Thử nghiệm xây dựng kit chẩn đoán virus gây bệnh rối loạn sinh sản hô hấp trên heo porcine reproductive and respiratory syndrome virus prrsv bằng kỹ thuật rt lamp reverse transcription loop mediated isothermal amplification

THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ * BÁO CÁO NGHIỆM THU THỬ NGHIỆM XÂY DỰNG KIT CHẨN ĐOÁN VI-RÚT GÂY BỆNH RỐI LOẠN SINH SẢN HÔ HẤP TRÊN HEO (PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME VIRUS) BẰNG KỸ THUẬT RT-LAMP (REVERSE RANSCRIPTION LOOP MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION) Chủ nhiệm đề tài: Cơ quan chủ trì: TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ Tham gia: PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẢI THS LÂM VỸ NGUYÊN KS NGUYỄN PHAN THÀNH BSTY NGUYỄN LÊ TRÚC PHƯƠNG Xác nhận phản biện Xác nhận phản biện Xác nhận chủ tịch hội đồng TP Hồ Chí Minh, tháng năm 2013 MỤC LỤC DANH SÁCH CÁC HÌNH i DANH SÁCH CÁC BẢNG ii DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT iii TĨM TẮT CƠNG TRÌNH SUMMARY Phần MỞ ĐẦU 1.1 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THUỘC LĨNH VỰC ĐỀ TÀI 1.1.2 Vi rú (PRRSV) 1.1.2.2.1 Cấu trúc virion PRRSV 1.1.2.2.2 Tổ chức gen vi rút PRRSV 10 - 10 1.1.3.2 Kỹ thuật real time RT-PCR 11 1.1.4 Phƣơng pháp RT-LAMP 12 1.1.4.1 Khái niệm phƣơng pháp RT-LAMP 12 1.1.4.2 Thành phần phản ứng RT-LAMP 12 1.1.4.3 Nguyên tắc hoạt động phƣơng pháp RT-LAMP 13 1.1.4.4 Nhận biết kết phản ứng RT-LAMP 15 1.1.5 Nguyên tắc chế tạo kit 16 1.1.5.1 Kit 16 1.1.5.2 Nguyên tắc chế tạo kit 16 1.1.5.3 Kít thực phản ứng RT-LAMP 16 1.1.6 Tổng quan nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài nƣớc nƣớc 17 1.1.6.1 Những nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài nƣớc 17 1.1.6.2 Những nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài nƣớc 18 1.2 TÍNH CẤP THIẾT CỦA VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 19 1.3 MỤC ĐÍCH - YÊU CẦU 20 1.3.1 Mục đích 20 1.3.2 Yêu cầu 20 1.3.3 Nội dung thực 20 1.3.3.1 Nghiên cứu thiết kế vật liệu 21 1.3.3.2 Tối ƣu hóa quy trình RT-LAMP chẩn đốn PRRSV 21 1.3.3.3 Sản xuất thử nghiệm kit RT-LAMP chẩn đoán PRRSV 21 1.4 HƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 1.4.1 Vật liệu hóa chất 21 1.4.2 Phƣơng pháp tiến hành 24 1.4.2.1 Thu nhận mẫu 24 1.4.2.2 Ly trích RNA vi rút 24 1.4.2.3 Nghiên cứu thiết kế vật liệu 25 1.4.2.3.1 Xác định mẫu dƣơng tính PRRSV 25 1.4.2.3.2 Xác định mẫu dƣơng tính PCV2 kỹ thuật PCR 26 1.4.2.3.3 Định lƣợng vi rút PRRSV 27 1.4.2.4 Tối ƣu quy trình RT-LAMP chẩn đốn vi rút PRRS 33 1.4.2.4.1 Thành phần mồi hóa chất phản ứng RT-LAMP chẩn đốn PRRSV 33 1.4.2.4.2 Khảo sát thời gian nhiệt độ RT-LAMP chẩn đoán PRRSV 34 1.4.2.4.3 Thực phản ứng RT-LAMP 36 1.4.2.5 Xác định độ đặc hiệu độ nhạy phƣơng pháp RT-LAMP 36 1.4.2.5.1 Xác định độ đặc hiệu phản ứng RT-LAMP 36 1.4.2.5.2 Xác định độ nhạy phƣơng pháp RT-LAMP 38 1.4.2.5.3 So sánh phƣơng pháp đọc kết phản ứng RT-LAMP 38 1.4.2.5.4 Xét nghiệm mẫu nhiễm PRRSV thực địa RT-LAMP 39 1.4.2.6 Xây dựng đối chứng dƣơng cho kit RT-LAMP chẩn đoán PRRSV 39 1.4.2.6.1 P -PCR khuếch đại đoạn ORF6 PRRSV 40 1.4.2.6.2 Tạo dòng xây dựng đối chứng dƣơng 41 1.4.2.6.3 Xác định số lƣợng plasmid tái tổ hợp 41 1.4.2.7 Sản xuất thử nghiệm kit RT-LAMP 42 Phần NỘI DUNG NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ 46 2.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 46 2.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐẠT ĐƢỢC 46 2.2.1 Nghiên cứu vật liệu cho đề tài 46 2.2.1.1 Định tính định chủng mẫu PRRSV RT-PCR 46 2.2.1.2 Xác định mẫu dƣơng tính PCV kỹ thuật PCR 47 2.2.1.3 Định lƣợng PRRSV mẫu real time RT-PCR 48 2.2.2 Tối ƣu quy trình RT-LAMP chẩn đốn PRRSV 50 2.2.2.1 Khảo sát thời gian nhiệt độ phản ứng RT- LAMP 50 2.2.2.1.1 Khảo sát nhiệt độ ảnh hƣởng đến phản ứng RT-LAMP 52 2.2.2.1.2 Khảo sát thời gian phản ứng RT-LAMP 53 2.2.2.2 Thực phản ứng RT-LAMP với mẫu vacxin PRRSV 53 2.2.3 Tính đặc hiệu độ nhạy phản ứng RT-LAMP 55 2.2.3.1 Khảo sát tính đặc hiệu phản ứng RT-LAMP 55 2.2.3.1.1 Thực phản ứng RT-LAMP với mẫu nghiên cứu 55 2.2.3.1.2 Khẳng định tính đặc hiệu enzyme HeaIII 57 2.2.3.2 Xác định độ nhạy phản ứng RT-LAMP 59 2.2.3.3 Khảo sát phƣơng pháp RT-LAMP mẫu PRRS thực địa 60 2.2.4 Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm kit RT-LAMP chẩn đoán PRRSV 61 2.2.4.1 Xây dựng đối chứng dƣơng cho kít RT-LAMP 61 2.2.4.1.1 Khuếch đại đoạn gen ORF6 PRRSV RT-PCR 61 2.2.4.1.2 Khẳng định DNA plasmid chèn đoạn ORF6 63 2.2.4.2 Kết nghiên cứu sản xuất thử nghiệm kít RT-LAMP 65 2.2.4.2.1 Khẳng định tính đặc hiệu kít RT-LAMP 65 2.2.4.2.2 Kết khảo sát độ nhạy kít RT-LAMP A B 66 2.2.4.2.3 Kết khảo sát thời gian sử dụng kít RT-LAMP A B 68 2.2.4.2.4 Kết khảo sát thời gian bảo quản kít RT-LAMP A B 71 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 75 QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN VI RÚT PRRSV BẰNG KỸ THUẬT RT-LAMP 77 TÀI LIỆU THAM KHẢO 79 PHỤ LỤC CÔNG BỐ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình dạng cấu trúc PRRSV Hình 1.2 Sơ đồ phân bố bệnh PRRS nước giới 1.3 C gen PRRSV 10 Hình 1.4 Bộ mồi phương pháp RT-LAMP 12 Hình 1.5 Nguyên tắc hoạt động phản ứng RT-LAMP 14 Hình 1.6 Sản phẩm phản ứng RT-LAMP 15 Hình 1.7 Cấu trúc vector pGEM-T Easy 30 Hình 1.8 Trình tự khung đọc mở ORF6 PRRSV vị trí mồi 35 Hình 1.9 Vị trí cắt enzyme HaeIII sản phẩm RT – LAMP 37 Hình 2.1 Kết sản phẩm phản ứng RT-PCR khung đọc mở ORF7 47 Hình 2.2 Kết điện di sản phẩm PCR RT-PCR mẫu PCV PRRSV 48 Hình 2.3 Biểu đồ tính hiệu phản ứng định lương PRRSV 49 Hình 2.4 Đường tuyến tính đường chuẩn realtime PCR sử dụng EvaGreen 49 Hình 2.5 - 51 2.6 Khảo sát nhiệt độ phản ứng RT-LAMP phát PRRSV 52 Hình 2.7 Khảo sát thời gian phản ứng RT-LAMP với mẫu vắc xin Amervac 53 Hình 2.8 Kết thực phản ứng RT-LAMP 54 Hình 2.9 Kết phân tích tính đặc hiệu phương pháp RT-LAMP 55 Hình 2.10 Kết phản ứng cắt với enzyme HaeIII 57 Hình 2.11 Độ nhạy phản ứng RT-LAMP 59 Hình 2.12 Kết điện di sản phẩm RT-PCR xác định độ nhạy phản ứng 60 Hình 2.13 Kết RT-PCR khung đọc mở ORF6 PRRSV 62 Hình 2.14 Kết kiểm tra plasmid chèn đoạn ORF6 63 Hình 2.15 Kết Blast trình tự vùng gen ORF6 ngân hàng gen NCBI 64 Hình 2.16 Kết giải trình tự sản phẩm PCR plasmid chèn đọan ORF6 65 Hình 2.17 Kết khẳng định tính đặc hiệu kít RT-LAMP 66 Hình 2.18 Kết khảo sát tính ổn định kit RT-LAMP 67 Hình 2.19 Kết khảo sát thời gian sử dụng kít A B lần đến lần 69 Hình 2.20 Kết khảo sát thời gian sử dụng kít A B lần 70 i Hình 2.21 Kết khảo sát thời gian bảo quản kít A B lần 1đến lần 72 Hình 2.22 Kết khảo sát thời gian bảo quản kít A B lần 73 DANH SÁCH CÁC BẢNG 1.1 Thành phầ -PCR xác định PRRSV với cặp mồi F7 R7 26 1.2 -PCR xác định PRRSV với cặp mồi F7, R7 26 Bảng 1.3 Thành phần nồng độ hóa chấ ịnh PCV2 27 Bảng 1.4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR xác định PCV2 27 -PCR khuếch đại đoạn ORF7 PRRSV 28 1.5 Thành phần hóa chấ 1.6 - 29 Bảng 1.7 Thành phần phản ứng gắn ORF7 vào pGEM T Easy 30 Bảng 1.8 Thành phần phản ứng reverse transcription 33 Bảng 1.9 33 Bảng 1.10 Thành phần phản ứng real time RT-PCR định lượng PRRSV 33 Bảng 1.11 Chu kỳ nhiệt phản ứng real time RT-PCR định lượng PRRSV 33 Bảng 1.12 Trình tự mồi -LAMP PRRSV 34 1.13 -LAMP PRRSV 35 Bảng 1.14 Thành phần nồng độ phản ứng RT-LAMP chẩn đoán PRRSV 35 Bảng 1.15 Thành phần phản ứng cắt với enzyme HaeIII 38 Bảng 1.16 Trình tự mồi phản ứng RT-PCR khuếch đại đoạn ORF6 PRRSV 40 Bảng 1.17 -PCR khuếch đại đoạn ORF6 40 Bảng 1.18 -PCR khuếch đại vùng gen ORF6 40 Bảng 1.19 Thành phần kít RT-LAMP A 50 phản ứng 42 Bảng 1.20 Thành phần kít RT-LAMP B 50 phản ứng 42 Bảng 1.21 Thành phần kít RT-LAMP A chứa phản ứng 44 Bảng 1.22 Thành phần kít RT-LAMP A chứa phản ứng 45 Bảng 2.1 Hệ số biến động giá trị Ct phản ứng realtime RT-PCR định lương PRRSV 50 Bảng 2.2 Kết khảo sát mẫu thực địa phương pháp RT-LAMP RT-PCR 61 Bảng 2.3 Kết khảo sát độ nhạy độ ổn định kit RT-LAMP 68 Bảng 2.4 Kết khảo sát thời gian sử dụng kít RT-LAMP A, RT-LAMP B 70 Bảng 2.5 Kết khảo sát thời gian bảo quản kít RT-LAMP A, RT-LAMP B 71 ii Bảng 2.6 Chi phi sản xuất kít RT-LAMP 50 phản ứng chẩn đốn PRRSV 73 DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT 5’NTR 5’Nontranslated Region aa Acid amin AMV Avian Myeloblastosis Virus BIP Backward Inner Mồi cDNA Complementary deoxyribonucleotide acid Ct Threshold cycle DNA Deoxyribonucleotide Acid dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay EU European F mồi Forward mồi FA Fluorescent Antibody Staining FIP Forward Inner Mồi FMDV Foot Mouth Disease Virus GP Glycoprotein IFA Indirect Immunoflourescence Assay IPMA Immunoperoxidase monolayer assay KD Kilo Dalton LOD Limit of Detection M protein Membrain protein MSD Mystery Swine Disease N protein Uclecapside protein NA North American iii NEB New England Biolabs Nsp Non-structural protein ORF Open Reading Frame PAMs Porcine alveolar macrophage PCR Polymerase Chain Reaction PCV Porcine Circovirus PPV Porcine Parvovirus PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PRRSV Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus PRV Pseudorabies Virus qPCR Quantitative PCR R Reverse RNA Ribonucleotide acid RT-LAMP Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification RT-PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction SFV Swine Flu Virus TBE Tris borate EDTA TE Tris EDTA TGEV Replication of Transmissible Gastroenteritis Coronavirus UTR Untranlated region iv TĨM TẮT CƠNG TRÌNH Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome - PRRS) vi rút PRRSV gây ra, dịch bệnh lây lan nhanh gây thiệt hại kinh tế lớn năm gần Tại Việt Nam, việc chẩn đoán bệnh chủ yếu sử dụng phương pháp ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay), FA (Fluorescent Antibody Staining), IFA (Indirect Immunoflourescence assay), RT-PCR (reverse transcriptase polymerase chain reation) hay nested RT-PCR Tuy nhiên, việc chẩn đoán phương pháp tốn nhiều thời gian, chi phí cao, trang thiết bị đại không đáp ứng nhu cầu chẩn đoán bệnh nhanh diện rộng nhằm phục vụ yêu cầu lớn cấp thiết xã hội việc phòng chống bệnh Gần phương pháp RT-LAMP phát triển với ưu điểm đơn giản, dễ thực hiện, tiết kiệm thời gian lẫn chi phí so với kỹ thuật chẩn đốn khác Do đó, việc phát triển kit chẩn đốn bệnh PRRSV nói riêng bệnh vi rút nói chung kỹ thuật RT-LAMP cần thiết, công cụ hữu nhà quản lý, người chăn nuôi hiệu dịch tễ , , chăn ni Xuất phát từ tình hình thực tiễn trên, đề tài “ kit RT- LAMP phát vi rút PRRSV (Porcine Reproductive And Respiratory Syndrome ” thực Mục đích Virus) gây hội đề tài nhằm xác định quy trình RT-LAMP chẩn đốn PRRSV, xác định tính đặc hiệu độ nhạy phương pháp sản xuất thử nghiệm kit RT-LAMP chẩn đoán bệnh PRRSV, nhằm đáp ứng nhu cầu chẩn đoán bệnh nhanh, xác, dễ áp dụng chi phí thấp Những kết đạt sau thời gian nghiên cứu: - ối ưu phản ứng điều kiện tối ưu 65oC 40 phút Xác định độ đặc hiệu phương pháp RT-LAMP chẩn đoán PRRSV Xác định độ nhạy phương pháp RT-LAMP chẩn đoán PRRSV, 102, 103 101 sao/ml đọc kết phương pháp điện di, mắt thường đèn UV với thuốc nhuộm SYBR Green Ngưỡng phát phương pháp nhạy phương pháp RT-PCR 1000 lần Xây dựng đối chứng dương cho kit RT LAMP chẩn đoán PRRSV DNA plasmid pGEM T Easy nhận đoạn gen ORF6 Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm kit RT-LAMP A (bao gồm tất thành phần hóa chất tube trừ RNA mẫu ) RT-LAMP B (bao gồm Master Mix, Enzyme mix, Mồi mix) Tiến hành khảo sát tính đặc hiệu, tính ổn định, thời gian sử dụng thời gian bảo quản hai kit Kết cho thấy sau 14 tuần khảo sát, kit RT-LAMP cho kết dương tính RNA mẫu Khơng có khác biệt đáng kể kit RT-LAMP A B 38 Rowland RRR, Schneider P, Fang Y, Wootton S, Yoo D, Benfield DA 2003 Peptide domains involved in the localization of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus nucleocapsid protein to the nucleolus Virology 316: 135-45 39 Sambrook J, E F Fritsch, T Maniatis 1989 Molecular cloning A laboratory manual, the second edition CSH Suarez P., Zardoya R., Martin M.J., Prieto C., Dopazo J., Solana A., Castro J.M 1996 Phylogenetic relationships of european strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) inferred from DNA sequences of putative ORF-5 and ORF-7 genes Virus Research 42: 159–165 40 Snijder EJ, Meulenberg JJ 1998 The molecular biology of arteriviruses J Gen Virol 79: 961-79 41 Snijder EJ, van Tol H, Pedersen KW, Raamsman MJ, and de Vries AA 1999 Identification of a novel structural protein of arteriviruses J Virol., 73 (8): 6335-6345 42 Spagnuolo W.M., Walker I.W., McNeilly F., Calvert V., Graham D, Burns K., Adair B.M, Allan G.M 1998 The reverse transcription polymerase chain reaction fot the diagnostics of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome: comparision with virus isolation and serology Vet Microbiol 62: 207- 215 43 Tian K., Yu X., Zhao T., Feng Y., Cao Z 2007 Emergenece of fatal PRRSV variants: unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark PloS ONE (6): 526 44 Wasilk A., Callahan J.D., Christopher-Hennings J., Gay T.A., Fang Y., Dammen M., Reos M.E.,Torremorell M., Polson D., Mellencamp M., Nelson E and Nelson W.M 2004 Detection of U.S., Lelystad, and European-like porcine reproductive and respiratory syndrome viruses and relative quantitation in boar semen and serum samples by real-time PCR J Clin Microbiol., 42, 4453–4461 45 Weijie Wang, Kunsong Chen, Changjie Xu, 2006 DNA quantiW cation using EvaGreen and a real-time PCR instrument Analytical Biochemistry 356: 303–305 46 Wensvoort G., Terpstra C., Pol J.M., Ter Laak E.A., Bloemraad M 1991 Mystery swine disease in The Netherlands: the isolation of Lelystad virus Vet Q 13:121–130 47 Wensvoort G., Terpstra C., Pol J.M.A., TerLaak E.A., Bloemraad M., Dekluyver E.P., Wensvoort G and Moormann R.J.M 1993 Lelystad virus, the isolation of Lelystad virus Vet Q., 13, 121–130 84 48 Wissink E H., Kroese M V., Maneschijn-Bonsing J G., Meulenberg J J., Rijn P A van , Rijsewijk F A., and Rottier P J 2004 Significance of theoligosaccharides of the porcine reproductive and respiratory syndrome virusglycoproteins GP2a and GP5 for infectious virus production J Gen Virol 85:3715–3723 49 Wu W.H., Fang Y., Farwell R., Steffen-Bien M., Rowland R.R., ChristopherHennings J., and Nelson E 2001 A 10 kDa structural protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus encoded by ORF2b Virology 287: 183-191 50 Yoon I.J., Joo H.S., Christianson W.T., Kim H.S., Collins J.E., Morrison R.B and Dial G.D 1992 An indirect fluorescent antibody test for the detection of antibody to swine infertility and respiratory syndrome virus in swine sera J Vet Diagn Invest., 4, 144–147 51 Youjun Feng, et al 2007 Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome Virus Variants, Vietnam and China, Emerging Infectious Diseases 14: 1774-1776 Tài liệu internet www.loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/rt_index.html www.loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/rt_index.html www.roche-applied-science.com www.agraroldal.hu 85 Phu lục Kết giải trình tự đoạn gen ORF7 loại vacxin AmerVac Vacxin IngelVac Trình tự nucleotide đoạn gen ORF7 vacxin AmerVac Trình tự xi Trình tự ngược Trình tự nucleotide đoạn gen ORF7 vacxin IngelVac Trình tự xi Trình tự ngược Kết BLAST trình tự NCBI Phụ lục 2: Kết giải trình tự sản phẩm RT-PCR khuếch đại vùng ORF6 từ mẫu thực địa Kết giải trình tự sản phẩm RT-PCR với mồi xuôi FORF6CL Kết giải trình tự sản phẩm RT-PCR khuếh đại đoạn ORF6 với mồi ngược RORF6CL Kết Blast trình tự ORF6 phản ứng RT-PCR khuếch đại từ chủng PRRSV thực địa ngân hàng gen (GenBank – NCBI) so với chủng JF796180 Phụ lục Kết giải tự sản phẩm PCR khuếch đại đoạn ORF6 từ DNA plasmid Kết giải tự sản phẩm PCR khuếch đại đoạn ORF6 từ DNA plasmid với mồi xuôi FORF6CL Kết giải tự sản phẩm PCR khuếch đại đoạn ORF6 từ DNA plasmid với mồingược RORF6CL Kết Blast trình tự ORF6 phản ứng RT-PCR khuếch đại từ chủng PRRSV thực địa ngân hàng gen (GenBank – NCBI) so với chủng JF796180