Nghiên cứu thu nhận và đánh giá tính chất của collagen từ vảy cá chẽm bằng phương pháp hóa sinh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG PHAN THỊ PHƯỢNG NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT CỦA COLLAGEN TỪ VẢY CÁ CHẼM BẰNG PHƯƠNG PHÁP HĨA SINH LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HỊA - 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG PHAN THỊ PHƯỢNG NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT CỦA COLLAGEN TỪ VẢY CÁ CHẼM BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA SINH LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành: Mã ngành: Mã học viên: Quyết định giao đề tài: Quyết định thành lập hội đồng: Ngày bảo vệ: Người hướng dẫn khoa học: Công nghệ sinh học 8420201 58CH301 745/QĐ-ĐHNT ngày 28/12/2017 1140/QĐ-ĐHNT ngày 10/09/2019 28/9/2019 TS Nguyễn Văn Hòa PGS.TS Trang Sĩ Trung Chủ tịch Hội Đồng: TS Khổng Trung Thắng Phòng Đào tạo Sau Đại học: KHÁNH HỊA - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan kết đề tài: “Nghiên cứu thu nhận đánh giá tính chất collagen từ vảy cá chẽm phương pháp hóa sinh” cơng trình nghiên cứu cá nhân chưa công bố cơng trình khoa học khác thời điểm Khánh Hòa, tháng năm 2019 Tác giả Phan Thị Phượng iii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài “Nghiên cứu thu nhận đánh giá tính chất collagen từ vảy cá chẽm phương pháp hóa sinh” Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn quý thầy cô giáo Viện Công Nghệ Sinh Học & Môi Trường - Trường Đại học Nha Trang truyền đạt cho kiến thức bổ ích trình học tập thực luận văn Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Văn Hòa PGS.TS Trang Sĩ Trung tận tình dẫn, định hướng, truyền thụ kiến thức suốt trình học tập nghiên cứu Qua tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đồng nghiệp sát cánh, chia sẻ động viên suốt trình học tập thực đề tài Cuối xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, người thân giúp đỡ, khích lệ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Khánh Hòa, tháng năm 2019 Tác giả Phan Thị Phượng iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iii LỜI CẢM ƠN .iv MỤC LỤC .v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH .ix TRÍCH YẾU LUẬN VĂN xi LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung collagen 1.1.1 Thành phần cấu tạo, cấu trúc collagen 1.1.2 Cấu trúc phân tử collagen .6 1.1.3 Cấu trúc sợi collagen .7 1.1.4 Phân loại collagen 1.1.5 Nguồn gốc thu nhận collagen 10 1.1.6 Phương pháp thu nhận 11 1.1.7 Tính chất collagen .13 1.1.8 Ứng dụng collagen 16 1.2 Collagen chiết xuất từ cá 19 1.3 Collagen thủy phân Enzyme Pepsin 21 1.3.1 Collagen thủy phân 21 1.3.2 Enyme Pepsin 22 1.4 Cá colagen chiết xuất từ cá chẽm 23 1.4.1 Đặc điểm sinh học .23 1.4.2 Đặc điểm phân bố 24 1.4.3 Cấu tạo vảy cá .24 1.5 Một số nghiên cứu tách chiết collagen từ cá 26 1.5.1 Nghiên cứu nước .26 1.5.2 Nghiên cứu nước 27 v CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .29 2.1 Đối tượng nghiên cứu .29 2.2 Hóa chất, dụng cụ thiết bị 29 2.3 Phương pháp nghiên cứu 30 2.3.1 Quy trình chiết collagen từ vảy cá chẽm .30 2.3.2 Đánh giá tính chất sản phẩm xử lý số liệu 33 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .40 3.1 Tính chất nguyên liệu vảy cá ban đầu 40 3.2 Tiền xử lý nguyên liệu 40 3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình loại khống 42 3.3.1 Ảnh hưởng nồng độ dung dịch EDTA 42 3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết collagen .45 3.5 Tính chất đặc trưng collagen thu từ vảy cá 47 3.5.1 Cấu trúc hóa học 47 3.5.2 Nhiệt độ biến tính collagen 48 3.5.3 Tinh sản phẩm LMWC 49 3.5.4 Khối lượng phân tử collagen .50 3.5.5 Thành phần axit amin có LMWC 51 3.6 Quy trình đề xuất thu nhận collagen thủy phân 52 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .54 4.1 Kết luận 54 4.2 Kiến nghị 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO .55 PHỤ LỤC vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ASC Axit soluble collagen Collagen hòa tan dung dịch axit BSE Bovine Spongiform Encephalopathy Bệnh bò điên EDTA Ethylen Diamin Tetra axetic Axit Axit ethylendiamin tetra axetic FTIR Fourrier Transformation Infrared Phổ hồng ngoại chuyển đổi HPLC High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu cao Chromatography LMWC Low molecular weight collagen Collagen phân tử lượng thấp PSC Pepsin soluble collagen Collagen hòa tan dung dịch pepsin SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Điện di gel polyacrylamide Gel Electrophoresis vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Thành phần axit amin collagen loại protein khác Bảng 1.2: Sự phân bố amino axit chuỗi polypeptide Bảng 1.3: Phân loại vị trí phân bố loại collagen thể người Bảng 1.4: Nguồn chiết collagen từ biển số loài tiềm 10 Bảng 1.5: Collagen hydrolysate công nghiệp sản xuất bánh kẹo 17 Bảng 1.6: Collagen hydrolysate sử dụng chế biến sữa 18 Bảng 1.7: Collagen hydrolysate trình lọc sản phẩm đồ uống 18 Bảng 1.8: Ứng dụng collagen hydrolysate công nghệ chế biến thịt 18 Bảng 1.9: Thành phần hóa học vảy cá chẽm Châu Âu vảy cá hồng đỏ 25 Bảng 1.10: Thành phần khối lượng số lồi cá có giá trị kinh tế 25 Bảng 3.1: Thành phần hóa học vảy cá chẽm vảy số loài cá khác .40 Bảng 3.2: Kết cảm quan khảo sát nồng độ xử lý protein phi collagen 41 Bảng 3.3: Kết đánh giá cảm quan khảo sát nồng độ khử khoáng 41 Bảng 3.4: Kết đo độ nhớt collagen 48 Bảng 3.5: Thành phần axit amin LMWC 51 viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Công thức cấu tạo hydroxyproline Hình 1.2: Trình tự xếp amino axit phân tử Collagen Hình 1.3: Cấu trúc Tropocollagen (triple helix) Hình 1.4: Liên kết ngang phân tử Tropocollagen Hình 1.5: Cấu trúc procollagen chuyển từ procollagen sang tropocollagen Hình 1.6: Cấu trúc sợi collagen Hình 1.7: Một vài dạng sinh học collagen Hình 1.8: Viên bao nang cứng 16 Hình 1.9: Viên bao nang mềm 16 Hình 1.10: Các bọt collagen có tác dụng cầm máu 17 Hình 1.11: Collagen dùng phẫu thuật thẩm mỹ 17 Hình 1.12: Collagen da 17 Hình 1.13: Mặt nạ collagen thủy phân 17 Hình 1.14: Biểu đồ so sánh hấp thu collagen chiết xuất từ lợn chiết xuất từ cá 19 Hình 1.15: Chiết collagen từ da cá trống đen 21 Hình 1.16: Những lợi ích khác mà collagen thủy phân mang lại cho thể người 21 Hình 1.17: Quá trình phân hủy collagen thành collagen thủy phân 22 Hình 1.18: Cấu trúc Enyme pepsin 22 Hình 1.19: Chức Pepsin ứng dụng 22 Hình 1.20: Cá chẽm 23 Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 30 Hình 2.2: Máy phân tích FTIR 38 Hình 3.1: Ảnh chụp vảy cá trước (bên trái) sau (bên phải) trình tiền xử lý 42 Hình 3.2: Ảnh chụp vảy cá trước (bên trái) sau (bên phải) trình loại khống 42 Hình 3.3: Ảnh hưởng nồng độ EDTA đến hiệu suất loại khoáng vảy cá 43 Hình 3.4: Ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất loại khống vảy cá 44 Hình 3.5: Dịch chiết collagen sau thủy phân 45 ix Hình 3.6: Ảnh hưởng nồng độ axit axetic đến hiệu suất thủy phân LMWC 46 Hình 3.7: Ảnh hưởng tỷ lệ enzyme/vảy cá đến hiệu suất thu hồi LMWC 46 Hình 3.8: Ảnh hưởng thời gian chiết đến hiệu suất thu hồi LMWC 47 Hình 3.9: Phổ FTIR (a) vảy cá, (b) vảy cá sau khử protein phi collagen, (c) LMWC 47 Hình 3.10: Đồ thị độ nhớt collagen 48 Hình 3.11: Kết điện di SDS-PAGE mẫu LMWC thu sau 12 giờ, 18 24 thẩm tích 49 Hình 3.12: Kết điện di SDS-PAGE mẫu LMWC thu sau (a) 36 giờ, (b) 24 giờ, (c) 12 thủy phân 50 Hình 3.13: Phổ sắc ký mẫu LMWC từ vảy cá chẽm 51 x Trong nghiên cứu trước đây, trình loại khoảng từ vảy cá để thu nhận collagen thực việc sử dụng tác nhân khác nhau, bao gồm axit vô (HCl, H2SO4, H3PO4,…) Fengxiang Zhang cộng (2015) sử dụng axit HCl để loại khoáng vảy cá nước [15] thời gian xử lý 90 phút axit hữu (axit axetic, EDTA,…) nghiên cứu khử khoáng vảy cá chép đen EDTA, thời gian 20 ( Rui Duan cộng sự) (2009) [25] Từ nghiên cứu cho thấy sử dụng axit vơ với tính axit mạnh cho thời gian xử lý nhanh, hiệu xử lý cao, nhiên axit mạnh cắt mạch collagen, gây oxy hóa vị trí hoạt động Hơn nữa, nước thải có chứa axit mạnh có nguy gây nhiễm cao thải mơi trường, cịn xử lý u cầu chi phí cao Để giải nhược điểm trên, việc sử dụng tác nhân axit hữu cần thiết Để khảo sát ảnh hưởng thời gian, tiến hành thí nghiệm sử dụng dung dịch EDTA với nồng độ 0,5 M với thời gian ngâm khác (6, 12, 24, 36, 48 giờ), cố định nhiệt độ (4oC), tỷ lệ vảy cá/dung dịch EDTA (1:10 w/v) để tìm thời gian thích hợp cho q trình loại khống Kết thu trình bày Hình 3.4 Kết thu cho thấy với thời gian phản ứng 48 hàm lượng khống cịn lại nhỏ 1% theo TCVN 9939:2013 tiêu chuẩn EU- Quy định (EC) số 853/2004 Nghị viện hội đồng Châu Âu ngày 29/4/2004 cho thực phẩm có nguồn gốc từ động vật [34] (số liệu cụ thể Bảng 2-Phụ lục) Kết tương tự công bố trước thu nhận collagen từ loại vảy cá kháu Do đó, q trình loại khống EDTA nồng độ 0,5 M thời gian 48 đề xuất Tuy nhiên, tương tư trường hợp khảo sát thời gian trên, sau phản ứng hàm lượng khoáng bị loại lớn đạt đến 98%, sau hiệu loại bỏ tăng lên khơng đáng kể Do đó, tùy vào yêu cầu độ tinh khiết sản phẩm mà quy trình thu nhận để lựa chọn thời gian phản ứng phù hợp Hình 3.4: Ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất loại khoáng vảy cá 44 3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết collagen Quá trình thu nhận dịch thủy phân collagen (hay LMWC) trình cắt mạch collagen tác nhân khác nhau, thường axit hữu cơ, enzyme, kết hợp hai tác nhân Khi kết thúc phản ứng, lọc rửa thu dịch thủy phân collagen Sau đó, dung dịch chứa LMWC tinh chế thẩm tách loại nước (thường sử dụng sấy phun sấy thăng hoa) để thu nhận LMWC dạng bột Trong nghiên cứu này, khảo sát hai trường hợp sử dụng tác nhân axit axetic kết hợp axit axetic với pepsin Dung dịch LMWC tinh thẩm tách túi làm vật liệu cellulose, mục đích loại ion phân tử có kích thước nhỏ Sản phẩm bột LMWC dạng bột thu phương pháp sấy thăng hoa Sản phẩm thu có màu trắng ngà, độ ẩm thấp, có độ xốp hòa tan nước dễ dàng Khi sử dụng axit axetic để thủy phân collagen, thông số khác giữ cố định gồm nhiệt độ phản ứng (4oC), tỷ lệ vảy cá/dung dịch axit (1:10 w/v), thời gian (48 giờ) với nồng độ axit axetic 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 0,7 M Hình 3.5 cho thấy dịch chiết collagen sau thủy phân axit axetic 0,5 M (AA 0,5M) hỗn hợp axit axetic 0,5 M + pesin 0,01% (AA + PS) AA + PS AA 0,5M Hình 3.5 Dịch chiết collagen sau thủy phân Hình 3.6 trình bày kết hàm lượng bột LMWC thu sử dụng dung dịch axit có nồng độ khác Theo đó, tăng nồng độ hiệu suất thủy phân tăng Tại nồng độ axit thấp (0,3 0,4M), hiệu suất thu hồi collagen thấp phần collagen chưa bị thủy phân nên bị loại bỏ lọc tách trước giai đoạn tinh chế Tại nồng độ axit cao (0,6 0,7M), lượng collagen thủy phân thu hồi không cao so với nồng độ 0,5M Do đó, nồng độ axit axetic 0,5M lựa chọn cho thí nghiệm (số liệu cụ thể Bảng 3-Phụ lục) 45 Hình 3.6: Ảnh hưởng nồng độ axit axetic đến hiệu suất thủy phân LMWC Khi sử dụng axit axetic kết hợp pepsin để thủy phân collagen, thông số khác giữ cố định gồm nhiệt độ phản ứng 4oC, tỷ lệ da cá/dung dịch thủy phân (1:10 w/v), thời gian phản ứng (48 giờ), nồng độ axit axetic (0,5M) với tỷ lệ enzym/vảy cá thay đổi (0,050; 0,075; 0,100; 0,200; 0,300 wt.%) Hình 3.7 trình bày kết hàm lượng bột LMWC thu sử dụng pepsin có nồng độ khác Theo đó, tăng nồng độ hiệu suất thu hồi tăng Tại nồng độ enzym (0,050 0,075 wt.%), hiệu suất thu hồi collagen thủy phân thấp phần collagen chưa bị thủy phân nên bị loại bỏ lọc tách, trước giai đoạn tinh chế Tại nồng độ enzym (0,200 0,300 wt.%), lượng collagen thu hồi không cao nhiều so với nồng độ 0,100 wt.%, (số liệu cụ thể Bảng 4-Phụ lục) Do đó, tỷ lệ enzym/vảy cá 0,100 wt.% đề xuất cho trình thủy phân collagen Hình 3.7: Ảnh hưởng tỷ lệ enzyme/vảy cá đến hiệu suất thu hồi LMWC 46 Khi sử dụng axit axetic kết hợp pepsin để thủy phân collagen với thời gian thủy phân khác (12, 24, 36, 48, 72 giờ), thông số khác giữ cố định gồm nhiệt độ (4oC), tỷ lệ da cá/dung dịch thủy phân (1:10 w/v), nồng độ axit axetic (0,5M), tỷ lệ enzym/vảy cá (0,100 wt.%) Hình 3.8 trình bày kết hàm lượng bột LMWC thu thủy phân với thời gian khác Theo đó, tăng thời gian hiệu suất thu hồi tăng Tuy nhiên, tăng lên đến 48 giờ, lượng collagen thu khơng tăng nhiều so với thời gian 36 giờ, (số liệu cụ thể Bảng 5-Phụ lục) Do đó, thời gian thủy phân 36 đề xuất cho trình thủy phân collagen Hình 3.8: Ảnh hưởng thời gian chiết đến hiệu suất thu hồi LMWC 3.5 Tính chất đặc trưng collagen thu từ vảy cá 3.5.1 Cấu trúc hóa học Cấu trúc hóa học vảy cá trước sau khử protein phi collagen LMWC đánh giá dựa phổ FTIR (Hình 3.9) Hình 3.9 Phổ FTIR (a) vảy cá, (b) vảy cá sau khử protein phi collagen, (c) LMWC 47 Quan sát cho thấy giống khác biệt diện nhóm chức mẫu phân tích Tất mẫu xuất đỉnh đặc trưng cho nhóm chức amin I (1654 - 1653 cm1), amin II (1552 - 1544 cm1), amin III (12431244 cm1) phân tử collagen So sánh với mẫu vảy cá chép đen Rui Duan tương đương [25], so với phổ nghiên cứu vảy cá rô phi (1675-1642 cm-1 1601-1536 cm-1) Izzati H (2017) hẹp Tuy nhiên, khác biệt lớn xuất đỉnh phổ mẫu vảy cá trước sau khử protein phi collagen bước sóng 1037 565 cm1 Hai đỉnh đặc trưng cho liên kết P-O Ca-O phân tử hydroxyapatite (Ca5(PO4)3OH)) [17] Khơng có xuất đỉnh chất lạ mẫu collagen thủy phân, chứng tỏ sản phẩm LMWC có độ tinh khiết cao, có tiềm lớn ứng dụng sau 3.5.2 Nhiệt độ biến tính collagen Nhiệt độ biến tính (Td) xác định phép đo độ nhớt Giá trị Td collagen, định nghĩa nhiệt độ mà độ nhớt giảm nửa Bảng 3.4: Kết đo độ nhớt collagen Nhiệt độ ( C) Độ nhớt (cP) Độ nhớt tương đối (cP) 25 4,80 1,00 30 4,19 0,80 35 3,84 0,68 38 3,30 0,50 40 3,21 0,47 45 2,85 0,35 50 2,10 0,10 55 1,80 O Hình 3.10 Đồ thị độ nhớt collagen 48 Hình 3.10 cho thấy độ nhớt LMWC giảm tăng nhiệt độ Theo đó, nhiệt độ biến tính LMWC thu từ vảy cá (khi độ nhớt tương đối 0,5) từ 37oC Theo kết nghiên cứu Rui Duan cộng (2009) [25], độ nhớt tương đối da xương, vảy cá chép gần ổn định phạm vi nhiệt độ 14 ÷23oC Tuy nhiên, giảm liên tục đun nóng tới 34oC Vậy, Td da cá chép ASC, ASC xương ASC khoảng 28oC Tuy nhiên, Td da cá tuyết xác định 15o C So với collagens từ số loài sinh vật biển, Td collagen từ da cá chép, xương da đầu cao so với collagens từ da cá minh thái Alaska (16,8 C), bong bóng cá (18,4oC) (Kimura & Ohno, 1987) , cá thu (26.1oC), thu đao (23oC), cá hồi (19.4oC) (Kimura, Zhu, Matsui, Shijoh, & Takamizawa, 1988), da cá vược Nhật (26.5oC) (Nagai cộng sự, 2002) Nhìn chung, Td collagen từ cá nước lạnh thấp cá nước ấm (Takah ashi & Yokoyama, 1954) Như vậy, nhiệt độ biến tính collagen thủy phân từ vảy tương đối cao so với loài cá khác Tuy nhiên, thấp so với collagen chiết từ da bê (40,8oC) (Komsa-Penkova, Koyonava, Kostov, & Tenchov, 1999) 3.5.3 Tinh sản phẩm LMWC Khi tiến hành thẩm tích dung dịch Na2HPO4 0,01M thời gian 12; 18 24 Kết phân tích điện di cho thấy độ tinh mẫu tăng lên kéo dài thời gian thẩm tích (Hình 3.11) Hình 3.11: Kết điện di SDS-PAGE mẫu LMWC thu sau 12 giờ, 18 24 thẩm tích 49 Khi tiến hành với khoảng thời gian ngắn (12 18 giờ), phổ thu khơng phân tách rõ ràng (Hình 39a 39b) Điều giải thích tồn ion mang điện sản phẩm, muối chưa loại bỏ hồn tồn Trong đó, mẫu thẩm tích 24 cho thấy tách rõ rang nhóm phân tử LMWC 3.5.4 Khối lượng phân tử collagen Các mẫu PSC từ vảy cá chẽm phân tích điện di gel acrylamide 15% , thời gian giờ, lượng mẫu load 10ul Ta thu kết hình đây: Hình 3.12: Kết điện di SDS-PAGE mẫu LMWC thu sau (a) 36 giờ, (b) 24 giờ, (c) 12 thủy phân Kết từ Hình 3.12 cho thấy LMWC có khối lượng phân tử phân bố chủ yếu khoảng từ 10 – 100 kDa mẫu thủy phân kết hợp axit axetic pepsin thời gian khác Mẫu thủy phân 36 thu LMWC với Mw chủ yếu khoảng 10 kDa, mẫu thủy phân sau 12 24 cho sản phẩm với trọng lượng phân tử cao (chủ yếu khoảng 55 kDa ) Khối lượng phân tử collagen từ vảy cá chẽm thấp so với collagen từ vảy cá rơ phi (từ 100÷116kDa), theo nghiên cứu cộng (2016) [19], thấp trọng lượng phân tử collagen chiết từ da cá tra (217kDa, 185kDa, 156kDa,104kDa), nghiên cứu Trần Thị Huyền cộng (2012) [3], cao so với khối lượng phân tử chiết xuất từ vảy cá rô phi (≤ 1kDa) theo nghiên cứu Izzati H (2017) 50 Sự khác trọng lượng phân tử sau thủy phân sử dụng tác nhân thủy phân khác nhau, tác nhân thủy phân axit ( nghiên cứu Chun-Yung Huang) hay enzyme ( nghiên cứu Izzati H) 3.5.5 Thành phần axit amin có LMWC Bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC, Agilent 1200 Series coupled to MS detector, micrOTOF-QII Bruker để xác định thành phần axit amin collagen vảy cá chẽm Cột sử dụng Zorbax extend C18 (4.6 x 250 mm), pha động sử dụng hệ dung môi nước: acetonitril có chứa 0.1 % axit trifluoro axetic, thể tích mẫu tiêm 20 microlit Thành phần axit amin LMWC thu thủy phân với thời gian 36 giờ, nhiệt độ 4oC, tỷ lệ da cá/dung dịch thủy phân (1:10 w/v), nồng độ axit axetic (0,5 M), tỷ lệ enzym/vảy cá (0,100 wt.%) trình bày Hình 3.10 Bảng 3.7 STT Bảng 3.5: Thành phần axit amin LMWC Hàm lượng Axit amin STT Axit amin (%.wt) 10 Serine Glycine 14,4 11 Glutamic Proline 8,9 12 Iso Lucine Hydroxyproline 5,7 Tyrosine 1,0 13 Threonine Phenylalanine 2,1 14 Histidine Valine 1,9 15 Aspartic Alanine 7,4 16 Lysine Methionine 1,3 17 Arginine Leucine 2,6 Hình 3.13 Phổ sắc ký mẫu LMWC từ vảy cá chẽm 51 Hàm lượng (%.wt) 3,0 8,4 1,5 2,9 0,5 4,2 2,8 5,3 Hàm lượng proline hydroxylproline collagen 8,9%.wt 5,7%.wt thấp so với collagen tách chiết từ da cá tuyết (164 gốc/1000 gốc) theo nghiên cứu Rui Duan cộng (2009)[25] collagen tách chiết từ vảy cá chép đen (192 gốc/1000 gốc) Cũng nghiên cứu Chun-Yung Huang cộng (2016) [19], hàm lượng proline hydroxylproline (175,4 gốc/1000 gốc) cao vảy cá chẽm Sự khác hàm lượng axit amin lồi chủ yếu mơi trường sống khác nhau, đặc biệt nhiệt độ Các loài cá sống vùng ơn đới cá vùng nhiệt đới hàm lượng axit amin tách chiết từ vảy khác 3.6 Quy trình đề xuất thu nhận collagen thủy phân Cân mẫu thí nghiệm 50g vảy cá Sau khử protein phi collagen NaOH 0,2M, cộng với q trình khử khống, rửa sấy khơ, thu lại 11,5 (g) 52 MƠ TẢ QUY TRÌNH ĐỀ XUẤT  Xử lý sơ nguyên liệu - Vảy cá tươi rửa vòi nước cất lạnh, 30 phút  Quá trình tiền xử lý khử protein phi collagen - Vảy cá sau rửa sạch, ngâm kết hợp khuấy dung dịch NaOH 0,2M, tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch 1:20 w/v, thời gian 24 giờ, tốc độ khuấy 60v/p  Rửa vảy cá sau trình tiền xử lý Khuấy rửa nước cất 60 phút, khoảng 10 phút thay nước lần trung hòa pH =  Q trình khử khống - Vảy cá sau khử protein phi collagen ngâm dung dịch EDTA 0,5M, thời gian 24 giờ, tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch 1:20 w/v - Sau phản ứng, gạt bỏ dung dịch, thu phần rắn, rửa nước cất đến pH trung hịa  Q trình chiết collagen - Chiết enzym pepsin tỉ lệ enzym/vảy cá là: 0,1%, thời gian 36 dung dịch axit axetic 0,5M Kết thúc trình chiết collagen, bất hoạt enzyme 90oC, thời gian 20 phút  Lọc dịch - Sử dụng giấy lọc Whatman, rửa lần nước cất, thu phần dịch  Kết tủa - Sử dụng dung dịch NaCl 2,5M; thời gian 24 giờ; tỷ lệ dung dịch 1:1  Lọc kết tủa, ly tâm - Ly tâm tốc độ 4000rpm, nhiệt độ 4oC, thời gian 60 phút  Thẩm tích - Sử dụng dung dịch Na2HPO4 nồng độ 0,01M Thẩm tích 24  Đông khô - Áp suât đông khô: 0,133bar, nhiệt độ -60oC, thời gian 24  Sản LMWC thu có tình chất hóa lý mơ tả Mục 3.5 thành phần sau: Chỉ tiêu Hàm lượng ẩm Hàm lượng khoáng Hàm lượng protein Hàm lượng lipid Hàm lượng (%) 4,8 ± 0,2 0,87 ± 0,02 94,02 ± 0,5 0.0 53 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Xác định thành phần nguyên liệu vảy cá chẽm (Lates calcarifer) với điều kiện xử lý thích hợp khử phi collagen với NaOH 0,2M (tỷ lệ vảy cá/dung dịch NaOH 1/20) 24 - Xác định điều kiện khử khoáng EDTA 0,5M (tỷ lệ vảy cá/dung dịch EDTA 1/10) 36 - LMWC thu nhận từ vảy cá chẽm sau thủy phân với thời gian 36 giờ, nhiệt độ 4oC, tỷ lệ da cá/dung dịch thủy phân (1:10 w/v), nồng độ axit axetic (0,5 M), tỷ lệ enzym/vảy cá (0,100 wt.%) - Sản phẩm thu có khối lượng phân tử thấp (khoảng 10 kDa) độ tinh khiết có tiềm ứng dụng thực phẩm mỹ phẩm 4.2 Kiến nghị Mặc dù đề tài đề xuất quy trình tách chiết thủy phân để thu nhận collagen phân tử lượng thấp Tuy nhiên, kết nghiên cứu bước đầu Để tiến gần đến sản xuất ứng dụng thực tế cần tiến hành nghiên cứu đầy đủ hơn: - Tối ưu hóa trình khử khống q trình tách chiết collagen nhiều nhiệt độ khác nhau: 5oC; 10oC; 15oC; 20oC; 25oC - Đánh giá xác sản phẩm sử dụng phương pháp: phổ khối, MMR - Sử dụng phương pháp để đo khối lượng phân tử sản phẩm thu sắc ký lọc gel, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lực 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO * Tiếng Việt: Phan Ngọc Hòa, Võ Thị Hồng Linh (2011), Tổng quan collagen ứng dụng collagen, Trường Đại học Bách Khoa TpHCM Lê Phan Thùy Hạnh, Trần Quyết Thắng (2017), Chiết collagen từ da cá hồi (Oncorhynchus mykiss) phương pháp hóa học, Tạp chí Khoa học cơng nghệ Thực phẩm 12,1,108-117 Trần Thị Huyền, Nguyễn Anh Tuấn, Hoàng Ngọc Anh, Vũ Lệ Quyên (2012), Tách chiết collagen từ da cá tra (Pangasius hypophthalmus) phương pháp hóa học, Tạp chí khoa học-công nghệ thủy sản, số Trang Sĩ Trung, Nguyễn Thị Mỹ Hương, Nguyễn Văn Hòa (2016), "Thu nhận protein, chất màu từ phế liệu thủy sản ứng dụng", Nhà xuất Nông nghiệp, 63630, 2/186 Nguyễn Thị Thơm (2017), "Nghiên cứu quy trình tách chiết gelatin từ vảy cá chẽm", Báo cáo đề tài tốt nghiệp, Trường Đại học Nha Trang * Tiếng Anh: Fratzl Peter (2008), "Collagen Structure and Mechanics", Springer Matthew D, Ronald T Raines (2009), "Collagen structure and Stability", Annual Review of Biochemistry, 78, 929-58 Nagarajan Muralidharan & Robinson Jeya Shakila & Durairaj Sukumar & G Jeyasekaran (2011), "Skin, bone and muscle collagen extraction from the trash fish, leather jacket (Odonus niger) and their characterization" Association of Food Scientists & Technologists (India) Nguyen Hoang Dung, Phan Dinh Tuan, , "Fish collagen extraction and application" 10 Shimizu, johsuke; shimizu, hideki; nagashima, koji; yamada, kunishige; takamashu, minori (2001), "Fish collagen and method of producing same", Food Agric, 54, 137-146 11 Hema,G.S., Shyni, K., Suseela Mathew, Anandan, R., George Ninan, Lakshmanan (2013), "A simple method for isolation of fish skin collagen- biochemical characterization of skin collgagen extracted from Albacore Tuna (Thunnus Alalunga), Dog Shark (Scoliodon Sorrakowah), and Rohu (Labeo Rohita)", Annals of Biological Research 12 Frederic, M., Richards, D.S.E., John Kuriyan (2005), Advances in Protein Chemistry 55 13 Gelse K , Po schl E., Aigner T (2003), "Collagen - structure, function and Biosynthesis" 14 Aberoumand (2011), "A Isolation of collagen from some fishes skins in Iran" Journal of Agricultural Technology 15 Fengxiang Zhang, Anning Wang, Zhihua Li, Shengwen He, Lijun Shao (2011), "Preparation and Characterisation of Collagen from Freshwater Fish Scales", Food and Nutrition Sciences 16 Sujithra, S., Kiruthiga, N., Prabhu, M.J., Kumeresan, R (2013), "Isolation sonation and determination of type I collagen from Tilapia (Oreochromis niloticus) waste, School of Chemical and Biotechnology", SASTRA University, Tirumalaisamuthiram, Thanjavur, Tamilnadu, India 17 Vazhiyil Venugopal (2009), "Marine Products for Healthcare: Functional and Bioactive Nutraceutical Compounds from the Ocean", Agriculture and Agri-Food Canada Summerland, British Columbia 18 Abdullah, K Sockalingam and H Z (2015), "Extraction and Characterization of Gelatin Biopolymer from Black Tilapia (Oreochromis mossambicus) Scales." American Institute of Physics 19 Chun-Yung huanga, Jen-Min Kuoa, Shu-Jing, Wub Hsing-Tsung Tsaia (2016), "Isolation and characterization of fish scale collagen from tilapia (Oreochromis sp.) by a novel extrusion–hydro-extraction process", Food Chemistry 20 Fruton, JS., (2002) “A history of pepsin and related enzymes” The Quarterly Review of Biology 21 Fujinaga M, Chernaia MM, Tarasova NI, Mosimann SC, James MN (1995) “Crystal structure of human pepsin and its complex with pepstatin” Protein Sci, 4(5), 960–972 22 Steven Herron, (2016), Biochemistry, The College of Physical and Mathematical Sciences 23 Senaratne L.s., Pyo-Jam Park, Se-Kwon Kim (2006), "Isolation and characterisation of collagen from brown backed toadfish (Lagocephalus gloveri) skin", Bioresource Technology 97, 191–197 24 K.Gelse, E.Po schl, T Aigner (2003), "Collagen - structure, function and biosynthesis", Advanced Drug Delivery Reviews 55, 1531– 1546 56 25 Rui Duan, Junji Zang (2009), "Properties of collagen from skin, scale and bone of carp (Cyprinus carpio)", Food Chemistry 112, 702–706 26 Masahiro Ogawa a, Ralph J Portier b, Michael W Moody a, Jon Bell a, Mark A Schexnayder c, Jack N Losso a (2004), "Biochemical properties of bone and scale collagens isolated from the subtropical fish black drum (Pogonia cromis) and sheepshead seabream (Archosargus probatocephalus)" Food Chemistry 88 495–501 27 Prashant K Bhagwat, Padma B Dandge (2016), "Isolation, characterization and valorizable applications of fish scale collagen in food and agriculture industries" Biocatalysis and Agricultural Biotechnology 28 Junde Chen, Long Li, Ruizao Yi, Nuohua Xu, Ran Gao, Bihong Hong (2016), "Extraction and characterization of acid-soluble collagen from scales and skin of tilapia (Oreochromis niloticus)", LWT - Food Science and Technology 66, 453-459 29 Wang, L., An, X., Yang, F., Xin, Z., Zhao, L., Hu, Q (2008), "Isolation and characterisation of collagens from the skin, scale and bone of deep-sea redfish (Sebastes mentella)" Food Chemistry, 108, 616-623 30 Le, T.M.T., Okazaki, O., Osako, K (2014), "Gelatin Extraction of Alaska Pollock ( Theragra chalcogramma ) Dry Skin", Food Chemistry, 149, 264-270 31 Schmidt, M M., Dornelles, R C P (2016), "Collagen extraction process", International Food Research Journal 23(3): 913-922 32 Mara Isabela Avila Rodrguez MRS (2017), "Collagen: A review on its sources and potential cosmetic applications", J Cosmet Dermatol, 00:1–7 33 Xu Xiang, Fei Long (2015), "Is there value in chemical modification of fish scale surfaces?", J Appl Polym Sci, 133, 42868 * Trang Web: 34 http://noibo.nafiqad.gov.vn/quy-111inh-cua-thi-truong/eu/quy-111inh-cua-eu-veve-sinh-an-toan-thuc-pham/quy-111inh-ec-so-853-2004-ngay-29-4-2004-cua-nghivien-va-hoi-111ong-chau-au/view 57 PHỤ LỤC Bảng Ảnh hưởng nồng độ dung dịch EDTA khử khoáng 0,1 0,25 0,5 0,75 Khối lượng chén nung G1 (g) 32,2561 31,5326 32,1268 32,7614 32,0278 Khối lượng sau nung G2 (g) 32,3297 31,5934 32,1700 32,8044 32,0707 1,47 1,22 0,86 0,86 0,86 Nồng độ EDTA (M) Khoáng (%) Bảng Khảo sát thời gian tối ưu loại khoáng EDTA 0,5M Thời gian (h) 12 24 36 48 Khối lượng chén nung G1 (g) 32,2561 31,5326 32,0278 32,7614 32,1268 Khối lượng sau nung G2 (g) 32,3297 31,5934 32,0717 32,8054 32,1700 Khoáng (%) 1,48 1,21 0,87 0,87 0,86 Bảng 3: Ảnh hưởng nồng độ axit axetic đến hiệu thu hồi LMWC Axit axetic (M) Collagen thu (g) 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,30 0,35 0,50 0,52 0,53 Bảng 4: Ảnh hưởng tỷ lệ enzyme/vảy cá đến hiệu thu hồi LMWC Tỷ lệ enzym/vảy cá (wt.%) 0,050 0,075 0,100 0,200 0,300 Collagen thu (g) 3,50 3,90 4,40 4,50 4,60 Bảng 5: Ảnh hưởng thời gian chiết đến hiệu thu hồi LMWC Thời gian (h) 12 24 36 48 72 Collagen thu (g) 3,50 4,00 4,40 4,50 4,60 ... thấp thể da người hấp thu dễ dàng ? ?Nghiên cứu thu nhận đánh giá tính chất collagen từ vảy cá chẽm phương pháp hóa sinh? ??, Collagen có độ tinh khiết cao tách chiết từ vảy cá chẽm thủy phân sử dụng...BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG PHAN THỊ PHƯỢNG NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT CỦA COLLAGEN TỪ VẢY CÁ CHẼM BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA SINH LUẬN VĂN THẠC SĨ... LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết đề tài: ? ?Nghiên cứu thu nhận đánh giá tính chất collagen từ vảy cá chẽm phương pháp hóa sinh? ?? cơng trình nghiên cứu cá nhân chưa công bố cơng trình khoa học khác