Nghiên cứu phát hiện đột biến gen apc và mutyh trên bệnh nhân mắc bệnh đa polyp tuyến gia đình

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM BỘ Y TẾ SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO NGHIỆM THU ĐỀ TÀI SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN APC VÀ MUTYH TRÊN BỆNH NHÂN MẮC BỆNH ĐA POLYP TUYẾN GIA ĐÌNH PGS.TS NGUYỄN THỊ BĂNG SƯƠNG PGS.TS NGUYỄN TRUNG TÍN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 01-2016 TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Ung thư đại trực tràng bệnh lý ác tính phổ biến với khoảng 655.000 người chết giới năm Theo nghiên cứu, bệnh ung thư đại trực tràng liên quan mật thiết với hội chứng đa polyp, có hội chứng đa polyp tuyến gia đình (Familial adenomatous polyposis-FAP) hội chứng đa polyp có liên quan đến gen MUTYH (MUTYH-associated polyposis – MAP) Trên lâm sàng, bệnh đặc trưng diện nhiều polyp tuyến đại tràng, thường 100 polyp (khoảng 100-2000 polyp) Theo Sheng tác giả, 100% bệnh nhân FAP không điều trị dẫn đến ung thư đại tràng tuổi 35-40 [70] Nguyên nhân gây nên FAP xác định đột biến gen APC (Adenomatous polyposis coli) dòng tế bào mầm, có 85% bệnh nhân thể nặng 30-60% bệnh nhân thể nhẹ mang đột biến gen APC Hội chứng đa polyp liên quan đến gen MUTYH (MAP) đột biến gen MUTYH gây nên Hầu hết đột biến đột biến điểm nên giải trình tự phương pháp hiệu để phát đột biến gen APC MUTYH Nghiên cứu hoàn thiện quy trình khuếch đại tồn 15 exon gen APC phản ứng PCR với độ nhạy 1ng/µL Với quy trình này, chúng tơi xác định 25 đột biến điểm gen APC 63 bệnh nhân mắc bệnh FAP (chiếm 39,68%) Các đột biến điểm phát chủ yếu tập trung exon 15, gồm 19 bệnh nhân, chiếm 73% Nghiên cứu ứng dụng thành cơng quy trình MLPA phát bất thường lớn toàn exon gen APC Chúng phát 01 bệnh nhân bị đột biến đoạn APC vị trí probe 03324-L02527 Nghiên cứu xây dựng hồn thiện quy trình khuếch đại tồn 16 exon gen MUTYH với độ nhạy quy trình đạt 10 ng/µL Kết ứng dụng quy trình phát 03 bệnh nhân bị đột biến điểm gen MUTYH: bệnh nhân có đột biến đồng hợp (p.Tyr128Term p.Tyr179Cys) bệnh nhân có đột biến dị hợp kép (IVS10-2A>G, p.Ala485Thr) Về việc phát kiểu gen thành viên khác gia đình bệnh nhân, số 26 gia đình bệnh nhân phân tích gen, có 22 gia đình (chiếm 84,61%) có tiền sử gia đình, có bố mẹ mang gen đột biến gia đình bệnh nhân (chiếm 15,39%) khơng có tiền sử gia đình trước Khi phân tích 117 người thân 26 gia đình bệnh nhân, chúng tơi phát có 62 người có mang gen APC MUTYH đột biến, chiếm 53% có 55 người không mang gen APC MUTYH đột biến, chiếm 47% Nghiên cứu cho thấy việc phát đột biến gen APC, MUTYH bệnh nhân người thân bệnh nhân cần thiết, giúp dự đoán nguy mắc hội chứng đa polyp nguy tiến triển thành ung thư đại trực tràng thân nhân bệnh nhân Các hội chứng đa polyp phát sớm điều trị tích cực ngăn ngừa biến chứng ung thư Từ giúp làm giảm tỷ lệ bệnh nhân ung thư đại trực tràng hội chứng đa polyp di truyền SUMMARY OF RESEARCH CONTENT Colorectal cancer is a common malignancy with approximately 655,000 deaths worldwide each year According studies, colorectal cancer is closely associated with polyposis syndromes, including adenomatous polyposis syndromes (familial adenomatous polyposis-FAP) and polyposis syndromes related to gene MUTYH (MUTYH-Associated polyposis - MAP) Clinically, the disease is characterized by the presence lot of adenomatous polyps in the colon, usually over 100 polyps According to Sheng et al, 100% of patients with untreated FAP will lead to colon cancer at the age of 35-40 [46] The cause of FAP is germline mutations of the APC (adenomatous polyposis coli) gene , 85% of patients with severe and 30-60% of mild patients carry APC gene mutation Polyposis syndrome-related gene MUTYH (MAP) is caused by mutations in the MUTYH gene The most common type of mutation is point mutation, so the most effective method to detect gene mutations in APC and MUTYH is sequencing This research has amplified all 15 exons of APC gene by PCR with a sensitivity of ng/µL We have identified 25 point mutations in the APC on 63 FAP patients (39.68%) The mutation we found is mainly concentrated in exon 15 (73%) and have a score very high risk of the disease We have successfully used the process to detect the abnormal MLPA large over the entire exons of the APC gene We also detected 01 patient with delete mutation at position 03 324-L02527 probe This research has amplified all 16 exons of MUTYH gene by PCR with a sensitivity of 10 ng/µL We detected 03 patients with point mutations on MUTYH genes: patients with homozygous mutations (p.Tyr128Term and p.Tyr179Cys) and patient had double heterozygous mutations (IVS10 2A>G, p.Ala485Thr) We have sequenced 26 family’s FAP patients, there are 22 families (84.61%) had a family history, one parent carrying the mutant gene and families (15.39%) hadn’t previous family history When analyzing 117 relatives of 26 families of patients, we found 62 people carries the gene mutated APC or MUTYH, representing 53% and 55 who not carry the gene mutation MUTYH or APC and accounting for 47% This study indicates that detect APC and MUTYH mutations in patients and relatives also help predict the risk of polyposis syndrome and the risk of developing colorectal cancer in patient's relatives Polyposis syndromes if detected early and treated aggressively complications of cancer can be prevented, thereby helping to reduce the incidence of colorectal cancer due to hereditary polyposis syndromes MỤC LỤC TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU SUMMARY OF RESEARCH CONTENT MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ 10 PHẦN MỞ ĐẦU 12 CHƯƠNG I - TỔNG QUAN 16 1.1 Hội chứng đa polyp tuyến gia đình FAP 17 1.2 Hội chứng đa polyp liên quan đến gen MUTYH 21 1.3 Tổng quan tình hình nghiên cứu tính cấp thiết đề tài Error! Bookmark not defined 1.4 Tổng quan công cụ sinh tin học Error! Bookmark not defined 1.4.1 CLC Main Workbenches 27 1.4.2 Pymol 27 1.4.3 Dự án 1000 Genomes 27 CHƯƠNG II – NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1 Đối tượng nghiên cứu 30 2.1.1 Chọn mẫu nghiên cứu 30 2.1.2 Quy trình nghiên cứu 31 2.1.3 Dụng cụ, trang thiết bị hóa chất nghiên cứu 32 2.2 Nội dung 1: Tiến hành kỹ thuật giải trình tự kỹ thuật MLPA xác định đột biến gen APC bệnh nhân mắc bệnh đa polyp tuyến gia đình 36 2.2.1 Đối tượng 36 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu 36 2.3 Nội dung 2: Tiến hành kỹ thuật giải trình tự gen MUTYH để xác định đột biến điểm gen MUTYH 40 2.3.1 Đối tượng 40 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu 40 2.4 Nội dung 3: Phát phân tích đột biến gen APC MUTYH thành viên gia đình bệnh nhân phát có đột biến gen APC MUTYH 43 2.4.1 Đối tượng 43 2.4.2 Phương pháp nghiên cứu 43 CHƯƠNG III – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 44 3.1 Đặc điểm nhóm nghiên cứu 44 3.2 Nội dung 1: Hoàn thiện ứng dụng quy trình giải trình tự quy trình MLPA để xác định đột biến gen APC 44 3.2.1 Hoàn thiện quy trình giải trình tự gen APC để xác định đột biến điểm 44 3.2.2 Ứng dụng quy trình giải trình tự phát đột biến điểm gen APC bệnh nhân mắc bệnh đa polyp tuyến gia đình 54 3.2.3 Ứng dụng quy trình xác định đột biến đoạn, lặp đoạn gen APC kỹ thuật MLPA 64 3.2.4 Kết phân tích đột biến gen APC 68 3.3 Nội dung 2: Hoàn thiện ứng dụng quy trình kỹ thuật giải trình tự gen MUTYH để xác định đột biến điểm gen MUTYH 71 3.3.1 Hồn thiện quy trình giải trình tự gen MUTYH 71 3.3.2 Ứng dụng quy trình giải trình tự phát đột biến gen MUTYH bệnh nhân mắc bệnh đa polyp tuyến gia đình 77 3.3.3 Dự đoán ảnh hưởng đột biến gen MUTYH phần mềm in-silico 79 3.3.4 Kết phân tích đột biến gen MUTYH 86 3.4 Mối tương quan đột biến gen số polyp bệnh nhân FAP 88 3.5 Kết phân tích đột biến gen APC MUTYH thành viên gia đình bệnh nhân 89 3.5.1 Kết phân tích gen APC người thân bệnh nhân bị đột biến gen APC 92 3.5.2 Kết phân tích gen MUTYH người thân bệnh nhân bị đột biến gen MUTYH 93 3.5.3 Tỷ lệ mang gen đột biến gây bệnh FAP thành viên gia đình bệnh nhân 95 CHƯƠNG IV - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 97 4.1 Kết luận 97 4.2 Đề nghị 98 TÀI LIỆU THAM KHẢO 99 PHỤ LỤC 104 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT AFAP THUẬT NGỮ : Attenuated familial adenomatous polyposis (Bệnh đa polyp tuyến gia đình thể nhẹ) APC : Adenomatous polyposis coli (Đa polyp tuyến) DNA : Deoxyribonucleic acid EB1 : End Binding FAP : Familial adenomatous polyposis (Bệnh đa polyp tuyến gia đình) MAP : MUTYH- associated polyposis (Bệnh đa polyp liên quan đến gen MUTYH) MCR : Mutation cluster region (Vùng tập trung đột biến) MLPA : Multiplex ligation-dependent probe amplification MUTYH : mutY Homolog (E coli) mRNA : Messenger Ribonucleic acid NCBI : National Center for Biotechnology Information NCCN : National Comprehensive Cancer Network nt : nucleotide NST : Nhiễm sắc thể PCR : Polymerase Chain Reaction DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Phân bố theo giới tuổi bệnh nhân 43 Bảng 3.2 Kết thiết kế mồi khuếch đại 15 exon gen APC 44 Bảng 3.3 Các đột biến điểm gen APC phát phương pháp giải trình tự 57 Bảng 3.4 Thống kê SNP gen APC 61 Bảng 3.5 Tương quan tỷ lệ đột biến gen APC nghiên cứu 68 Bảng 3.6 Kết thiết kế mồi khuếch đại 16 exon gen MUTYH 70 Bảng 3.7 Tương quan tỉ lệ đột biến gen MUTYH nghiên cứu 86 Bảng 3.8 Kết phát SNP gen MUTYH 87 Bảng 3.9 Mối tương quan đột biến gen số polyp 87 Bảng 3.10 Tỷ lệ gia đình có bố mẹ mang gen APC MUTYH đột biến 94 Bảng 3.11 Tỷ lệ người thân bệnh nhân mang gen APC MUTYH bị đột biến 95 - Mồi có trình tự thiết kế từ phần mềm LightScanner Primer công ty IDT tổng hợp - Nước cất vơ trùng Hóa chất tủa sản phẩm PCR Cycler Sequence - Muối NH4OAc 5M - Ethanol 100% - Ethanol 70% - Hi-Di™ Formamide Các bước tiến hành giải trình tự: Bước 1: PCR khuếch đại exon - Các thành phần phản ứng bao gồm: Mồi xuôi 0,2 μM, Mồi ngược 0,2 μM, đệm PCR 1X, MgCl2 1,5 mM, dNTP 0,2 mM, TakaraTaq 0,5U, DNA genome mẫu μl tổng thể tích 15 μl - Chu trình nhiệt: Biến tính 98oC phút, sau 30 chu kỳ gồm 98oC 10 giây; 58oC ( gen MUTYH)/ 59oC ( gen APC)/ 30 giây; 72oC phút, giai đoạn kết thúc gồm 72oC phút Bước 2: Điện di Điện di kiểm tra sản phẩm gel agarose 2% với đệm TBE 0.5X Mẫu chạy kèm với thang DNA 1kb plus để so sánh kích thước Thời gian điện di 30 phút với hiệu điện 100V Bước 3: Tinh sản phẩm PCR Sản phẩm PCR tinh kit GE illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification theo hướng dẫn nhà sản xuất Hiệu chỉnh nồng độ DNA dựa vào độ đậm băng DNA gel so với thang chuẩn DNA 1kb plus Bước 4: Cycle Sequencing PCR Sử dụng BigDye® Terminators V3.1 Cycle Sequencing Applied Biosystems, sử dụng mồi xuôi mồi ngược 107 Thành phần phản ứng: - BigDye: 1μl - Primer (5μM): 0,6μl -Sản phẩm PCR tinh sạch: μl (tương đương – 10 ng) -Sequencing buffer: 7,4μl Chu trình nhiệt: Biến tính 96oC phút, sau 25 chu kỳ gồm 96oC 10 giây; 50oC giây; 60oC phút Bước 5: Tủa sản phẩm cycle sequencing PCR Sản phẩm sau PCR cycle sequence tủa pha loãng với HiDi formamide trước cho vào đĩa 96 giếng giải trình tự Quy trình tiến hành: - Chuẩn bị tube 1,5 mL – ghi ký hiệu mẫu - Pha hỗn hợp muối NH4OAc 5M: 12 μL/mẫu EtOH 100%: 60 μL/mẫu, vortex - Cho 72 μL hỗn hợp vào tube 1,5 mL chuẩn bị - Cho toàn mẫu sau Cycle sequencing PCR vào tube, vortex (lưu ý kích thước sản phẩm PCR > 700bp nên búng nhẹ để tránh làm đứt gãy mẫu) - Ly tâm lạnh 4oC, 25 phút - Loại bỏ dịch nổi, thêm 300 μL EtOH 70% vào tube - Ly tâm lạnh 4oC, 15 phút - Dùng pipette hút dịch nổi, thu tủa - Ủ tube 48oC (đến cồn bay hết) - Cho 17 μL HiDi formamide vào tube, vortex kỹ, ly tâm nhanh - Ủ 96oC, phút - Giữ lạnh -30oC, phút nạp vào giếng giải trình tự (đĩa 96 giếng) Bước 6: Giải trình tự phân tích kết 108 Trình tự nucleotide đoạn gen xác định máy giải trình tự tự động ABI 3130XL gentic Analyzer (Applied Biosystem, Mỹ) Kết phân tích phần mềm CLC Main Workbench v5.5 Qua đỉnh sóng màu khác biểu cho nucleotide khác nhau: - Adenine: màu xanh - Thymine: màu đỏ - Cytosine: màu xanh da trời - Guanine: màu đen Chương trình gióng cột trình tự exon mẫu trình tự gen chuẩn NCBI từ cho thấy đột biến gen có 109 PHỤ LỤC QUY TRÌNH TIẾN HÀNH PHẢN ỨNG MLPA Hóa chất để thực phản ứng MLPA: SALSA MLPA Kit P043-APC probemix Hãng MRC – Holland, Amsterdam, Hà Lan * Thành phần hóa chất: - SALSA MLPA Buffer: KCl, Tris-HCl, EDTA PEG-6000, pH 8.5 - SALSA Ligase-65: Glycerol, BRIJ 0.05%, EDTA, KCl, Tris-HCl, BetaMercaptoethanol 0.1%, pH 7.5, Ligase-65 enzyme (từ vi khuẩn) - Ligase buffer A: NAD (nguồn gốc vi khuẩn), pH 3.5 - Ligase buffer B: Tris-HCl, non-ionic detergents, MgCl2, pH 8.5 - SALSA PCR Primer Mix: chứa oligonucleotides tổng hợp có gắn huỳnh quang Cy5, dNTPs, Tris-HCl, KCl, EDTA, BRIJ 0.04%, pH 8.0 - SALSA Polymerase: Glycerol, BRIJ 0.5%, EDTA, DTT 0.1%, KCl, Tris-HCl, Polymerase enzyme (nguồn gốc vi khuẩn), pH 7.5 - Probemix: chứa oligonucleotides tổng hợp, oligonucleotides tinh chế từ vi khuẩn, Tris-HCl, EDTA, pH 8.0 * Bảo quản: hóa chất bảo quản nhiệt độ -250C đến -150C, bảo quản hộp tránh ánh sáng * Hóa chất để phân tách đoạn: - Formamide chất lượng cao: Hi-Di Formamide Beckman Sample Loading Solution (SLS) - Labelled size standard: Beckman D1-600 - Dầu khoáng - Polymers: Beckman gel 110 Các bước tiến hành * Chương trình nhiệt cho phản ứng MLPA: (1) Biến tính DNA: 980C phút (2) Phản ứng lai hóa: 600C 16 – 20 (qua đêm) (3) Phản ứng nối đoạn probe: 540C 15 phút 980C phút (4) Phản ứng PCR: 950C 30 giây 35 chu kỳ 600C 30 giây 720C 60 giây 720C 20 phút * Các giai đoạn thực hiện: (1) Giai đoạn biến tính DNA: lấy 5μl mẫu DNA (có nồng độ 50 đến 250ng) cho vào tube 0,2ml đem biến tính DNA 980C phút (2) Giai đoạn lai hóa: thêm 3μl hỗn hợp hybridisation master mix vào tube phản ứng (gồm 1,5μl dung dịch đệm MLPA 1,5μl probemix), ủ 95oC phút, sau lai hóa 60oC 16h – 20h (qua đêm) (3) Giai đoạn nối đoạn probe: thêm 32μl hỗn hợp Ligase-65 master mix (gồm 25μl dH2O, 3μl Ligase buffer A, 3μl Ligase buffer B, 1μl enzyme Ligase-65) vào tube phản ứng, trộn đều, ủ 54oC 15 phút để nối probe gắn huỳnh quang, sau tăng nhiệt độ lên 98oC phút để phá hủy enzyme ligase-65 sau phản ứng nối probe (4) Giai đoạn khuếch đại probes: thêm 10μl hỗn hợp polymerase master mix (gồm 7,5μl dH2O, 2μl SALSA PCR primer 0,5μl SALSA polymerase) vào tube tiến hành chạy phản ứng PCR, lặp lại 35 chu kỳ Sau kéo dài kết thúc 72oC 20 phút 111 (5) Giai đoạn phân tách đoạn: sản phẩm sau khuếch đại phân tách đoạn hệ thống điện di mao quản GenomeLab GeXP điều kiện: 32μl SLS (hay formamide) + 0.2μl Beckman D1-labeled CEQ size standard 600 + 1μl sản phẩm PCR; nhiệt độ mao quản 500C, biến tính 900C /20 giây, điện bơm mẫu vào 2kV 30 giây, điện phân tách đoạn 4,8kV 60 phút (6) Phân tích kết quả: kết sau chạy điện di phân tích tự động để phát đột biến nhờ phần mềm GeneMarker ver 1.6 (Softgenetics) 112 PHỤ LỤC TƯ VẤN DI TRUYỀN CHO CÁC GIA ĐÌNH CĨ MANG GEN ĐỘT BIẾN Khi phát thành viên gia đình mang gen bệnh, cần tiến hành phân tích gen cho tất thành viên khác gia đình Những thành viên mang gen đột biến cần theo dõi, điều trị tích cực Nếu xuất polyp, cần tiến hành cắt bỏ sớm để tránh nguy chuyển thành ung thư Sau phẫu thuật, cần tái khám thường xuyên tháng đến năm/ lần để phát sớm tái phát Đồng thời sử dụng số thuốc sau phẫu thuật để ngăn ngừa ung thư đại trực tràng, có số thuốc khuyến cáo sau: - Aspirin: giảm nguy mắc ung thư Tổ chức thực hành lâm sàng Hoa Kỳ khuyến cáo tránh dùng aspirin liều cao nguy chảy máu suy thận (300 mg nhiều hơn) - Vitamin D: nghiên cứu Viện ung thư quốc gia Hoa Kỳ cho thấy vitamin D mang lại lợi ích ngăn ngừa ung thư, nồng độ vitamin D máu ≥ 80 nmol/L làm giảm nguy mắc ung thu 72% so với nhóm có nồng độ < 50 nmol/L - Cycloxygenose (Cox 2), Celecoxib, Rofecoxib số thuốc khác làm giảm nguy ung thư tổn thương đường tiêu hóa Higuchi, Hallax cho thấy bệnh nhân FAP điều trị với liều 400 mg celecoxib/ lần/ ngày tháng nguy ung thư giảm 28% so với nhóm đối chứng 113 PHỤ LỤC MỘT SỐ KẾT QUẢ CỦA BỆNH NHÂN CÓ MANG GEN ĐỘT BIẾN Kết phân tích gen APC bệnh nhân FAP 13 Bệnh nhân mang đột biến c.2097G>A (p.Trp699 Term) Kết phân tích gen APC bệnh nhân FAP 18 Bệnh nhân mang đột biến c.4550delA (p.Gln1517ArgfsX6) 114 Kết bệnh nhân FAP 20, đột biến c.3147G>A (p.Trp1049Term) Kết bệnh nhân FAP 25, đột biến c.1916delT (p.Leu639TyrfsX7) Kết bệnh nhân FAP 27, đột biến c.5908A>C (p.Ser1970Arg) 115 Kết bệnh nhân FAP 30, đột biến c.4345A>T (p.Lys1449Term) Kết bệnh nhân FAP 31, đột biến c.3202_3205delTCAA (p.Ser1068GlyfsX57) 116 Kết bệnh nhân FAP 32, đột biến c.2055G>A (p.Trp685 Term) Kết bệnh nhân FAP 33, đột biến c.5766G>C (p.Gln1922His ) Kết bệnh nhân FAP 35, đột biến c.1613A>T (p.Glu538Val) 117 Kết bệnh nhân FAP 36, đột biến c.2542A>T (p.Lys848 Term) Kết bệnh nhân FAP 37, đột biến c.3146G>A (p.Trp1049Term) Kết bệnh nhân FAP 39, đột biến c.3498T>G (p.Tyr1166Term) 118 Kết bệnh nhân FAP 45, đột biến c.1730T>G (p.Leu577Term) Kết bệnh nhân FAP 46, đột biến c.2991T>G (p.Tyr997Term) Kết bệnh nhân FAP 48, đột biến c.2977A>T (p.Lys993Term) 119 Kết bệnh nhân FAP 51, đột biến c.595G>A (p.Ala199Thr) Kết bệnh nhân FAP 55, đột biến c.2055G>A (p.Trp685Term) Kết bệnh nhân FAP 57, đột biến c.1916T>C (p.Leu639Ser) 120 Kết phân tích gen APC bệnh nhân FAP 60 Bệnh nhân mang đột biến c.502A>T (p.Arg168Term) Kết phân tích gen APC bệnh nhân FAP 63 Bệnh nhân mang đột biến c.3225T>G (p.Tyr1075Term) 121