Nguyễn Ngọc Bảo Châu Học viên thực hiện: Cao Thị Thùy Linh Lớp: NN71 Ngày sinh: 06/08/1999 Nơi sinh: Gia Lai Tên đề tài: PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC VI KHUẨN Latic KHÁNG Vibrio parahaemolyticus
TỔNG QUAN
Tổng quan về ngành tôm
1.1.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới và tại Việt Nam:
Hiện nay, nuôi tôm là một ngành kinh tế quan trọng trên toàn thế giới với khoảng 50 nước tham gia Trong đó, Đông Nam Á, Trung Quốc, Ấn Độ, Mỹ và Trung Đông là những khu vực nuôi tôm trọng điểm, cung cấp một nguồn cung đáng kể cho thị trường toàn cầu.
Nuôi tôm là ngành thủy sản phát triển mạnh mẽ trên thế giới, với các loài tôm chính được nuôi là tôm thẻ chân trắng và tôm sú Theo FAO, sản lượng thủy sản toàn cầu năm 2010 đạt 148,5 triệu tấn, được dự đoán sẽ đạt kỷ lục mới 160 triệu tấn năm 2013 Nuôi trồng thủy sản đóng góp 59,9 triệu tấn trong sản lượng này, bao gồm 56,4% cá nước ngọt, 23,6% nhuyễn thể, 9,6% giáp xác, 6% cá nước lợ, 3,1% cá nước mặn và 1,4% động vật thủy sản khác.
Theo Tổng Tục Thủy Sản Việt Nam năm 2020 sản lượng tôm của nước ta đạt
556 nghìn tấn, trong đó tôm sú đạt 185 nghìn tấn, tôm Thẻ Chân Trắng đạt 366 nghìn tấn tăng 3 % so với cùng kì năm 2019
Trong 9 tháng đầu năm 2020, Trà Vinh thả nuôi hơn 6,4 tỷ con giống thủy sản, diện tích nuôi 55.776 ha, thu hoạch 110.820 tấn, đạt 75,39% kế hoạch và tăng 10.418 tấn so với cùng kỳ năm trước Vùng nước mặn, lợ thả nuôi 1,62 tỷ con tôm sú, diện tích 24.301 ha; 4,37 tỷ con tôm thẻ chân trắng, diện tích 6.548 ha; 185 triệu con cua biển, diện tích 22.759 ha, thu hoạch 61.162 tấn, cao hơn cùng kỳ 5.893 tấn Tuy nhiên, đầu vụ nuôi do chênh lệch nhiệt độ giữa ngày và đêm lớn, 151 triệu con tôm sú và 670 triệu con tôm thẻ chân trắng mới thả nuôi bị thiệt hại.
SVTH: CAO THỊ THÙY LINH 11 thiệt hại, chủ yếu là bệnh gan tụy, đốm trắng, đỏ thân, vi bào tử trùng, phần lớn tôm chết chủ yếu là ao đất ở giai đoạn từ 25 - 40 ngày tuổi ở một số xã của huyện Châu Thành, Cầu Ngang, Trà Cú, thị xã Duyên Hải Vùng nước ngọt, thả nuôi 261 triệu con tôm, cá giống các loại, diện tích 1.904,5 ha (cá lóc 182,4 triệu con, diện tích 320 ha); thu hoạch 49.657 tấn, cao hơn cùng kỳ 4.524 tấn
1.1.2 Sơ lược về vi khuẩn Vibrio sp gây bênh trên động vật thủy sản
Chi: Vibrio Đặc điểm chung của các vi khuẩn Vibrio: hình que thẳng hoặc hơi cong, Gram âm, không hình thành bào tử, chuyển động nhờ một tiêm mao hoặc nhiều tiêm mao, yếm khớ tựy nghi, kớch thước 0,3- 0,5 x 1,4-2,6àm, lờn men trong mụi trường O/F Glucose Hầu hết các loài đều phát triển trong môi trường nước biển cơ bản, Na+ kích thích cho sự phát triển của tất cả các loài Vibrio, chúng không phát triển trong môi trường không muối NaCl, chúng không sinh H2S , mẫn cảm với Vibriostat 2.4 diamino
- 6,7 diisopropyl pteridine phosphat (O/129) Cơ bản chúng sống trong môi trường nước biển và cửa sông (vùng nước lợ) (Nguyễn Thị Minh Trang, 2013)
Vibrio sp thường gây bệnh chủ yếu ở động vật thủy sản nước mặn và nước ngọt Κhi động vật thủy sản bị sốc do biến đổi môi trường xấu hoặc bị nhiễm virus, nấm, ký sinh trùng, Chúng sẽ nhân cơ hội thâm nhập vào vật chủ và gây bệnh Sức đề kháng động vật của thủy sản không có nên khi vibrio sp xâm nhiễm sẽ gây bệnh nặng và dẫn đến chết rải rác và hàng loạt
SVTH: CAO THỊ THÙY LINH 12
Hình 1.1 : Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus (Wu et al., 2014)
Bảng 1.1 : Một số bệnh ở động vật thủy sản do Vibrio sp gây ra (Bùi Quang
STT Tên bệnh Giai đoạn Vibrio gây bệnh Tác hại
1 Bệnh phát sáng Ấu trùng, giống
2 Bệnh đổ dọc thân Ấu trùng giống V.alginolyticus Gây chết rải rác
3 Bệnh đỏ thân Tôm thịt Vibrio spp Gây chết rải rác
4 Bệnh vỏ hay ăn mòn kitin, đen mang ở các giai đoạn tôm, cua
Gây chết rải rác, hàng loạt
5 Nhiễm khuẩn ở cá Cá đầm nuôi, lông
Vibrio spp Gây chết rai rác
SVTH: CAO THỊ THÙY LINH 13
⮚ Trạng thái của động vật thủy sản khi nhiễm Vibrio sp
Tôm nổi lên bề mặt ao, dạt bờ kéo đàn bơi lòng vòng Trạng thái của tôm cua khi bị nhiễm khuẩn thì hôn mê, lờ đờ, kém ăn hoặc bỏ ăn Tôm có sự biến đổi màu đỏ hay xanh Tôm cua vỏ bị mềm và xuất hiện các vết thương hoại tử ăn mòn trên vỏ và các phần phụ
Nhiễm khuẩn Vibrio spp trên tôm sú biểu hiện đa dạng về triệu chứng lâm sàng: ấu trùng tôm bị bệnh đỏ dọc thân, tôm sú bị bệnh đỏ thân, tôm sú bị bệnh đỏ chân, đuôi tôm sú bị ăn mòn, đuôi tôm sú bị hoại tử, đuôi tôm sú bị đỏ, đuôi tôm sú bị phồng, tôm sú bị bệnh các phần phụ (râu, chân bò, chân bơi, đuôi) ăn mòn cụt dần.
SVTH: CAO THỊ THÙY LINH 14
1.2 Tổng quan về vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
V parahaemolyticus là trực khuẩn, Gram âm, hiếu khí và kị khí không bắt buộc, di động bằng tiêm mao và có khả năng trượt trên bề mặt môi trường có độ nhớt cao (McCarter et al., 1999) Nghiên cứu bộ gen của V parahaemolyticus đã xác định được gen mã hoá hemolysin không bền nhiệt (TLH - thermolabile haemolysin) là gen đặc hiệu của loài, gen mã hoá hemolysin bền nhiệt (TDH – thermostable direct haemolysin) mã hoá protein TDH có tác dụng làm vở tế bào máu và gây tan huyết (Iida et al., 1998; McCarthy et al., 1999) Vi khuẩn này còn có thể tiết ra protease và phospholipase làm bất hoạt enzyme gây đông máu ở tôm (Lee et al.,
V parahaemolyticus tồn tại phổ biến ở hệ sinh thái nước mặn và vùng cửa sông trong đó có các ao nuôi, đặc biệt ở các khu vực Đông Nam Á (Wong et al., 2000)
Nó có thể tồn tại tự do trong môi trường nước và nền đáy, bám trên bề mặt ngoài và xâm nhập vào bên trong cơ thể của các động vật phù du, cá và giáp xác (Kaneko and Colwell, 1973; Kaneko and Colwell ,1975) và phát triển tốt hơn so với các loài vi khuẩn khác trong điều kiện nhiệt độ và độ mặn tương đối cao (Williams and Larock., 1985) Theo Twedt et al (1969) V parahaemolyticus có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ dao động từ 22 – 42ºC với nhiệt đố tối ưu là 37ºC, ngưỡng pH 5 –
11 và nồng độ muối 1 – 7 % Khi nghiên cứu về sự tồn tại của loài vi khuẩn này trong các sản phẩm thủy hải sản đông lạnh khác nhau Vanderzant and Nickelson
SVTH: CAO THỊ THÙY LINH 15
(1972) cho biết V parahaemolyticus có thể tồn tại trong khoảng pH từ 5 – 10 và chỉ vô hoạt ở nhiệt độ 80 – 100 ºC trong 15 phút
V parahaemolyticus có khả năng gây dịch bệnh trên người và động vật thủy sản như tôm, cua, nhuyễn thể đặc biệt tôm là loài tương đối nhạy cảm với vi khuẩn này trong tất cả các giai đoạn phát triển (Xie et al., 2005; Lightner, 1996) Trên tôm, V parahaemolyticus thường được phân lập trong máu và gan tụy (Lighner, 1996; Bruno et al., 1998; Sung et al., 2001) Các chủng V parahaemolyticus cùng với V harveyi, V vulnificus gây chết hàng loạt trên tôm nuôi ở Thái Lan (Nash et al., 1992) và Philiphine (Lavilla – Pitogo et al., 1998) có liên quan đến một số bệnh nhiễm khuẩn cục bộ và nhiễm khuẩn trên gan tụy trên tôm sú (Lightner, 1996).
Hội chứng hoại tử gan tụy – cấp (Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome –
Bệnh do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra, bệnh xuất hiện vào năm
Tôm ở Việt Nam đã hứng chịu thiệt hại nặng nề vào năm 2011, đặc biệt là ở vùng Đồng bằng sông Cửu Long, do dịch bệnh do Vibrio parahaemolyticus gây ra Kết hợp với phage độc lực, vi khuẩn này sản sinh ra một loại độc tố mạnh phá hủy mô và gây rối loạn chức năng gan tụy Tôm bị bệnh gan tụy cấp biểu hiện triệu chứng lâm sàng như gan tụy teo, dai, vỏ mềm, ruột rỗng và đôi khi có các đốm đen nhìn thấy bằng mắt thường Tôm có thể chết ngay sau 2-4 ngày phát bệnh (Đặng Thị Hoàng Oanh và cộng sự, 2012)
Theo Lightner., et al (2013) năm 2009 bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm biển lần đầu tiên được phát hiện hay còn được gọi là “Hội chứng tôm chết sớm- EMS (Early Mortality Syndrome)” Dựa trên mô tả bệnh tích cấp tính năm 2011 một tên mới được đặt ra gọi là “Hội chứng gan hoại tử cấp” (AHРNS- Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome) Vào năm 2013 tên gọi “bệnh hoại tử gan tụy cấp” (AHPND- Acute Heapatopancreatic Necrosis Disease) được dùng khi tác nhân gây bệnh được xác định Bệnh gây tác hại lớn trên tôm sú, tôm Thẻ Chân Trắng ở các trang trại nuôi tôm Mê Hi
SVTH: CAO THỊ THÙY LINH 16
Căn bệnh AHNPD ban đầu được xác định là bệnh không rõ nguyên nhân do không thể xác định một mầm bệnh cụ thể Tuy nhiên, vào đầu năm 2013, phòng nghiên cứu Bệnh học Thủy sản của Đại học Arizona (UAZ-APL) đã phân lập được vi khuẩn Vibrio Parahaemolyticus từ các mẫu bệnh tại Việt Nam và Mexico, chính thức xác định đây là tác nhân gây bệnh AHNPD.
Sơ lược về vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic bao gồm một số giống: Carnobacterim, Enterococcus, Lactpbacillus, Lactococcus, Lactosphaera, Leuconostoc, Melissococcus, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus và Weissella thuộc ngành Fermicute (Ercolini et al., 2001)
Vi khuẩn lactic thuộc nhóm vi khuẩn gram dương (Fooks et al., 1999), lên men carbon hydrate cacbon khi có hoặc không có oxy và tạo sản phẩm cuối cùng là acid lactic (Jay, 2000) Nhóm vi khuẩn lactic này còn sản xuất ra các hợp chất hữu cơ tạo ra mùi thơm và hương vị cho các sản phẩm lên men (Caplice & Fizgerald, 1999)
Theo khóa phân loại Bergey (2001) vi khuẩn Lactic được xếp vào 4 họ:
Lactobacillaceae, Enterococcaceae, Leuconoscaceae, Streptococcaceae, thuộc:
SVTH: CAO THỊ THÙY LINH 17
1.4.1 Thành phần kháng khuẩn được sinh ra từ vi khuẩn lactic
Tác động kháng khuẩn chủ yếu được sinh ra từ vi khuẩn lactic chủ yếu là acid lactic và các sản phẩm acid hữu cơ do chúng sinh ra Chúng sinh acid làm giảm pH môi trường sống của các vi sinh vật khác (Caplice & Fitzgerald, 1999; Kuipers et al.,
2000) Ở pH thấp acid hữu cơ sẽ chuyển thành lipid hòa tan và khuyếch tán qua màng tế bào chất (Gottschalk, 1988)
Ngoài ra vi khuẩn lactic cũng sinh ra các hợp chất kháng khuẩn khác như: acetadehyde, H2O2, CO2, đường đa, diacetyl và bacteriocins (Caplice & Fitzgerald; de Vuyst & Degee, 1999)
1.4.2 Phân lớp vi khuẩn lactic từ bacteriocin
Các vi khuẩn được phân loại dựa trên cấu trúc cơ bản của phân tử, trọng lượng phân tử, các biển đổi sau dịch mã và đặc điểm di truyền
SVTH: CAO THỊ THÙY LINH 18
Bảng 1.2 : Các lớp và tính chất bacteriocin từ vi khuẩn lactic (Mokoena, M
Lớp Các loài sản xuất điển hình
Chứa các acid amin duy nhất là lanthionine và methyllanthionine;
IIa Leuconostoc gelidum Các peptit bền nhiệt, không biến tính, cation, kỵ nước; chứa một peptit đầu kép glycine; peptit giống pediocin; 30 kDa lysostaphin, enterolysin A, helveticin J
SVTH: CAO THỊ THÙY LINH 19
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
SVTH: CAO THỊ THÙY LINH 20
2.1 Thời gian và địa điểm Thực hiện
- Địa điểm: Công ty cổ phần Mỹ Lan
2.2 Vật liệu và dụng cụ thí nghiệm
2.2.2 Dụng cụ và hóa chất
SVTH: CAO THỊ THÙY LINH 21
2.3.1 Thu thập và lưu trữ mẫu
Mẫu tôm, cá, bùn, nước nuôi tôm được thu ở thị xã Duyên hải, thị trấn Cầu Kè, thị trấn Trà Cú trên địa bàn tỉnh Trà Vinh Mẫu ao tôm nuôi thâm canh, quảng canh kích cỡ tôm 20 g/con Mẫu cá rô phi khỏe được thu ở các ao kết hết hoặc các ao tự nhiên Kích cỡ các thu mẫu khoảng 100 g/con Mẫu bùn cũng được thu ở các ao nuôi thâm canh và quảng canh Mẫu nước nuôi tôm được thu ở những điểm khác nhau trong ao (đầu, giữa và cuối ao) Mẫu nước của cùng một ao sau khi thu về sẽ cho trộn lẫn vào nhau
Các mẫu được bảo quản lạnh ở nhiệt độ 4 độ C để đưa về phòng thí nghiệm rồi phân tích ngay Chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus được cung cấp bởi Phòng Nghiên cứu và Phát triển vi sinh thuộc Công ty Cổ phần Mỹ Lan, Trà Vinh.
Mẫu tôm và cá sau khi đem về được khử trùng bằng cồn 70º tráng lại bằng nước cất vô trùng tiến hành giải phẫu tách lấy phần ruột Ruột sau tách được đem ghiền nhuyễn với 5ml nước muối sinh lí vô trùng đến dung dịch đồng nhất, hút 1ml dịch vào 5ml môi trường MRS, ủ ở 37ºC, 48 giờ Mẫu sau tăng sinh tiến hành pha loãng trong nước 0,85% NaCl ở nồng độ: 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 , 10 -4 , 10 -5 , 10 -6 , Hỳt 50àL dịch pha loãng trải trên đĩa môi trường MRS agar bổ sung 1% CaCO 3 , ủ ở 48 giờ, 37 ºC
Tiến hành cân 1 g mẫu bùn hòa trong 9 ml nước muối sinh lí, dùng micropipet hút 1mL dịch nổi vào 5 mL môi trường MRS ủ 48h, 37ºC Đối với mẫu nước nuôi tôm hút trực tiếp 1ml tăng sinh trong 5mL môi trường MRS ủ 37ºC Mẫu sau tăng sinh cũng được pha loãng ở các nồng độ và trải trên môi trường MRS agar tương tự như mẫu ruột các và tôm
Sau khi ủ chọn những khuẩn lạc có vòng tan CaCO3 tiếp tục cấy ria trên đĩa thạch môi trường MRS agar đến khi khuẩn lạc có hình dáng kích thước và màu sắc giống nhau
SVTH: CAO THỊ THÙY LINH 22
Khuẩn lạc sau khi làm thuần sẽ được quan sát dưới kính hiển vi, chọn những khuẩn lạc Gram dương, có hình cầu hoặc que Thử nghiệm một số khả năng sinh hóa của vi khuẩn lactic bằng một số test sinh hóa: nhuộm Gram, test catalase, khả năng sinh Indol, di dộng, gelatinase, khả năng sinh bào tử., oxidase… để định danh sơ bộ vi khuẩn thuộc chủng lactic
Trữ các dòng thuần trong môi trường MRS broth bổ sung 25% glycerol, -80ºC để thực hiện các thí nghiệm kế tiếp
2.3.3 Sàng lọc vi khuẩn lactic bằng các chỉ tiêu hình thái, sinh lí và sinh hóa
Các khuẩn lạc sau khi được làm thuần trên môi trường MRS agar được đem đi quan sát đại thể, vi thể Thử nghiệm một số test sinh hóa để định danh sơ bộ vi khuẩn lactic từ các chủng phân lập được
Chỉ tiêu hình thái và các đặc tính sinh hóa được quan sát theo Kandler and Wiss,
Mục đích: Xác định vi khuẩn Gram âm hay Gram dương
Nguyên tắc: Vi khuẩn Gram dương có thành tế bào dày, dạng lưới cấu tạo bởi peptidoglycan có khả năng giữ được phức hợp tím tinh thể i-ot Vi khuẩn Gram âm có lớp peptidoglycan mỏng nên sau bước khử màu sẽ không giữ lại được phức hợp tím tinh thể i-ot
Khử trùng lamen và lam kính bằng cồn 96º Lấy 1 giọt nước cất vô trùng nhỏ lên giữa kính mang vật Khử trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội Sau đó lấy một ít vi sinh vật rồi trải mỏng trên kính mang vật Hơ thật nhanh trên ngọn lửa đèn cồn để cố định mẫu trên kính mang vật Nhỏ 1-2 giọt Crystal Violet lên kính mang vật có cố định mẫu, dùng que cấy trải đều Crystal Violet, giữ yên trong 2 phút, rửa lại bằng nước cất vô trùng Tiếp tục nhỏ 1-2 giọt Lugol rồi tải đều bằng que cấy để yên trong 1 phút, rửa lại bằng nước cất vô trùng Rửa lại bằng cồn 96º thật nhanh sao cho kính mang vật không còn bám màu tím của Crystal Violet Nhỏ từ 1-2 giọt SafaminO rồi
Tiến hành trải mẫu vi khuẩn lên phiến lam sạch bằng que cấy, sau đó để yên một phút cho mẫu khô tự nhiên Tiếp theo, rửa mẫu bằng nước cất vô trùng rồi thấm khô bằng giấy thấm Cuối cùng, quan sát mẫu đã nhuộm dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 100X.
Thử khả năng di động trên môi trường thạch mềm 0,5% agar
Nguyên tắc: Một số vi khuẩn có tiêm mao (Flagella) nên có khả năng di động trong môi trường bán lỏng hoặc làm đục môi trường hay mọc giống như rễ cây xung quanh đường cấy
Tiến hành: Lấy sinh khối của vi khuẩn bằng que cấy thẳng, cấy thẳng đứng từ trên xuống dưới trong môi trường thạch bán lỏng, ủ 24 giờ, 37ºC Đọc kết quả: Di động (+) vi khuẩn mọc lan ra khỏi đường cấy Κhông di động (- ) vi khuẩn chỉ mọc trên đường cấy
Nguyên tắc: Enzyme catalase thường gặp ở vi khuẩn hiếu khí tuyệt đối hay tùy nghi Catalase có khả năng phân giải peroxyde tạo O2 và nước
Cách tiến hành: Tiến hành lấy sinh khối của vi khuẩn lên lam kính, nhỏ H2O2 lên sinh khối của vi khuẩn Đọc kết quả: có sủi bọt catalase (+), không sủi bọt catalase (-)
Xác định khả năng sử dụng Citrate
Cơ chế: Vi khuẩn có ezyme citrate permease có khản năng sử dụng citrate trong môi trường có Na.citrate làm nguồn carbon duy nhất Khi sử dụng Citare chúng nhả ra môi trường ion Na + làm tắng ph môi trường lên Đồng thời những vi sinh vật có khả năng sử dụng Citrate làm nguồn carbon thì cũng có khả năng sử dụng muối vô cơ
NH 4 H 2 PO 4 làm nguồn nito tạo ra NH 3 cũng làm kiềm hóa môi trường, sự thay đổi pH được nhận biết bằng chỉ thị màu Bromothymol blue có trong môi trường Simoms Citrate
Tiến hành: Cấy vi khuẩn lên môi trường Simoms Citrate ủ 37 o C, 24h Đọc kết quả:
- Xanh bromothymol chuyển từ màu lục sang màu xanh dương: Citrate (+)
SVTH: CAO THỊ THÙY LINH 24
- Xanh brothymol vẫn giữ nguyên màu xanh lục: Citrate (-)
Thử khả năng sinh Indol:
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
Kết quả phân lập vi khuẩn từ các nguồn khác nhau
Phân lập được 18 chủng vi khuẩn từ nước ao nuôi tôm, ruột tôm và bùn đáy ao Trong đó phân lập 4 chủng lactic từ nước ao nuôi tôm, 2 chủng lactic từ ruột cá Đáng kể đến là phân lập được 12/18 chủng vi khuẩn lactic phân lập từ ruột tôm và không phân lập được chủng lactic nào từ bùn đáy ao Qua kết quả này cho thấy vi khuẩn lactic tồn tại nhiều nhất ở ruột tôm, kế đến là nước ao nuôi tôm và ruột cá
Dựa vào hình thái, màu sắc và độ nổi của khuẩn lạc, các chủng vi khuẩn phân lập được chia thành 4 nhóm chính: (1) vi khuẩn hình cầu, màu trắng đục, bìa răng cưa và nổi mô gồm CT5 và CT4; (2) vi khuẩn hình cầu, màu trắng trong, bìa răng cưa và chỉ nổi mô duy nhất là CT3; (3) vi khuẩn hình tròn, trắng đục, mọc lan ra môi trường, bìa răng cưa và nổi mô gồm R1.2; (4) vi khuẩn còn lại có hình tròn, trắng đục, bìa nguyên và nổi mô nhiều nhất (13/18), gồm các chủng A2.2, CT2, AO4, AO3, AO1.2, AO1.1, AO5, AO2.1, AO2.2, A1, R1.1, A22 và A4 Kích thước khuẩn lạc của các chủng phân lập dao động từ 0,9-2mm.
SVTH: CAO THỊ THÙY LINH 31
Bảng 3.1 : Đặc điểm hình dáng, màu sắc và kích thước khuẩn lạc
Màu sắc Bìa Độ nổi
1 CT5 2 Cầu Trắng đục Răng cưa Mô
2 CT3 1.5 Cầu Trắng trong Răng cưa Mô
3 A2.2 1 Tròn Trắng đục Nguyên Lài
4 CT2 2.5 Tròn Trắng đục Răng cưa Lài
5 CT4 2 Cầu Trắng đục Răng cưa Mô
6 AO4 1.5 Tròn Trắng đục Nguyên Lài
7 AO3 1.8 Tròn Trắng đục Nguyên Lài
8 AO1.2 2 Tròn Trắng đục Nguyên Lài
9 AO1.1 1 Tròn Trắng đục Nguyên Lài
10 R1.2 1.6 Cầu Trắng đục Răng cưa, lan ra môi trường
11 AO5 2 Cầu Trắng đục Nguyên Lài
12 AO2.1 1.8 Cầu Trắng đục Nguyên Lài
13 AO2.2 2 Cầu Trắng đục Nguyên Lài
14 CT1 1 Tròn Trắng đục Nguyên Lài
15 A1 0.9 Tròn Trắng đục Nguyên Lài
16 R1.1 1 Tròn Trắng trong Nguyên Lài
17 A22 0.9 Tròn Trắng đục Nguyên Lài
18 A4 0.9 Tròn Trắng đục Nguyên Lài
SVTH: CAO THỊ THÙY LINH 32
Các chủng được sàng lọc ban đầu có khả năng phân giải CaCO3 được làm thuần sau đó vi khuẩn được nhuộm Gram quan sát dưới kính hiển vi euromex và đo kích thước bằng phầm mềm ImageFocus Plus V2 kết nối giữa máy tính và kính hiển vi
Dưới kết quả nhuộm Gram cho thấy các chủng được sàng lọc ban đầu tất cả đều bắt màu xanh tím của thuốc nhuộm Violet và không hình thành bào tử Theo hình dạng của tế bào vi khuẩn các chủng được chia làm 2 loại là trực khuẩn và cầu khuẩn Các chủng vi khuẩn dạng tế bào trực khuẩn cú chiều dài dao động từ 1-2.3 àM, vi khuẩn cú dạng tế bào là cầu khuẩn cú kớch thước nhỏ hơn khoảng 0.5 àM đều cú cỏch sắp xếp dạng đám Cụ thể kích thước kết cấu từng chủng được thể hiện ở bảng 3.2
SVTH: CAO THỊ THÙY LINH 33
Hình 3.1: Κhuẩn lạc với hình dáng tiêu biểu của các chủng vi khuẩn phân lập
SVTH: CAO THỊ THÙY LINH 34
Bảng 3.2 : Bảng mô tả hình dáng vi thể của các chủng vi khuẩn
STT Kí hiệu Gram Kích thước (àM)
SVTH: CAO THỊ THÙY LINH 35
Các dòng vi khuẩn sau được quan sát dưới kính hiển vi được sàng lọc chọn những vi khuẩn bắt Gram (+) không sinh bào tử để tiến hành những thử nghiệm sinh hóa của vi khuẩn Tất cả các chủng đều không sinh Indol, không có enzyme catalase, không có khả năng phân giải gelatin và không có khả năng di động Qua thử nghiệm ΚIA cho thấy tất cả các chủng đều có khả năng sử dụng nguồn Carbonhydrate từ đường Glucose và đường Lactose, không sinh khí H 2 S Cụ thể trình bày ở bảng 3.3.
SVTH: CAO THỊ THÙY LINH 36
Bảng 3.3 : Một số đặc điểm sinh lí sinh hóa của các dòng vi khuẩn phân lập được
Biochemical tests are essential for identifying various bacterial characteristics These tests include: 1) Catalase, 2) Oxidase, 3) Citrate utilization, 4) Indole production, 5) Gelatin hydrolysis, 6) Motility, 7) Methyl red, and 8) Voges-Proskauer tests v/v: bacteria utilizes both glucose and lactose.
SVTH: CAO THỊ THÙY LINH 37
Xác định hoạt tính kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus.của chủng vi khuẩn phân lập được
chủng vi khuẩn phân lập được
Hình 3.2 : Vòng kháng khuẩn V paraheamolyticus của các dòng vi khuẩn lactic phân lập được
SVTH: CAO THỊ THÙY LINH 38
Nghiệm thức được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 18 nghiệm thức và 3 lần lặp lại
Bảng 3.4 : Đường kính vòng kháng khuẩn của 4 chủng Lactobacillus spp
*Trong cùng một cột các số có cùng mẫu tự không khác biệt ở mức ý nghĩa
STT Nghiệm thức Đường kính vòng vô khuẩn (mm)
SVTH: CAO THỊ THÙY LINH 39
Có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức trong thí nghiệm (P
