Nghiên cứu khảo sát đột biến gen flt3 npm1 cebpa và kit trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy bằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi dna

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ SỞ Y TẾ BỆNH VIỆN TRUYỀN MÁU HUYẾT HỌC BÁO CÁO NGHIỆM THU KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN FLT3, NPM1, CEBPA VÀ cKIT TRÊN BỆNH NHÂN BẠCH CẦU CẤP DỊNG TỦY BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI DNA CHỦ NHIỆM: TS.BS PHAN THỊ XINH ĐỒNG CHỦ NHIỆM: BS LÊ THANH CHANG THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 03/ 2016 ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ SỞ Y TẾ BỆNH VIỆN TRUYỀN MÁU HUYẾT HỌC BÁO CÁO NGHIỆM THU KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN FLT3, NPM1, CEBPA VÀ cKIT TRÊN BỆNH NHÂN BẠCH CẦU CẤP DỊNG TỦY BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI DNA CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI TS.BS PHAN THỊ XINH CƠ QUAN QUẢN LÝ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) BS LÊ THANH CHANG CƠ QUAN CHỦ TRÌ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 03/ 2016 MỤC LỤC Trang TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU I SUMMARY OF RESEARCH CONTENT II DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT IV DANH MỤC CÁC BẢNG V DANH MỤC CÁC HÌNH VI BẢNG QUYẾT TỐN KINH PHÍ VII PHẦN MỞ ĐẦU IX ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Các yếu tố nguy gây bệnh BCCDT 1.1.4 Đặc điểm lâm sàng BCCDT 1.1.5 Chẩn đoán BCCDT .6 1.1.6 Điều trị BCCDT BCCDT-M3 1.1.6.1 Giai đoạn công 1.1.6.2 Giai đoạn điều trị sau công hay sau lui bệnh 1.2 Sinh bệnh học phân tử bạch cầu cấp dòng tủy CHƢƠNG II: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Phƣơng pháp nghiên cứu 20 2.2 Đối tƣợng nghiên cứu 20 2.2.1 Cỡ mẫu .20 2.2.2 Tiêu chuẩn chọn mẫu: 20 2.2.3 Tiêu chuẩn loại trừ 21 2.3 Các phƣơng pháp kỹ thuật sau đƣợc sử dụng trình thực đề tài .21 2.4 Tóm tắt sơ đồ bƣớc nghiên cứu 22 2.5 Phân tích số liệu 22 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ - BÀN LUẬN 23 3.1 Nội dung 1: Thu thập bệnh phẩm tủy xƣơng BN BCCDT đƣợc chẩn đoán 23 3.2 Nội dung 2: Nuôi cấy thu hoạch tế bào tủy xƣơng, phân tích NST đồ để chọn mẫu nghiên cứu phù hợp 23 3.3 Nội dung 3: Thực tách chiết RNA từ tủy xƣơng tổng hợp cDNA .27 3.4 Nội dung 4: Thiết kế đoạn mồi (primer) phù hợp cho phản ứng PCR để khuếch đại chuyên biệt đoạn gen cần khảo sát chuẩn hóa điều kiện PCR, đảm bảo khuếch đại chuyên biệt vùng gen cần khảo sát, kiểm chứng kết PCR điện di thạch .27 3.5 Nội dung 5: Tinh sản phẩm PCR giải trình tự DNA sản phẩm PCR theo chiều xuôi ngƣợc máy ABI PRISM 3130 (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) .36 3.6 Nội dung 6: Phân tích, đối chiếu kết giải trình tự chuỗi DNA NCBI Blast server để chẩn đốn tình trạng đột biến tổng hợp kết nghiên cứu .37 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Bạch cầu cấp dòng tủy (BCCDT) thể bệnh ác tính tế bào gốc dịng tủy, đặc trưng tăng sinh tích tụ tế bào non tủy xương gây suy giảm dòng tế bào máu bình thường Bệnh diễn tiến đến tử vong với bệnh cảnh xuất huyết nhiễm trùng không điều trị Các nghiên cứu đa trung tâm giới chứng minh bất thường nhiễm sắc thể (NST) gen có ảnh hưởng độc lập đến tiên lượng bệnh chia BCCDT thành nhóm tiên lượng tốt, trung bình xấu Trong đột biến gen đột biến cKIT làm cho bệnh nhân (BN) có t(8;21) thuộc nhóm tiên lượng tốt trở thành nhóm tiên lượng trung bình, đột biến gen FLT3, NPM1 CEBPA ảnh hưởng đến tiên lượng BN có NST đồ bình thường Nghiên cứu tiến hành để khảo sát đột biến gen FLT3, NPM1, CEBPA BN BCCDT có NST đồ bình thường đột biến cKIT BN BCCDT có t(8;21) Bệnh viện Truyền máu Huyết học, giúp lựa chọn hướng điều trị phù hợp hóa trị liệu đơn kết hợp với ghép tủy nhằm tăng tỉ lệ lui bệnh kéo dài thời gian sống cho BN Trong thời gian từ tháng 07/2012 đến tháng 12/2015, quy trình giải trình tự chuỗi DNA để chẩn đốn đột biến FLT3, NPM1, CEBPA cKIT thiết lập Kết khảo sát 102 BN BCCDT có NST đồ bình thường, gồm 52 bệnh nhân nam, phát 29 BN có đột biến FLT3-ITD (28,4%), BN có đột biến FLT3-TKD (4,9%); 31 BN có đột biến NPM1 (30,4%), 15 BN (14,7%) có kèm theo đột biến FLT3 Trong 102 BN, có 52 BN không phát đột biến FLT3 và/hoặc NPM1 khảo sát đột biến CEBPA cho thấy có 26 (25,5%) BN mang 1, 2, kiểu đột biến 9, 15, BN Trong nghiên cứu này, khảo sát đột biến cKIT 46 BN mang t(8;21), cho thấy có 11 BN (23,9%) phát đột biến exon 8, 17 BN BCCDT có NST đồ bình thường mang đột biến FLT3-ITD BN BCCDT có t(8;21) mang đột biến cKIT có tiên lượng xấu cần điều trị phối hợp hóa trị liệu ghép tủy Việc khảo sát đột biến gen BCCDT giúp phân nhóm tiên lượng sâu nhằm lựa chọn hướng điều trị phù hợp Kết nghiên cứu cho thấy cần áp dụng phác đồ hóa trị liệu mạnh phối hợp với ghép tủy khoảng 27% trường hợp có đột biến FLT3-ITD (29 BN) đột biến cKIT (11 BN) nhóm BN BCCDT có NST đồ bình thường có t(8;21) I SUMMARY OF RESEARCH CONTENT Acute myeloid leukemia (AML) is a malignancy of myeloid stem cells, characterized by proliferation and accumulation of immature cells in the bone marrow and reduction of healthy white blood cells, red blood cells, and platelets If not treated, this disease can be fatal from hemorrhage or infection Multicenter studies in the world demonstrated that genetic and chromosomal abnormalities are independent prognostic factors, which can divide AML patients into three distinguished groups: better-prognosis group, intermediate-prognosis group, and worse-prognosis group Among genetic alterations, cKIT mutations replace patients with a t(8;21) from better-prognosis group into intermediate-prognosis group; while mutations of FLT3, NPM1, and CEBPA have an effect on prognosis of patients with a normal karyotype We conducted this study to investigate the mutational status of FLT3, NPM1, and CEBPA from AML patients with a normal karyotype and cKIT mutational status from AML patients with a t(8;21) at the Blood Transfusion and Hematology Hospital in order to select a suitable therapeutic regimen between chemotherapy alone or chemotherapy in combination with bone marrow transplantation with the hope to increase the remission rate and prolong survival time From July 2012 to December 2015, a DNA sequencing procedure for determination of mutational status of FLT3, NPM1, CEBPA, and cKIT was established We investigated 102 AML patients with a normal karyotype, including 52 men, and found that 29 patients were positive for FLT3-ITD mutations (28.4%), patients were positive for FLT3-TKD (4.9%), and 31 patients carried NMP1 mutations (30.4%), of which 15 patients ((14,7%) also had FLT3 mutations Among 102 patients, 52 without mutations of FLT3 or NPM1 were further investigated the CEBPA mutational status CEBPA mutations were detected in 26 patients (25,5%), including 1, 2, and types of mutations in 9, 15, and patients, respectively In this study, we also investigated cKIT mutational status from 46 AML patients with a t(8;21) and found that 11 patients (23,9%) had mutations in exons 8, 9, and 17 AML patients with a normal karyotype and FLT3ITD mutations as well as patients with a t(8;21) and cKIT mutations belong to the worseII prognosis group and need to be treated with chemotherapy in combination with bone marrow transplantation regimen Gene mutational status analysis in AML is useful for prognostic stratification that can guide a suitable therapeutic regimen Our study showed that a regimen of intensive chemotherapy followed by bone marrow transplantation was required for 27% of the patients, including 29 patients with FLT3-ITD and a normal karyotype and 11 patients with cKIT mutations and a t(8;21) III KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT AML1 Acute myeloid leukemia ATRA All trans retinoic acid BCCDT Bạch cầu cấp dòng tủy CBFB Core binding factor beta CD Cluster of differentiation cDNA Complementary DNA CEBPA CCAAT/enhancer-binding protein alpha BV.TMHH Bệnh viện Truyền máu Huyết học EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid ETO Eight-Twenty-One FISH Fluorescent in situ hybridization FLT3 Fms-like tyrosine kinase ITD Internal tandem duplication MLL Mixed-lineage leukemia NCCN National Comprehensive Cancer Network NPM1 Nucleophosmin NST Nhiễm sắc thể PCR Polymerase chain reaction PHA-LCM Phytohemagglutinin-lymphocyte-conditioned medium PML Promyelocytic leukaemia PTD Partial tandem duplication RARA Retinoic acid receptor alpha RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction TAD Transactivating domain TKD Tyrosine kinase domain IV DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Phân loại bạch cầu cấp dòng tủy theo FAB Bảng 1.2: Phân loại BCCDT dựa vào dấu ấn miễn dịch Bảng 1.3: Phân nhóm nguy dựa vào bất thường nhiễm sắc thể (NST) Bảng 1.4: Phân nhóm nguy dựa vào đột biến gen nhóm NST đồ bình thường 10 Bảng 1.5: Phân nhóm nguy dựa vào bất thường NST gen 18 Bảng 3.1: Các bất thường NST phân chia theo nhóm tiên lượng 24 Bảng 3.2: Trình tự mồi sử dụng khảo sát gen FLT3, NPM1, CEBPA cKIT 33 Bảng 3.3: Kết đột biến gen FLT3-ITD 37 Bảng 3.4: Kết đột biến gen FLT3-TKD 39 Bảng 3.5: Kết đột biến gen CEBPA 40 Bảng 3.6: Kết đột biến CEBPA sau tạo dòng T-vector 42 Bảng 3.6: Kết BN BCCDT điều trị phác đồ A7D3 43 Bảng 3.6: Kết đột biến gen cKIT 44 V DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1: Cấu trúc gen FLT3 11 Hình 1.2: Cấu trúc gen sản phẩm phiên mã gen NPM1 13 Hình 1.3: Cấu trúc protein NPM1 14 Hình 1.4: Cấu trúc protein CEBPA 15 Hình 1.5: Cấu trúc gen cKIT 17 Hình 3.1: Kết nhiễm sắc thể 25 Hình 3.2: Kết nhiễm sắc thể 26 Hình 3.3: Kết nhiễm sắc thể 26 Hình 3.4: Kết kiểm tra chất lượng cDNA sử dụng gen giữ nhà ABL 27 Hình 3.5: Kết alignment trình tự chuỗi từ exon 13 đến exon 22 gen FLT3 28 Hình 3.6: Kết alignment trình tự chuỗi vị trí mồi FLT3-F 28 Hình 3.7: Kết alignment trình tự chuỗi vị trí mồi FLT3-R 29 Hình 3.8: Kết alignment trình tự chuỗi gen NPM1 29 Hình 3.9: Kết alignment trình tự chuỗi vị trí mồi cNPM1-25F 30 Hình 3.10: Kết alignment trình tự chuỗi vị trí mồi cNPM1-771F 30 Hình 3.11: Kết alignment trình tự chuỗi vị trí mồi cNPM1-1112R 30 Hình 3.12: Kết alignment trình tự chuỗi gen CEBPA 31 Hình 3.13: Kết alignment trình tự chuỗi vị trí mồi CEBPA-F1 31 Hình 3.14: Kết alignment trình tự chuỗi vị trí mồi CEBPA-R2 32 Hình 3.15: Kết alignment trình tự chuỗi gen cKIT 32 Hình 3.16: Vị trí mồi sản phẩm khuếch đại gen FLT3 34 Hình 3.17: Vị trí mồi sản phẩm khuếch đại gen NPM1 34 Hình 3.18: Vị trí mồi sản phẩm khuếch đại gen CEBPA 35 Hình 3.19: Vị trí mồi sản phẩm khuếch đại gen CEBPA từ cặp mồi F2-R2 35 Hình 3.20: Vị trí mồi sản phẩm khuếch đại gen cKIT 36 VI Kết sản phẩm tinh 302 mẫu sản phẩm PCR có 102 mẫu FLT3, 102 mẫu NPM1, 52 CEBPA 46 mẫu cKIT Trình tự thơ gen FLT3, NPM1, CEBPA cKIT 204, 102, 208 230 3.6 Nội dung 6: Phân tích, đối chiếu kết giải trình tự chuỗi DNA NCBI Blast server để chẩn đốn tình trạng đột biến tổng hợp kết nghiên cứu Kết phân tích liệu thơ gen FLT3 102 bệnh nhân cho thấy kết đột biến FLT3-ITD 29 trường hợp (28,4%) (Bảng 3.3), FLT3-TKDs trường hợp (4,9%) (Bảng 3.4), 68 trường hợp khơng có đột biến, trường hợp có SNPs trường hợp có đoạn tồn exon 20 (gồm 41 codon) Ngồi ra, BN AML-246 có đột biến D835Y kèm đoạn tồn exon 20 Trong 29 BN có FLT3-ITD vị trí chèn đoạn chủ yếu nằm exon 14, có BN có vị trí chèn đoạn exon 15 (Bảng 3.3) Bảng 3.3: Kết đột biến gen FLT3-ITD STT Mã số Giới Tuổi Exon bị nghiên cứu Kiểu đột biến Kiểu đột biến đột biến FLT3 NPM1 AML-005 Nam 58 14 p.Y599_D600ins17 AML-046 Nữ 35 14 p.W603_E604ins8 AML-049 Nam 36 14 p.Y597_E598ins84 AML-078 Nam 54 14 p.V592_D593ins11 AML-079 Nam 69 14 p.E598_Y599ins8 AML-104 Nam 53 15 p.F612_G613ins25 TCTG-TYPE A AML-115 Nam 84 14 p.F605_P606ins16 TCTG-TYPE A AML-141 Nam 46 14 c.1861_1862ins114 CGTG-TYPE C AML-145 Nữ 65 14 p.R595_E596ins18 10 AML-196 Nữ 50 14 p.P606_R607ins13 11 AML-197 Nam 37 14 p.F612_G613ins20 12 AML-222 Nam 61 14 c.1810_1811ins60 TCTG-TYPE A 13 AML-223 Nữ 49 14 p.F594_G595ins15 CATG-TYPE B 14 AML-226 Nam 53 14 c.1784_1785ins45 TCTG-TYPE A 15 AML-237 Nữ 51 14 c.1793_1794ins48 CCTG-TYPE D - 37 - 16 AML-242 Nam 53 14 c.1829_1830ins54 TCTG-TYPE A 17 AML-247 Nữ 13 14 p.P606_R607ins14 18 AML-330 Nữ 39 14 c.1816_1817ins27 19 AML-353 Nam 44 14 p.F605_P606ins27 20 AML-354 Nữ 46 14 p.F612_G613ins20 21 AML-356 Nam 48 14 c.1799_1800ins24 22 AML-394 Nữ 26 14 p.E598_Y599ins5 23 AML-400 Nữ 12 14 c.1794_1795ins24 24 AML-401 Nữ 13 15 c.1838_1839ins129 25 AML-402 Nam 18 14 c.1812_1813ins42 26 AML-404 Nữ 20 14 c.1811_1812ins42 27 AML-405 Nữ 53 14 c.1806_1807ins21 TCTG-TYPE A 28 AML-411 Nam 59 14 c.1800_1801ins21 TCTG-TYPE A 29 AML-427 Nam 47 14 c.1794_1795ins24 TCTG-TYPE A TCTG-TYPE A Qua kết bảng 3.3 cho thấy tất 29 BN có đột biến lặp đoạn bảo tồn khung đọc, kích thước đoạn lặp thay đổi, ngắn 15 bp (3 acid amin) dài 252 bp (84 acid amin) Số lượng đoạn lặp đoạn vị trí đoạn lặp gặp vùng cận màng, chưa phát vị trí khác, nhiên vị trí chèn đoạn lặp thay đổi, hầu hết khác 29 BN có FLT3-ITD Gale cộng báo cáo có đa dạng kích thước đoạn lặp, vị trí đoạn lặp, số đoạn lặp mức độ biểu phân tích số mẫu lớn 1425 trường hợp [19] Trong nghiên cứu số BN phân tích ít, có 29 trường hợp nên thấy đa dạng kích thước đoạn lặp vị trí đoạn lặp chưa khảo sát biểu dòng tế bào mang đột biến Theo Mạng lưới ung thư quốc gia Hoa Kỳ năm 2015 khơng sử dụng mức độ biểu đột biến, mà dựa vào diện FLT3-ITD để phân nhóm nguy thực hành lâm sàng Kỹ thuật giải trình tự DNA địi hỏi phải có 20% số tế bào bất thường phát đột biến Những bệnh nhân BCCDT nghiên cứu chẩn đoán bệnh dựa vào kết tủy đồ có diện ≥ 20% tế bào non nên hầu hết trường hợp dễ dàng phát dòng tế bào mang đột biến, nhiên số - 38 - trường hợp BN chẩn đoán loạn sinh tủy, tỷ lệ tế bào non từ 6% - < 20% có mang chuyển vị t(8;21)(q22;q22) cần phối hợp với kỹ thuật nhạy kỹ thuật PCR kèm điện di tách băng để chẩn đoán Kỹ thuật giải trình tự DNA có ưu điểm biết chất đoạn chèn gồm trình tự acid amin lặp lại, vị trí chèn đoạn, số lượng đoạn lặp giới hạn độ nhạy Kỹ thuật PCR kèm điện di tách băng nhạy hơn, xác định có diện hay không độ biến lặp đoạn rõ chất đoạn lặp trường hợp đoạn lặp ngắn (2 – acid amin) khó tách băng Các đột biến điểm phát BN, chủ yếu biến đổi exon 20 FLT3 vị trí D835 gặp BN I836del gặp BN (Bảng 3.4) Bảng 3.4: Kết đột biến gen FLT3-TKD STT Mã số Giới Tuổi Exon bị nghiên cứu đột biến Kiểu đột biến Kiểu đột biến FLT3 NPM1 AML-044 Nam 20 D835H AML-093 Nam 20 D835E AML-246 Nữ 60 20 TCTG-TYPE A AML-343 Nam 47 20 D835Y Del exon 20 D835Y AML-377 Nữ 49 20 I836del c.868_870>7bp TCTG-TYPE A Kết phân tích đột biến NPM1 102 BN cho thấy 31 BN (30,4%) có đột biến, đột biến nhóm A gặp 24 BN, chiếm tỉ lệ 77,4%, đột biến nhóm B gặp BN (9,7%), đột biến nhóm C D thấy BN, chiếm tỉ lệ 3,2% Ngoài ra, BN (12,9%) có đột biến NPM1 khơng thuộc nhóm A, B, C D, c.118delC gặp BN, c.863_864insTCTC gặp BN c.868_870>7bp gặp BN Trong 31 BN có đột biến NPM1 12 BN có kèm đột biến FLT3-ITD (Bảng 3.3) BN có kèm đột biến FLT3-TKD (Bảng 3.4) Sau loại trừ trường hợp có đột biến FLT3, NPM1, xuất đồng thời đột biến FLT3 NPM1 có 52 BN khơng mang đột biến khảo sát đột biến CEBPA Phân tích liệu thơ 52 BN cho thấy có 26 BN phát đột biến Các kiểu đột biến CEBPA đa dạng, - 39 - c.589_590insACCCGC thường gặp (Bảng 3.5) Mỗi BN có kiểu đột biến gặp 15 trường hợp (57,7%) kiểu đột biến gặp trường hợp (7,7%) Bảng 3.5: Kết đột biến gen CEBPA Giới Tuổi Mã số nghiên cứu AML-002 AML-006 AML-051 Nam Nam Nam 47 24 AML-061 AML-094 Nam Nam 42 12 AML-111 AML-113 Nam Nữ 28 AML-161 AML-229 Nam Nữ 19 37 10 AML-232 Nữ 42 11 12 AML-238 AML-339 Nữ Nam 44 57 13 14 AML-348 AML-355 Nam Nữ 59 58 15 AML-358 Nam 42 16 AML-368 Nữ 47 17 AML-370 Nữ 18 AML-374 Nữ 42 19 AML-395 Nữ 48 20 AML-406 Nam 37 21 AML-407 Nam 46 STT Vùng bị đột biến Vùng N vùng C Vùng N Vùng N vùng C Vùng N vùng C Vùng N vùng C Vùng N vùng C Vùng N vùng C Vùng N vùng C Vùng N vùng C Vùng N vùng C Vùng N vùng C Vùng N vùng C Vùng N vùng C Vùng N Kiểu đột biến CEBPA c.589_590insACCCGC c.589_590insACCCGC c.247delC and c.912insTTG c.241delC c.69_117del49 c.927_928insGTGGAC c.589_590insACCCGC c.68_69insC c.909_926del18 c.589_590insACCCGC c.200_201insGATTA c.947_948ins39 c.68_69insC c.930_931insGCA c.589_590insACCCGC c.213_214insCC c.589_590insACCCGC c.918_919ins9 c.589_590insACCCGC c.247delC and c.939insAAG c.175delG c.589_590insACCCGC c.936_937insCAG c.330_333del and c.912insTTG c.311delG and c.589_590insACCCGC c.346_347insC and c.951_952ins27bp c.286_287ins25bp and c.939_940insAAG c.117delC c.934C>AGAA c.68_69insC - 40 - 22 AML-410 Nữ 27 23 AML-415 Nữ 45 24 AML-418 Nam 28 25 26 AML-429 AML-430 Nữ Nam 28 32 vùng C Vùng N vùng C Vùng N vùng C Vùng N vùng C c.930_931insAAG c.188_189insCATTCCC c.944_945insCAC c.191_192insTA c.936_937duplication 15bp c.97_98del13bp c.930_931insACG c.588_589insCACCCG Vùng N c.294_295delGGC vùng C c.588_589insCACCCG Trong 18 mẫu có từ kiểu đột biến trở lên, chọn mẫu để thực phản ứng PCR với enzym Phusion Taq Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase (Thermo scientific, Mỹ), sản phẩm PCR tiến hành phản ứng nối vòng sử dụng Tvector từ kit pGEM®-T Vector Systems (Promega – Mỹ) theo hướng dẫn nhà sản xuất Sau plasmid T-vector thực biến nạp vào tế bào vi khuẩn E.coli khả nạp (DH5α) phương pháp sốc nhiệt, nuôi vi khuẩn sau biến nạp môi trường LB với thời gian 90 phút 37oC, lắc nhẹ Cấy dịch ni cấy đĩa LB agar có kháng sinh ampicilin chọn lọc khúm trắng/xanh (Blue/white selection) X-gal Ủ đĩa cấy qua đêm chọn từ đến khúm trắng để giải trình tự chuỗi DNA xác định đột biến nằm alen hay alen khác Kết cho thấy BN có đột biến nằm alen (Bảng 3.6), BN cịn lại có kết đột biến alen Trong trường hợp kết khuẩn lạc chưa kết luận đột biến hay alen cần khảo sát thêm để xác định Qua khảo sát 102 BN BCCDT, phát đột biến FLT3-ITD FLT3-TKD 28,4% 4,9% Tỷ lệ đột biến FLT3-ITD tương đương với nghiên cứu khác [19, 16], nhiên tỷ lệ đột biến FLT3-TKD thấp báo cáo Frohling cộng [18] Đột biến NPM1 gặp 30,4% trường hợp, thấp báo cáo Falini cộng gặp 50-60% trường hợp có NST đồ bình thường, nhiên tương đương với kết nghiên cứu Gale RE cộng (24%) [19] Các kiểu đột biến NPM1 chủ yếu type A (77,4%), kiểu lại chiếm tỷ lệ thấp Trong nghiên cứu phát kiểu đột biến NPM1 thường gặp A, B, C D Trong 31 BN có đột biến NPM1 có đến 15 BN (48,4%) kèm đột biến FLT3, chủ - 41 - yếu kèm với đột biến FLT3-ITD (12 BN), điều làm cho BN giảm bớt nguy xấu đột biến FLT3-ITD gây Bảng 3.6: Kết đột biến CEBPA sau tạo dòng T-vector MÃ SỐ KIỂU KHUẨN LẠC KHUẨN LẠC KHUẨN LẠC KHUẨN LẠC ĐỘT BIẾN TRÊN MẪU BN c.247delC AMLc.912insTTG 51 c.247delC c.912insTTG KHUẨN LẠC TỔNG KẾT Đột biến alen c.247delC c.912insTTG c.247delC c.247delC c.247delC c.912insTTG c.69_117del49b p c.927_928insGT GGAG c.69_117del49b p c.927_928insGT GGAG c.69_117del49bp c.927_928insGT GGAG c.69_117del49bp Đột biến c.927_928insGTG alen GAG c.200_201insGAT c.200_201insGA c.200_201insGA TA TTA TTA AMLc.947_948ins39 c.947_948ins39 c.947_948ins39 229 bp bp c.200_201insGA TTA c.947_948ins39 bp c.200_201insGA c.200_201insGAT Đột biến TTA TA c.947_948ins39b c.947_948ins39bp alen p c.69_117del49b c.69_117del49 p AML- c.927_928insGT c.927_928insGT 94 GGAG GGAG c.311delG AMLc.589_590insAC 370 CCGC c.311delG c.311delG c.589_590insAC c.589_590insAC c.589_590insAC c.589_590insAC CCGC CCGC CCGC CCGC Đột biến c.589_590insACC CGC alen c.188_189insCAT Đột biến AML- TCCC c.188_189insCA c.944_945insCA c.188_189insCA c.188_189insCAT c.944_945insCAC 410 c.944_945insCA TTCCC C TTCCC TCCC alen C Tổng hợp trường hợp mang đột biến FLT3 NPM1 có 52 BN không mang đột biến gen nên khảo sát đột biến CEBPA Sau phân tích, chúng tơi nhận thấy có đến 50% (26 BN) mang đột biến CEBPA Nếu tính dân số mẫu 102 tỷ lệ đột biến CEBPA 25,5% (26/102 BN) cao báo cáo khác có tỷ lệ dao động từ -19% [26] Trong 26 BN mang đột biến có 17 BN (65,4%) có 2-3 kiểu đột biến trường hợp báo cáo thường có đột biến đầu C đầu N alen khác nên có ý nghĩa tiên lượng tốt Chúng bước đầu lấy số liệu lâm sàng 48 BN khảo sát đột biến gen FLT3, NPM1 CEBPA nghiên cứu có 27 BN điều trị hóa trị liệu với phác đồ A7D3 Trong 27 trường hợp điều trị có 22 BN có mang loại đột biến, BN khơng có đột biến (Bảng 3.7) - 42 - Bảng 3.7: Kết BN BCCDT điều trị phác đồ A7D3 Lui bệnh hoàn toàn (CR) (BN) Lui bệnh Không lui phần (PR) bệnh (NR) (BN) (BN) FLT3-ITD FLT3-ITD + NPM1 FLT3-TKD + NPM1 Tử vong (TV) Tổng số ca (BN) theo đột biến 1 NPM1 CEBPA Không đột biến 1 1 1 27 Tổng số ca theo mức độ 15 lui bệnh Kết phân tích sơ cho thấy có BN mang đột biến FLT3-ITD, BN có kèm đột biến NPM1 cho đáp ứng hoàn toàn sau giai đoạn công BN, ngược lại BN mang đột biến FLT3-ITD BN khơng đáp ứng BN tử vong giai đoạn điều trị công Các BN mang đột biến CEBPA FLT3-TKD kèm đột biến NPM1 đột biến NPM1 đơn cho tỷ lệ đáp ứng lui bệnh tốt tỷ lệ nhỏ tử vong không đáp ứng Kết ban đầu cho thấy BN có đột biến FLT3-ITD có tiên lượng xấu, cần điều trị phác đồ hóa trị liệu mạnh kết hợp ghép tủy Trong thời gian tới, hy vọng thu thập liệu điều trị nhiều BN để phân tích kết đáp ứng nhóm bệnh cách rõ ràng Trong 299 BN phân tích NST đồ có 48 BN mang chuyển vị t(8;21)(q22;22), nhiên chúng tơi phân tích đột biến 46 BN có BN khơng lấy mẫu đạt tiêu chuẩn cho nghiên cứu Kết phân tích đột biến gen cKIT 46 BN cho thấy 12 BN có đột biến (26,1%), 34 BN khơng có đột biến BN có thay đổi nucleotide báo cáo tính đa hình Các đột biến chủ yếu exon 17, BN có đột biến exon BN có đột biến exon (Bảng 3.8) - 43 - Bảng 3.7: Kết đột biến gen cKIT STT Mã số Giới Tuổi nghiên cứu Vùng bị Kiểu đột biến đột biến cKIT AML-031 Nam 50 17 D816V AML-035 Nữ 38 17 AML-055 Nữ 25 17 D816Y, N822K D816V AML-082 Nam 49 17 N822Y AML-083 Nữ 17 D820G AML-087 Nam 43 17 N822K AML-091 Nữ 28 Del codon 419 (GAC) AML-092 Nữ 67 D496G AML-117 Nam 48 17 D816H 10 AML-124 Nữ 27 17 D816Y 11 AML-398 Nam 18 p.A502_503insSA 12 AML-425 Nam 35 17 D816Y Khảo sát thời điểm chẩn đốn 46 bệnh nhân BCCDT có t(8;21)(q22;q22), chúng tơi ghi nhận hầu hết bệnh nhân có tình trạng thiếu máu xuất huyết Tỷ lệ bệnh nhân có tình trạng nhiễm trùng 26,5% Thiếu máu, xuất huyết nhiễm trùng triệu chứng khiến bệnh nhân phải nhập viện Hạch to gặp BCCDT Tỷ lệ tế bào non tủy xương trung bình 54,8%, cao so với nghiên cứu Yau Wai Kwong (46,3%) [40] Trong nghiên cứu chúng tôi, bệnh nhân có tỉ lệ tế bào non tủy xương thấp 8% chẩn đoán BCCDT dựa vào bất thường di truyền tế bào sinh học phân tử Người ta nhận thấy số trường hợp hiếm, chuyển vị t(8;21)(q22;q22) phát tỉ lệ tế bào non 20% tế bào tủy xương Vì vậy, theo phân loại tổ chức Y tế giới trường hợp phân loại điều trị bệnh bạch cầu cấp dịng tủy khơng xếp vào hội chứng loạn sinh tủy [3] Điều cho thấy giá trị di truyền tế bào sinh học phân tử chẩn đoán sớm bệnh BCCDT - 44 - Kết khảo sát đột biến gen cKIT 46 bệnh nhân phát 12 bệnh nhân có đột biến, chiếm tỷ lệ 26,1% Kết thấp nghiên cứu tác giả Yau Wai Kwong với tỷ lệ 39% [40] Một số nghiên cứu khác giới thực nhóm bệnh nhân cho thấy tỷ lệ bệnh nhân có đột biến gen cKIT chiếm tỉ lệ từ đến 48% [4] Như tỷ lệ đột biến gen cKIT không tương đồng nhiều nghiên cứu thực quần thể bệnh nhân khác Qua phân tích chúng tơi nhận thấy đột biến gen cKIT đa dạng với nhiều kiểu đột biến vùng khác gen cKIT Trong nghiên cứu đa số đột biến xảy vị trí exon 17, chiếm tỉ lệ 81,8% hầu hết đột biến đột biến điểm thay acid amin, chiếm tỉ lệ 83,3% (10/12 trường hợp) Đột biến điểm thay acid amin vị trí codon 816 chiếm tỉ lệ cao 50% (6/12 trường hợp), vị trí codon 822 chiếm tỉ lệ 25% (3/12 trường hợp) Mỗi đột biến codon 419, 496, 820 gặp bệnh nhân Đột biến codon 816 codon 822 thường gặp nghiên cứu đột biến gen cKIT BCCDT [4; 34] Nghiên cứu tác giả Yau Wai Kwong cho biết có 22% bệnh nhân t(8;21) lúc chẩn đốn có đột biến codon 816 [40] Tỉ lệ phát đột biến codon 816 (D816V/Y) 8/17 kiểu đột biến, chiếm 47%, đột biến codon 822 2/17 trường hợp, chiếm 11,7% [30] Nghiên cứu Pollard cộng cho kết tương tự với 12/17 đột biến liên quan codon 816 (9 D816V/1 D816H/ D816Y), đột biến codon 820 (D820G) đột biến N822K [34] Kết nghiên cứu tương đương với kết nghiên cứu tác giả Trong 46 trường hợp khảo sát có 23 bệnh nhân điều trị hóa trị liệu đầy đủ phác đồ A7D3 mà lấy đủ số liệu để phân tích, bệnh nhân có đột biến cKIT 16 bệnh nhân khơng có đột biến Phân tích nhóm có khơng có đột biến cho thấy khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê tỷ lệ lui bệnh hoàn toàn sau hóa trị liệu cơng tỷ lệ tái phát sau lui bệnh Tuy nhiên, thời gian tái phát sau lui bệnh hoàn toàn khác biệt rõ nhóm có đột biến (4,25 ± 3,03 tháng) so với nhóm khơng có đột biến (13,6 ± 5,55 tháng) cho thấy cần can thiệp ghép tế bào gốc tạo máu sớm sau lui bệnh nhóm bệnh nhân BCCDT có t(8;21)(q22;q22) kèm đột biến gen cKIT - 45 - CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN Trong thời gian qua, thực kết sau: Cấy phân tích NST 299 BN bệnh BCCDT để chọn lọc 102 BN có NST bình thường 46 BN có t(8;21) đủ tiêu chuẩn đưa vào lơ nghiên cứu Thiết kế mồi tối ưu điều kiện PCR để khuếch đại gen đích cần khảo sát gồm FLT3, NPM1, CEBPA cKIT Thực giải trình tự phân tích đột biến gen FLT3, NPM1, CEBPA cKIT 102 BN có NST bình thường 46 có t(8;21) Hồn chỉnh quy trình khảo sát đột biến gen FLT3, NPM1, CEBPA cKIT Tỷ lệ đặc điểm đột biến sau: -FLT3-ITD: chiếm 28,4% trường hợp với đoạn lặp vị trí chèn đoạn vùng cận màng, exon 14 15 -FLT3-TKD: chiếm 4,9% trường hợp vị trí D835 I836 -NPM1: chiếm 30,4% trường hợp, đột biến nhóm A chiếm ưu 14,7% BN có đồng biểu đột biến FLT3 NPM1 -CEBPA: chiếm 25,5% trường hợp, 17,6% BN có từ kiểu đột biến trở lên -cKIT: chiếm 26,1% trường hợp, chủ yếu exon 17, có trường hợp đột biến exon trường hợp đột biến exon - 46 - KIẾN NGHỊ Chúng tơi hồn tất công việc giai đoạn giai đoạn theo hợp đồng ký với Sở Khoa Học Công Nghệ TP HCM có số kiến nghị sau: (1) Cấp tiếp kinh phí đợt để chúng tơi hồn tất phần nghiệm thu đề tài (2) Chuyển giao kết nghiên cứu cho trung tâm Huyết học nước có nhu cầu để ứng dụng phân nhóm nguy điều trị bệnh BCCDT (3) Phân tích số liệu có để đăng kết tập san khoa học quốc tế - 47 - TÀI LIỆU THAM KHẢO Adam J Mead The clinical and biological consequences of different FLT3 mutations in patients with AML A thesis submitted for the degree of Doctor of Philosophy 2009 University College London Albiero E, Madeo D, Bolli N, et al Identification and functional characterization of a cytoplasmic nucleophosmin leukaemic mutant generated by a novel exon-11 NPM1 mutation Leukemia 2007 21, 1099–1103 Arber DA, Stein AS, Carter H, et al (2003) Prognostic impact of acute myeloid leukemia classification: importance of detection of recurring cytogenetic abnormalities and multilineage dysplasia on survival American Journal of Clinical Pathology 119(5):672-680 Boissel N, Leroy H, Brethon B, et al (2006) Incidence and prognostic impact of cKit, FLT3, and Ras gene mutations in core binding factor acute myeloid leukemia (CBF-AML) Leukemia 20(6):965-970 Bornhäuser M, Illmer T, Schaich M, et al Improved outcome after stem-cell transplantation in FLT3/ITD-positive AML Blood 2007;109(5):2264-2265 Bradstock KF, Matthews JP, Lowenthal RM, et al A randomized trial of high-versus conventional-dose cytarabine in consolidation chemotherapy for adult de novo acute myeloid leukemia in first remission after induction therapy containing high-dose cytarabine Blood 2005;105(2):481-8 Byrd JC, Mrózek K, Dodge RK, et al Pretreatment cytogenetic abnormalities are predictive of induction success, cumulative incidence of relapse, and overall survival in adult patients with de novo acute myeloid leukemia: results from Cancer and Leukemia Group B (CALGB 8461) Blood 2002;100(13):4325-4336 Cairoli R, Beghini A, Grillo G, et al Prognostic impact of cKIT mutations in core binding factor leukemias: an Italian retrospective study Blood 2006;107(9):34633468 Camoratto, AM, Jani JP, Angeles TS, et al CEP-751 inhibits trk receptor tyrosine kinase activity in vitro and exhibits anti-tumor activity International Journal of Cancer 1997;72:673 – 679 - 48 - 10 Chao Q, Sprankle KG, Grotzfeld RM, et al Identification of N-(5-tert-butyl-isoxazol3-yl)-N'-{4-[7-(2-morpholin-4-yl-ethoxy)imidazo[2,1-b][1,3]benzothiazol-2yl]phenyl}urea dihydrochloride (AC220), a uniquely potent, selective, and efficacious FMS-like tyrosine kinase-3 (FLT3) inhibitor Journal of Medicinal Chemistry 2009;52:7808–7816 11 Cortes J, Foran J, Ghirdaladze D, et al AC220, a Potent, Selective, Second Generation FLT3 Receptor Tyrosine Kinase (RTK) Inhibitor, in a First-in-Human (FIH) Phase AML Study Blood 2009;114:636 12 Dufour A, Schneider F, Metzeler KH, et al Acute myeloid leukemia with biallelic CEBPA gene mutations and normal karyotype represents a distinct genetic entity associated with a favorable clinical outcome J Clin Oncol 2010;28:570-577 13 Fabbro D, Ruetz S, Bodis S, et al PKC412–a protein kinase inhibitor with a broad therapeutic potential Anti-Cancer Drug Design 2000;15:17–28 14 Falini B, Mecucci C, Tiacci E, et al Cytoplasmic nucleophosmin in acute myelogenous leukemia with a normal karyotype N Engl J Med 2005;352:254-266 15 Falini B, Nicoletti I, Martelli MF, et al Acute myeloid leukemia carrying cytoplasmic/mutated nucleophosmin (NPMc+ AML): biologic and clinical features Blood 2007;109(3):874-85 16 Foran JM New prognostic markers in acute myeloid leukemia: perspective from the clinic Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2010:47-55 17 Frehlick LJ, Eirin-Lopez JM, Ausio J New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones BioEssays 2007, 29:49 – 59 18 Fröhling S, Schlenk RF, Breituck J, et al Prognostic significance of activating FLT3 mutations in younger adults (16 to 60 years) with acute myeloid leukemia and normal cytogenetics: a study of the AML Study Group Ulm Blood 2002;100(13): 4372– 4380 19 Gale RE, Green C, Allen C, et al The impact of FLT3 internal tandem duplication mutant level, number size, and interaction with NPM1 mutations in a large cohort of young adult patients with acute myeloid leukemia Blood 2008;111:2776-2784 - 49 - 20 Gilliland DG, Griffin JD The roles of FLT3 in hematopoiesis and leukemia Blood 2002;100(5):1532-1542 21 Grimwade D, Walker H, Oliver F, et al The importance of diagnostic cytogenetics on outcome in AML: analysis of 1,612 patients entered into the MRC AML 10 trial The Medical Research Council Adult and Children's Leukaemia Working Parties Blood 1998;92(7):2322-33 22 Hendricks-Taylor LR, Bachinski LL, Siciliano MJ, et al The CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP alpha) gene (CEBPA) maps to human chromosome 19q13.1 and the related nuclear factor NF-IL6 (C/EBP beta) gene (CEBPB) maps to human chromosome 20q13.1 Genomics 1992;14(1):12-7 23 Jae HP, Cyrus VH, Martin ST Blood consult: acute myeloid leukemia and the t(8;21)(q22;22) Blood 2011;117(10):2775-2777 24 Jitakshi De, Reza Z, Michele H, et al Immunophenotypic Profile Predictive of cKIT Activating Mutations in AML1-ETO Leukemia Am J Clin Pathol 2007;128:550-557 25 Kayser S, Schlenk RF, Londono MC, et al Insertion of FLT3 internal tandem duplication in the tyrosine kinase domain-1 is associated with resistance to chemotherapy and inferior outcome Blood 2009, vol.114, no.12: 2386-2392 26 Leroy H, Roumier C, Huyghe P, et al CEBPA point mutations in hematological malignancies Leukemia 2005;19(3):329-34 27 Lim MJ, Wang XW Nucleophosmin and human cancer Cancer Detect Prev 2006; 30(6): 481–490 28 Marcucci G, Maharry K, Radmacher MD, et al Prognostic significance of, and gene and microRNA expression signatures associated with, CEBPA mutations in cytogenetically normal acute myeloid leukemia with high-risk molecular features: a Cancer and Leukemia Group B Study J Clin Oncol 2008;26(31):5078-5087 29 Meshinchi S, Arceci RJ, Sanders JE, et al Role of allogeneic stem cell transplantation in FLT3/ITD-positive AML Blood 2006;108(1):400 30 Nanri T, Matsuno N, Kawakita T, et al (2005) Mutations in the receptor tyrosine kinase pathway are associated with clinical outcome in patients with myeloblastic leukemia harboring t(8;21)(q22;q22) Leukemia 19(8):1361-1366 - 50 - 31 Neubauer A, Maharry K, Mrózek K, et al Patients with acute myeloid leukemia and RAS mutations benefit most from postremission high-dose cytarabine: a Cancer and Leukemia Group B study J Clin Oncol 2008;26(28):4603-4609 32 Phan Thị Xinh Khảo sát bất thường nhiễm sắc thể bệnh bạch cầu cấp dòng tủy kỹ thuật nhuộm băng G Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP HCM Tạp chí Y học Việt Nam tháng 8-số đặc biệt/2012, trang 143-148 33 Pitiot AS, Santamaria I, Garcia-Suarez O A new type of NPM1 gene mutation in AML leading to a C-terminal truncated protein Leukemia 2007 21, 1564–1566 34 Pollard JA, Gerbing RB, et al (2010) Prognostic significance of KIT mutations in pediatric patients with core binding factor AML enrolled on serial pediatric cooperative trials for de novo AML Blood.115(12):2372-2379 35 Renneville A, Roumier C, Biggio V, et al Cooperating gene mutations in acute myeloid leukemia: a review of the literature Leukemia 2008, 22: 915–931 36 Renneville A, Roumier C, Biggio V, et al Cooperating gene mutations in acute myeloid leukemia: a review of the literature Leukemia 2008, 22: 915–931 37 Schlenk RF, Dohner K Impact of new prognostic markers in treatment decisions in acute myeloid leukemia Hematology 2009, 16:98 – 104 38 Schlenk RF Post-remission therapy for acute myeloid leukemia Haematologica 2014;99: 1663-70 39 Schnittger S, Kohl TM, Haferlach T, et al cKIT-D816 mutations in AML1-ETOpositive AML are associated with impaired event-free and overall survival Blood 2006;107(5):1791-1799 40 Yau Wai Kwong (2010) Significance of c-kit mutation in RUNX1-RUNX1T1 acute myeloid leukemia Master of medical science, University of Hong Kong 1-52 - 51 -