lịch sử phátGbậit bệnh uàvỉộdftiẫkỉO'/iWiLs^/l.ơ l.lB Nọ.l 1.1.1 Tinh hình giới 1.1.2 Tinh hình nước 1.2 Giới thiệu Vibrio parahaemolyticus 1.2.1 Đặc điểm Vibrio parahaemolyticus 1.2.2 Độc tố Vibriopơrahaemolyticus 1.3 Tổng quan bệnh hoại tử gan thận cá biền Vibrio parahaemolyticus gây 11 1.3.1 Cơ chế gây bệnh 13 1.3.2 Triệu chứng gây bệnh 13 1.4 Tổng quan tạo chùng vi khuẩn nhược độc 14 1.4.1 Tinh hình nghiên cứu tạo chùng vi khuẩn nhược độc 14 1.4.2 Các phương pháp làm giảm độc vi khuẩn 16 1.4.3 Các tác nhân tạo chủng nhược độc 18 Đặc điểm hệ miễn dịch cá xương 25 1.5 1.5.1 Miễn dịch đặc hiệu 25 1.5.2 Miễn dịch tự nhiên 25 CHƯƠNG IIVẬT LIỆU VÀ PHUONG PHÁP NGHIÊN cút) 26 2.1 Vật liệu nghiên cứu 26 2.1.1 Đối tượng nghiên cửu 26 2.1.2 Hóa chất 26 2.1.3 Môi trường dung dich nuôi cấy 27 2.1.4 Thiết bị 28 2.2 Nội dung nghiên cứu 29 2.3 Phương pháp nghiên cứu 30 2.3.1 Phương pháp vi sinh 2.3.2 Phương pháp tạo chùng nhược dộc kỹ thuật gây đột biến thực 30 Thừ viện Viện Đại hoc Mở Hà Nội nghiệm 30 2.3.3 Phương pháp sinh học phân tử 32 2.3.4 Phương pháp gây nhiễm động vật thí nghiệm 36 CHNG IIIKẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 3.1 Kết quà tạo dòng vi khuẩn Vibrioparahaemolyticus tác nhân.37 Ket tạo dòng vi khuan Vibrio parahaemolyticus tia UV 37 3.1.1 3.1.2 Kết tạo dòng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus kháng sinh rifampicin 38 3.2 Kết quà đánh giá mức độ giảm độc lực dịng đơt biến 39 3.2.1 Kết thử dung huyết 40 3.2.2 Kết gây nhiễm cá 41 3.2.3 Kết quà chạy PCR xác định gen độc tố .43 3.3 Kết quà đánh giá khă tạo kháng bảo hộ cho cá 45 KÉT LUÂN VÀ KIẾN NGHỊ 48 TÀI LIỆU THAM KHÁO 49 Thư viện Viện Đại học Mớ Hà Nội DANH MỤC VIẾT TẮT Brain Heart Infusion Broth BHI Broth Base pair bp Brain Heart Infusion BHI Deoxyribonucleotide Acid DNA Deoxynucleotidetriphosphate dNTP Food and Drug Adimistration FDA Polymerase Chain Reaction PCR Rifampicin Rif Thiosulfate Citrae Bile Salt Sucrose TCBS Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Hình thái vi khn Vibrio parahaemolyticus Hình 1.2 Tác động tia tứ ngoại tạo dimer thymine 20 Hình 1.3 Tác động tia uv làm cho DNA có chỗ phình cấu trúc 21 Hình 1.4.cấu trúc RNA polymerase (RNAP) 23 Hình 1.5 Vùng kháng Rif tiếu đon vị p RNAP 23 Hình 1.6 Đột biến kháng Rif vùng I gen rpoB 24 Hình 2.1 Minh họa thí nghiệm chiếu tia uv 31 Hình 3.1 Khuẩn lạc sống sót sau chiếu uv 38 Hình 3.2 Khuẩn lạc chịu mơi trường TCBS cóbố sung kháng sinh 39 Hình 3.3 Khá nãng dung huyết chúng LBT6 Dòng 41 Hình 3.4 Cá sau gây nhiễm chủng đột biến 43 Hình 3.6: Sán phầmỉ^R Pà]\Ịội 45 Hình 3.7 Cá thí nghiệm sau gây nhiễm 15 ngày .47 DANH MỤC BẢNG Báng 2.1: Các cặp mồi sử dụng cho phàn ứng PCR 35 Bàng 3.1 Số khuẩn lạc sống sót sau xử lý uv 37 Bàng 3.2 Số khuẩn lạc sống sót sau xứ lýkháng sinh rifamycin 39 Bảng 3.3 Ket quà khả dung huyết 40 Bảng 3.4 Kết gây nhiễm cá 15 ngày tiêm 42 Bàng 3.5 Kết kiếm tra có mặt gen độc tố 44 Bảng 3.6 Kết đánh giá khă sinh kháng thể bảo hộ 46 Thư viện Viện Đại học Mớ I Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học Viện Đại Học Mở Hà Nội MỞ ĐÀU 1.1 Đặt vấn đề Việt Nam quốc gia ven biến nằm bên bờ Tây cùa Biển Đơng, có bờ biển dài hưn 3.260 km trái dài từ Bắc tới Nam tạo điều kiện thuận lựi cho hình thành phát triển kinh tế, đặc biệt nghề nuôi trồng thúy hái sàn Nuôi trồng thủy sản ngành công nghiệp sản xuất thực phấm phát triển nhanh giới, mang lại tiêm to lớn đê mạnh chiên lược phát triền kinh tê biển Theo thông kê Tông cục Thủy sản (Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn), tống sản lượng thúy sản nuôi trồng tháng đau năm 2014 ước đạt 543 nghìn tấn, sân lượng khai thác 244 nghìn sản lượng ni trồng 299 nghìn tấn, đưa tong sàn lượng thủy sàn tháng đầu năm xấp xi 4,0 triệu tấn, tăng 4,0%, săn lượng khai thác 1,9 triệu (tăng 4,9%), sản lượng nuôi trồng 2,1% (tăng 3,1%) Tống cục Thủy sản cho biết, giai đoạn 2011-2015 ngành thủy săn hướng tới phát triến bền vững ngành xuất khấu hàng hóa lớn, có kha cạnh tranh cao hội nhập vững chác giới \i ị Hiện nay, đối tượng ni mơ hình ni thủy sán Việt Nam phong phú.Trong đó, mơ hình nuôi cá lồng ngày khang dịnh vị trí Đây mơ hình áp dụng cho nhiều lồi cá có giá trị kinh te cao Cá nuôi lồng phải chịu nhiều yếu tố gây stress phái thích nghi với mơi trường sống mới, tập quán sinh sản kiếm ăn bị đáo lộn sức đề kháng bị ánh hướng Vì thế, cá nuôi lồng thường mắc số bệnh vi khuẩn virus gây Dáng lưu ý bệnh hoại tứ gan thận cá biến chúng vi khuan Vibrio parahaemolyticus gây ra, làm thiệt hại không nhị đến người ni cá biến Bệnh hoại tử gan thận xuất hầu hết loài cá biến (cá mũ, cá chèm, cá giờ, cá hồng, cá bóp ), đặc biệt cá ni lồng, xuất cá nước Khi vi khuẩn v.parahaemơlyticus xâm nhập vào thể cá biển, gây hoại tử lên nội quan cá (đặc biệt gan, thận), lở loét lớp biếu bì Gan thận bị hoại tử, gan từ màu xám nâu chuyển thành màu vàng, làm cho cá biền chết hàng loạt Bệnh thường xảy giai đoạn cua cá, tìm phương pháp phịng trị bệnh có thê hạn chế tồn thất dịch bệnh gây cần thiết SV: Đàm Thận Quảng Lớp: 11-02 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học Thực tế nuôi trồng thúy sàn, người dân thường sứ dụng nhiều hóa chất kháng sinh đế khống chế vi khuấn này, song việc sử dụng kháng sinh gây tượng nhờn thuốc khơng mang lại hiệu cao Vi khuẩn có tạo màng báo vệ trước thuốc diệt khuẩn kháng sinh Chính thế, dịch bệnh thường bùng phát trờ lại nhanh sau thuốc hết tác dụng Mặt khác, dư lượng kháng sinh sán phẩm từ cá biển gây ánh hường xấu đến chất lượng thịt cá sức khỏe người Hiện phương pháp phòng bệnh hiệu quà sủ dụng vắc-xin Việc nghiên cứu loại vắc-xin phòng bệnh tương đối cần thiết Một bước quan trọng đế nghiên cứu vắc-xin phải tạo chung vi khuẩn nhược độc, làm sờ ban đầu hướng đến việc sàn xuất vắc-xin bệnh hoại từ gan thận cá biền Xuất phát từ lý luận thực tiền trên, tiến hành đề tài: "Nghiên cứu tạo dòng vi khuẩn Vibrio parahaemoỉyticus nhược độc phục vụ chế tạo vắc- xin phòng bệnh hoại từ thận số loại cá biển." làm sớ ban đầu hướng dến việc sàn xuất vắc?xin bệnh hoạt tứ gạn thận ợ cá biển 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu chung Tạo chung vi khuân Vibrio parahaemolyticus nhược độc có khả tạo khánh báo hộ cá 1.2.2 Mục tiêu cụ thể • Tạo dược dòng vi khuân Vibrio parahaemolyticus nhược độc kỹ thuật đột biến sừ dụng tia uv • Tạo dòng vi khuan Vibrio parahaemolyticus nhược độc bang kỹ thuật đột biến sử dụng kháng sinh rifampicine • Đánh giá đặc tính chúng đột biến: Đánh giá lạikhâ dung huyết Đánh giá lại mức độ gây bệnh qua lây nhiễm cá Kiểm tra xác định gcn độc tố Đánh giá khả tạo kháng thể bão hộ cho cá sử dụng vi khuẩn nhược độc SV: Đàm Thận Quảng Lớp: 11-02 Khoa Công Nghệ Sinh Học Viện Đại Học Mở Hà Nội đáng kế khuẩn lạc mọc chống chịu tia uv Đên đời khơng cịn khn lạc mọc Khuẩn lạc sống sót sau chiếu tia uv Khuân lạc sống sót sau chiếu tia uv phút 21 phút Hình 3.1 Khuẩn lạc sốngsótsau chiếu uv 3.1.2 Kết tạo dòng vi khuần Vibrio parahaemolyticus kháng sinh rifampicin Chùng tự nhiên LBT6 tiến hành tăng sinh môi trường BHI+0.5pg/ml kháng sinh rifampicin ngày, cấy lên môi trường TCBS+0.5pg/ml xác định khuân lạc mọc được, lấy ngầu nhiên khuấn lạc tăng sinh môi trường kháng sinh lần Sau liên tục gây áp lực lần với vi khuẩn mơi trường BHI bồ sung rifampicin có nồng độ 0,7pg/ml 0.8pg/ml 0,9pg/ml lpg/ml l,lpg/ml I,2pg/ml l,3pg/ml, thu kết quà Bảng 3.2, Hình 3.2 SV: Đàm Thận Quản; Viện Đại Học Mờ Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học Qua đời sứ dụng kháng sinh với nồng độ khác nhận thay: số khuấn lạc vi khuẩn sống sót tý lệ nghịch với nồng độ kháng sinh bổ sung vào môi trường BHI Riêng đời thứ nhất, mật độ vi khuấn sống sót giảm đột ngột, chi bàng '/2 so với đĩa đối chứng không sử dụng kháng sinh Đời khơng cịn khuẩn lạc mọc Khn lạc vi khuẩn sống sót sau xử lý Khuẩn lạc vi khuẩn sống sót sau xừ lý rifampicin l,2pg/ml rifampicin l.lpg/ml Hình 3.2 Khuẩn lạc chịu đưọc mơi trưímg TCBScó bổ sung kháng sinh 3.2 Kết đánh giá mức độ giảm độc lực dịng đơt biến Từ dòng vi khuấn thu sau xử lý chiếu tia uv rifampicin tiếp tục đánh giá mức độ giám độc lực môi trường thạch máu cá SV: Đàm Thận Quảnj Khoa Công Nghệ Sinh Học Viện Đại Học Mờ Hà Nội 3.2.1 Kết thủ’ khả dung huyết Độc to dung huyết (haemolysis) yếu tố gây bệnh yếu cùa vi khuan V parahaemolyticus vật chù Độc to haemolysin bám lên màng tế bào hồng cầu, gây thúng màng giâi phóng haemoglobin Kết quâ tạo tượng dung huyết hoàn toàn (P-haemolysis) Đánh giá gây dung huyết cùa chủng dột biến nham mục đích xem xét mức dộ giám độc lực dộc tố Kết thu Bảng 3.3, Hình 3.3 Bảng 3.3 Kết khả dung huyết Nguồn gốc Khá dung Chủng huyết Chùng tự p nhiên Phân lập từ gan ruột cá hồng LBT6 Dòng Dòng Sau 15 phút chiếu uv p Sau 18 phút chiếu uv y TI viện Viện Đại học Mở Hà h ội Dòng Sau 21 phút chiều uv p Dòng Sau 24 phút chiếu uv Y Dòng Chịu nồng dộ kháng sinh Y 0,9pg/ml) Dòng Chịu nồng độ kháng sinh Y pg/ml) Dòng Chịu nong độ kháng sinh 1,1 p pg/ml) Dòng Chịu nồng độ kháng sinh 1,2 Y pg/ml) Ỵ không dung huyết P: dung huyết p SV: Đàm Thận Quản; Lớp: 11-02 40 Khoa Công Nghệ Sinh Học Viện Đại Học Mờ Hà Nội Kết q thí nghiệm chúng tơi nhận thấy, có dịng: Dịng Dịng Dịng Dịng Dịng 8, có biêu giâm độc lực khơng có tượng dung huyết thạch máu cừu Khơng xuất vịng dung huyết Xuất dung huyết vịng dung huyết rõ Hình 3.3 Khả dung huyết cùa chủng LBT6 Dòng , , Thự.viện Viện Đại học Mơ Hà Nội 3.2.2 Kết gây nhiễm cá Trên đối tượng động vật mẫn cám sử dụng cá mú có kích thước 3cm đe gây nhiễm dòng vi khuấn gây đột biến dòng tự nhiên LBT6, Liều tiêm cho mồi cá 0,5ml canh khn chứa 105CFU/ml Cá thí nghiệm ni điều kiện cho giống tự nhiên, thời gian theo dõi 15 ngày Ket tiến hành gây nhiễm thực nghiệm bang dòng đột biến Dòng tự nhiên ban đầu LBT6 cho cá Mú phịng thí nghiệm có kết q cụ Bảng 3.4 Hình 3.4 SV: Đàm Thận Quảnj Khoa Cơng Nghệ Sinh Học Viện Đại Học Mờ Hà Nội Bảng 3.4 Kết quă gây nhiễm cá 15 ngày tiêm Gây nhiễm Chúng Số cá thí Số cá Trạng thái bơi Trạng thái lấy thức ăn nghiệm sống LBT6 15 0 Dịng 15 Lờ đờ, hoạt động bơi Chậm chạm Dòng 15 13 Nhanh nhẹn, phản xạ Kém ăn Nhanh Dòng 15 Lờ đờ, hoạt động bơi Chậm chạm Dịng 15 14 Nhanh nhẹn, phân xạ Bình thường Dịng 15 13 lội tốt nhẹ lội tốt Nhanh nhẹn, phản xạ Kém ăn hơn, nhanh tốt Dòng 15 12 Dịng 15 15 14 nhẹn Nhanh nhẹiì, phản xạ Kérn ăn Chậm tốt Dòng 0 Nhanh nhẹn, phán xạ Bình thường tốt Lơ cá có gây bệnh với dịng 1, dịng 3, dịng chủng tự nhiên gây chết hồn tồn số cá sống sót cịn Sau 48-72 gây nhiễm cá có biếu bệnh điển hình xuất huyết chồ tiêm, thân vây.biếng ăn, bơi lờ đờ không nhanh nhẹn Chủng tự nhiên LBT6 dịng gây chết hồn tồn cá thí nghiệm Các lơ cá có gây nhiễm với dịng 2, dòng 4, dòng 5, dòng 6, dòng 8, cho số lượng cá sống sót cao hơn, từ 12-14 sau 24-48 lây nhiễm cá có tượng ăn hoạt động Tuy sau 48 cá hoạt động lại bình thường SV: Đàm Thận Quản; Lớp: 11-02 42 Viện Đại Học Mờ Hà Nội Khoa Cơng Nghệ Sinh Học Hình 3.4 Cá sau gây nhiễm chủng đột biến Như vậy, từ kết quà thu thí nghiệm gây đột biến đánh giá mức độ giảm độc lực, chúng tơi xác định dịng vi khn nhược độc, dịng: dịng 2, dịng 4, dòng 5, dòng 6, dòng 3.2.3 Kết chạy PCR xác định gen độc tố Các dòng vi khuần dược Ịựa'chon,troqgi nghiên cứu mục 3.2.2 tiếp tục sừ dụng đe xác định gen độc tố Mục đích cứa thí nghiệm đe xác định chế giảm độc lực cứa chúng nghiên cứu Các dòng vi khuẩn: dòng 1, dòng 2, dòng dòng dịng 6, dịng 7, dịng 8, LBTó.được ni cấy môi trường BHI, đem tăng sinh khối máy lẳc vòng 24h, 28°c với tốc độ 150 vịng/phút Sau đem dịch ni cấy ly tâm thu cặn tế bào Điện di kiểm tra lại Kết thề Hình 3.5 SV: Đàm Thận Quảnj Khoa Công Nghệ Sinh Học Viện Đại Học Mờ Hà Nội (M: maker; 9: LBT6; 1: đòng 1; 2: dòng 2; 3: dòng 3; 4: dòng 4; 5: dòng 5; 6: dòng 6; 7: dòng 7; 8: dòng; M: maker.) Hình 3.5 Kích thước DNA tổng số dịng Kết q the qua Hình 3.5 cho thấy kết quà tách DNA tốt, săn phẩm dùng làm nguyên liệu cho phàn ứng PCR Chúng tiến hành kiểm tra gen dộc tố Tox R, tdh, tlh, trh dòng dột biến chúng LBT6 tựnhiên, kết q tliếhiỉ^nBáng 3.5.Hình 3.6 Dịng Băng 3.5 Kết kiểm tra có mặt gcn độc tố tdh trh Tox R tlh LBT6 Có Khơng có có Dịng Có Khơng có CĨ Dịng Có Khơng có có Dịng Có Khơng có có Dịng Có Khơng có có Dịng Có Khơng có có Dịng Có Khơng có có Dịng Có Khơng có có Dịng Có Khơng có có SV: Đàm Thận Quảnj Viện Đại Học Mờ Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học Qua bàng kết kiểm tra gen độc tố cúa dòng đột biến chúng LBT6 chứng tò gcn dộc tố cùa chúng sau xứ lý uv rifampicin hồn tồn giống số lượng kích thước so với chúng tự nhiên Theo nghiên cứu Zulkifli cộng sự, 1987 2009 Gen toxR có mặt tất cá chúng không gây bệnh chủng gây bệnh, có chức điều hịa biếu cùa gen độc tố cúa loài V parahaemolyticus Sự có mặt gen dịng vi khuấn chứng tó chúng v.parahaemolyticus trình gây đột biến khơng có tượng tạp nhiễm Gcn Tox R (368bp) Gcn tlh (450bp) IhlLVÌên Viên Đai học Mở Hà Nội „ Hình 3.6: Sản pham PCR xác định gcn độc tổ Tox R, tlh Từ kết đánh giá mức độ giảm độc lực kết xác định gen đôc tố PCR cho phép bước đầukết luận sơ rằng: dòng 2, dòng dòng 5, dòng 6, dòng đòng vi khuẩn bị đột biến gen theo hướng giám độc lực 3.3 Kết đánh giá khă tạo kháng thể hảo hộ cho cá Một chùng vi khuẩn nhược độc đạt tiêu chuẩn sán xuất vắc-xin đạt hai liêu chí: 1) an toàn động vật mẫn cảm 2) có sinh kháng thơ báo hộ Từ kết quà xác định dòng vi khuẩn nhược độc, tiếp tục đánh giá tạo kháng thể báo hộ cúa dòng vi khuẩn đột biến, bao gồm: dòng dòng 4, dòng 5, dòng dòng Cá mú sử dụng cho nghiên cứu có kích thước 3cm mạnh khóe, dược kiêm tra không nhiễm bệnh hoại từ gan thận bang phân ứng PCR Liều gây miền dịch cho cá 105CFU/ml, sau gây miễn dịch sở, cá thừ thách bới chúng tự nhiên LBT6 với liều công cường độc 107CFU/ml Kết quà thể Bảng 3.6 Hình 3.7 SV: Đàm Thận Quảnj Khoa Cơng Nghệ Sinh Học Viện Đại Học Mở Hà Nội Bảng 3.6 Kết đánh giá khă sinh kháng thể bảo hộ Trạng thái bệnh tích Gây nhiễm Dịng Số cá Số cá ban sống đau sót Trạng thái Trạng thái bơi lấy thức ăn Chậm Kém ăn chạm, lờ Chậm hoại tử gan thận đờ chạm - Cá chết sau 24 giờ, Bệnh tích cá - Khơng xuất huyết da Dịng 15 13 - Không xuất diem bị stress tiêm - Không xuất huyết da - Không xuất điềm Dịng 15 14 Bình Bình thường thường hoại từ gan thận - Cá chết sau 24 giờ, bị stress tiêm Thưv 'i'th-si?" Đại học IV Qr Không xuất huyết da - Không xuất điềm Dịng 15 chạm 13 bình Kém ăn hoại tử gan thận - Cá chết sau 24 giờ, thường bị stress tiêm - Không xuất huyết da - Không xuất điểm Dòng 15 12 Lờ đờ Kem ăn chậm chạm hoại từ gan thận - Cá chết sau 24 giờ, bị stress tiêm SV: Đàm Thận Quản; Lớp: 11-02 46 Khoa Công Nghệ Sinh Học Viện Đại Học Mở Hà Nội Chết hoàn Chết Dịng 15 hồn - Xuất huyết tồn thân, toàn sau 60 toàn sau 60 nội tạng giờ - Hoại từ gan thận Đối chứn g Chết hoàn Chết (chùn 15 g tự nhiên hoàn - Xuất huyết toàn thân, toàn sau 60 toàn sau 60 nội tạng giờ - Hoại tứ gan thận LBT6 ) Hình 3.7 Cá thí nghiệm sau gây nhiễin 15 ngày Hình 3.7.CÚ thí nghiệm sau gây nhiễm vần sống hoạt động bình thường Từ kết chúng tơi kết luận dịng: dịng 2, dịng 4,dịng dịng 6, có khả sinh kháng the bão hộ cá, dịng sử dụng làm nguyên liệu sàn xuất vắc-xin SV: Đàm Thận Quản; Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học KÉT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận A Từ chủng Vibrio parahaemolyticustự nhiên LBT6 phân lập từ gan ruột cá hồng có dấu hiệu hoại tứ Cát Bà, Hãi Phịng Chúng tơi tiến hành sứ dụng hai tác nhân tia uv kháng sinh rifampicin đê tạo chúng nhược độc Chúng tạo nhiều dịng đột biến thời gian thí nghiệm cịn hạn che chúng tơi tiến hành kiểm tra dịng dột biến thời gian chiếu uv nồng độ kháng sinh đời cuối, cụ là: dòng l(Sau 15 phút chiếu UV), dòng (sau 18 phút chiếu UV), dòng (Sau 21 phút chiếu UV), dòng (Sau 24 phút chiếu UV), dòng (chịu nồng độ kháng sinh (),9pg/ml), dòng (Chịu nồng độ kháng sinh I pg/ml), dòng (chịu nồng độ kháng sinh 1,1 pg/ml), dòng (chịu nồng độ kháng sinh 1,2 pg/ml) dòng vi khuẩn qua đánh giá mức độ giảm độc lực môi trường thạch máu, PCR cá Chúng xác định dịng vi khuẩn nhược độc, dòng: dòng 2, dòng 4, dòng 5, dòng 6, dòng dòng vi khuân được'đánh giá nãng sinh kháng thể bào hộ chúng xác định dịng:dịng 2, dịng 4, dịng 5, dịng 6, có sinh kháng bảo hộ cá, dịng sử dụng làm ngun liệu sán xuất vắc-xin B Kiến nghị Tiếp tục đánh giá dịng vi khuấn đột biến lựa chọn dịng có vi khuẩn an toàn nhất, tạo đáp ứng miền dịch bền vững đế nghiên cùa che tạo vắc-xin phòng bệnh hoại từ gan thận cho cá biến SV: Đàm Thận Quản; Lớp: 11-02 48 Khoa Công Nghệ Sinh Học Viện Đại Học Mở Hà Nội TÀI LIỆU THAM KHÁO Tài liệu tiếng Việt [1] Khuất Hữu Thanh (2006), Cơ sờ di truyền phân từ kỹ thuật gen, NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội, tr 186-198 |2J Từ Thanh Dung (2011), Thứ nghiệm văcxin phòng bệnh gan thận mủ cho cá tra ni thâm canh, Tạp chí thương mại thủy săn [3] Vũ Thị Thanh Hương, Bùi Thị Thanh Tịnh Nguyền Quốc Bình (2011) Tạo chủng Edwardsilla ictaluri nhược độc bàng cách chọn môi trường kháng sinh Rifampicin nham ngăn ngừa bệnh gan thận mủ cá tra, Ký yếu Hội nghịcông nghệ sinh học tồn quốc, Khu vực phía Nam lan II tiểu ban 5: Công nghệ sinh học Thúy sàn, tr 108 [4]Phạm Thị Bích Ngọc (2011), Tìm hiếu quy trình phát Vibriotrong thủy hâi sản đồng lạnh, Khóa luận tốt nghiệp, Trường đại học kỹ thuật công nghệ TP HCM trI5, 40-42 Tài liệu tiếng Anh |5| Amy J.V Joseph D.B Stephanie P.F., Christine T.H Kimothy L.S Paul K (2002), Molecular analysis of Rifampicin resistance in Bacillus anthracis and Bacillus cereus, Antimicrobial agents and chemotherapy46 (2): 511-513 [6] Austin B Austin D.A (2007) Vibrios, bacterial fish pathogens: diseases in farmed and wild fish, Praxis Publishing Ltd Chichester, UK, p 594 [7] Alsina M and Blanch A.R (1994) Improvement and update of a set of keys for biochemical-identification of Vibrio species Journal of Applied Bacteriology 77: 719-721 [8] Benjamin R.L., Scott E.L., Douglas R.C., Kenneth D.c (2008) Isolation of Rifampicin resistant Flavobacterium psychrophilum strains and their potential as live attenuated vaccine candidates, Vaccine 26: 5582 - 5589 |9J Chao G„ Jiao X., Zhou X., Yang z„ Huang J., Zhou L., Qian X (2009), Distribution, prevalence, molecular typing, and virulence of Vibrio parahaemolyticusKoidted from different sources in coastal province Jiangsu, China, Food Control 20: 907-912 SV: Đàm Thận Quảng Lớp: 11-02 49 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học [101 Christopher A.B., Thomas J.C., Kim o (201 Vibrio parahaemolyticus cell biology and pathogenicity determinants", Microbes and Infection 13: 992-1001 [11] Daniels N.A., MacKinnon L., Bishop R., Altekruse s„ Ray B., Hammond R.M., Thompson s., Wilson s„ Bean N.H., Griffin P.M., Slutsker L (2000),Vibrio parahaemolyticus infections in the United States 1973-1998 Journal of Infectious Diseases 181: 1661-1666 [12]Duff D.C.B (1942),The oral immunization of trout against Bacterium sabnonicida, Journal Immunology 44: 87-94 [13] Elizabeth A.C., NataliyaK., Arkady M., Katsuhiko M., Satish N„ Alex G., Seth A.D (2001), Structural mechanism for Rifampicin inhibition of bacterial RNA polymerase,Cell 104: 901 -912 [14] Harris K.A Hartley J.c (2003), Development of broad-range 16S rDNA PCR for use in the routine diagnostic clinical microbiology service, Journal of Medical Microbiology 52: 685-691 [15] Harikrishnan R., Balasundaram c., Heo M.S (2010), Molecular studies, disease status and prophylactic measures in grouper aquaculture: Economic importance, diseases and immunology, Aquaculture 309: 1-14 [16] Harikrishnan R., Kim J.S Balasundaram c., Heo M.S (2012) Vaccination effect of liposomes entrapped whole cell bacterial vaccine on immune response and disease protection in Epinephelus bruneus against Vibrio harveyi, Aquaculture 342-343: 69-74 [17] Honda T., Iida T (1993),The pathogenicity ofVibrio parahaemolyticus& the role of thermostable direct hemolysin & related hemolysins Rev Med Microbiol 4: 106-113 [18] FriesenJ.D Archambault J (1993), Genetics of eukaryotic RNA polymerases I, II, and III Microbiology and Molecular Biology Reviews: 57(3):p 703-724 [19] Kaper J.B., Colwell R.R., Joseph S.W., Colwell R.R., Kaper J.B (1983), parahaemolyticus and related halophilic vibrios Critical Rev Microbiol 10: 77-123 [20] Kaneko T., Colwell R.R (1973), Ecology of Vibrio parahaemolyticus in Chesapeake Bay", Journal of Bacteriology 113: 24-32 SV: Đàm Thận Quản; Lớp: 11-02 50 Khoa Công Nghệ Sinh Học Viện Đại Học Mở Hà Nội [21] Kazuyuki K Shigeko T., Hiroo I (1979), Effect of Mediumon Flagellation of Vibrio parahaemolyticus, Appied and Environmental Microbioogyl 37:1248-1249 [22] KumarK.P Chatterji D (1992), Differential inhibition of abortive transcription initiation at different promoters catalysed by E.coli RNA polymerase - effect of Rifampicin on purine or pyramidine-initiated phosphodiester synthesis, Federation of European biochemical societiesletterĩOố (1): 46 -50 [23] Lee, A.S.G., Irene H.K., Lim, Lynn L.H Tang Sin Yew Wong,(2005) High frequency of mutations in the rpoB gene in Rifampicin - resistant clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis from Singapore Journal of Clinical Microbiology, 43(4): 2026 - 2027 [24] Nash G„ Anderson I.G., Shariff M„ Shamsudin M.N (1987) Bacteriosis associated with epizootic in the giant sea perch, Lates calcarifer, and the estuarine grouper, Epinephelus tauvina, cage cultured in Malaysia, Aquaculture 67:105- 111 [25] Nishibuchi M., Kaper J.B (1995), Thermostable direct hemolysin gene of Vibrio parahaemolyticus a virulence gene acquired by a marine bacterium, infection and immunity 63(6): 2093-2099.'ỵQỴỵ Đại Ị-JỌC Mó' Hà Nội [26] Nishibuchi M., Kumagai K„ Kaper J.B (1991), Contribution of the tdhl gene of Kanagawa phenomenon-positive Vibrio parahaemolyticus to production of extracellular thermostable direct hemolysin Microbial Pathogeness 11: 453-460 [27] Tuyet D.T., Thiem V.D., Von S.L., Chowdhury A Park E., Canh D.G., Chien B.T Van T.T., Naficy A., Rao M.R., All M Lee H„ Sy T.H Nichibuchi M„ Clemens J., Trach D.D (2006), Clinical, epidemiological, and socioeconomic analysis of an outbreak of Vibrio parahaemolyticus in Khanh Hoa Province, Vietnam Journal of Infectious Diseases 186( 11): 1615-1620 [28] Shyne A.P.S, Sobbhana K S, George K c, Paul R.R (2008) Phenotypic characteristics and antibiotic sensitivity of Vibrio parahaemolyticus strains isolated from diseases grouper (Epinephelus spp.), journal of the marine biological association 50: 1-6 [29] Van W.B (2008),A history of fish immunology and vaccination The early days Fish Shellfish Immunol 25: 397-408 SV: Đàm Thận Quảng Lớp: 11-02 51 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học [301 Zhang X.H., Austin B (2005),A review haemolysins in Vibrio species Journal of Applied Microbiology 98: 1011-1019 [31] Zulkifli Y, Alitheen N.B., Son R„ Yeap S.K., Lesley M.B Raha A.R (2009), Identification of Vibrio parahaemolyticus isolates by PCR targeted to the toxR gene and detection of virulence genes International Food Research Journal 16: 289-296 Tài liệu internet [32] http://doc.edu.vn/tai-lieu/de-tai-tim-hieu-ve-vibrio-sp-gay-benh-tren-thuy-san- 11372/ [33] http://www.tuamvisinh.com/tin-tuc/kiem-tra-dinh-tinh-vibrio-cholera-vibrioparahaemolyticus.html [34] http://vi.wikipedia.org/wiki/T%E %BB%AD_ngo%E %BA%A1 i Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội SV: Đàm Thận Quảng Lớp: 11-02 52 ... "Nghiên cứu tạo dòng vi khuẩn Vibrio parahaemoỉyticus nhược độc phục vụ chế tạo vắc- xin phòng bệnh hoại từ thận số loại cá biển. " làm sớ ban đầu hướng dến vi? ??c sàn xuất vắc? xin bệnh hoạt tứ gạn thận. .. nhiều loại vắc- xin vi khuẩn cho cá với phương thức chế tạo khác nghiên cứu vắc- xin bất hoạt kết hợp đa kháng nguyên, vắc- xin sống nhược độc, vắc- xin có bố sung loại chất bồ trợ khác Vi? ??c sử dụng vắc- xin. .. ợ cá biển 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu chung Tạo chung vi khuân Vibrio parahaemolyticus nhược độc có khả tạo khánh báo hộ cá 1.2.2 Mục tiêu cụ thể • Tạo dược dòng vi khuân Vibrio parahaemolyticus