VIEN PASTEUR TP.HCM CONG HOẢ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
- Độc lập - Tự do - Hạnh phúc TP.HCM, ngày — tháng - năm 2011
_ BAO CAO THONG KE
KET QUA THUC HIEN DE TALDU AN SXTN I THONG TIN CHUNG
1 Tên để tài/dự án: Nghiên cứu chế tạo kit chẵn đoán virút cúm A/HINL bằng kỹ thuật RT-PCR Mã số đề tài, dự án: ĐTĐL 2009G/56 Thuộc: - Độc lập (fên lĩnh vực KHƠN): 2 Chủ nhiệm để tài dự án:
Họ và tên: Cao Thị Bảo Vân
Ngày, tháng, năm sinh: 16/07/1962 Nam/Nữ: Nữ
Hoc ham, học vị: Tiền sỹ
Chức vụ: Phó Viện trưởng Viện Pasteur TP.HCM
Điện thoại: Tổ chức: 848-3820 6410 Nhà riêng; 348-3844 9589
Mobile: 0903761753
Fax: 848-3820 6410 E-mail: vancao@)hcm.vnn.vn
Tên tổ chức đang công tác: Viện Pasteur TP.HCM
Địa chỉ tổ chức: 167 Pasteur, P.8, Q.3, TP.HCM
Địa chỉ nhà riêng: E17 K300 Cộng hòa, Q Tân Bình, TP.HCM
3 Tổ chức chủ trì để tài dự án:
'Tên tổ chức chủ trì đề tài: Viện Pasteur TP.HCM
Điện thoại: 848-38230352 — Fax: 848-3823 1419
Trang 2
Địa chỉ: 167 Pasteur, P.8, Q.3, TP.HCM
Ho và tên thủ trưởng tổ chức: Trần Ngọc Hữu
Số tài khoản: 934.01.03.00014
Ngân hàng: Kho bạc Nhà nước Quận 3 — TP.HCM
'Tên cơ quan chủ quản đề tài: Bộ Khoa học và Cơng nghệ TL TÌNH HÌNH THỰC HIỆN 1 Thời gian thực hiện để - Theo Hợp đồng đã ký k: - Thực tế thực hiện: từ tháng 10/2009 đến tháng 06/2010 - Được gia hạn (nếu có): + Lần 1 từ tháng 04/2010 đến tháng 06/2010 2 Kinh phí và sử đụng kinh phí: a) Tổng số kinh phí thực hiện: 1.400 tr.đ, trong đó: + Kính phí hỗ trợ từ SNKH: 1.400 tr.đ + Kinh phí từ các nguồn khác: 0 tr.đ + Tỷ lệ và kinh phí thu hồi đối với đự án (nêu có): Đ) Tình hình cấp và sử dụng kinh phí từ nguồn SNKH: ừ tháng 10/2009 đến tháng 03/2010
số Theo kế hoạch: Thực tỄ đụ được Ghi chit
rr| Thờ giam | Kinhphí | Thờigian | Kinh phi (Số đề nghị
(Tháng, năm) (Tr.d) (Tháng, năm) (rẻ) đuyêt toán)
1 | 01/2010 1.400 01/2010 1.400
2
Trang 3©) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chỉ: -Đối với dễ thi: - Đơn vị tính: Triệu đẳng số Theo kế hoạch Thực t đạt được TT Tổng |SNKH |Nguôn| Tổng | SNKH ]Nguon khác khác 1 | Trả công lao 400 | 400 0 3637 | 363/7 0 động (khoa học, phổ thông) 2 [Nguyên,vậtliệu, | 886 | 886 0 | 85054 | 85054 | 0 năng lượng 3 | Thiết bị, máy 24 24 0 24 24 0 móc 4 | Xây dựng, sửa 0 0 0 0 0 0 chữa nhỏ 5$ | Chỉ khác 90 | 90 0 80,08 | 80,08 0 Tổngcộng |1400] 1400| 0 |1431832|131832| 0
3 Các văn bản hành chính trong quá trình thực hiện đề tài/dự án:
(Hiệt lề các quyết ảnh văn bản của cơ quan quân lý từ công đoạn súc định nhiệm vụ xét chọn, phê duyệt kính pit, hop ding, diéu chỉnh (Đời gian, sội chung, kink pid Huge liện nếu có); vên
Sân của tổ chức chủ 0ì đề tà, dự án (đơn, kiến nghị điều chônh nếu cá) sf Số, My tàu Tên văn bản Giữ chú
1 |Số §893/PAS-VSMD Đề xuất đề tài nghiên cứu sản xuất
ngày 21/8/2009 Kit chân đoán virút cúm A/HINL
2 |Số2053/QĐ-BKHCN | Quyết định phê duyệt danh mục đề ngày 21/9/2009 tài KHCN độc lập cấp Nhà nước
Trang 4nam 2009
5 |Số2204/QĐ-BKHCN | Quyết định thành lập Tô thâm ngày 30/9/2009 định các đề t ip cap nha
nước bắt đầu thực hiện từ năm
2009
S62206/QĐ-BKHCN_ | Quyết định phê duyệt Kinh phí để ngày 30/9/2009 tài độc lập cấp Nhà nước thực hiện
trong kế hoạch năm 2009
6 |S62569/BKHCN- Xin ứng trước kinh phí năm 2010
KHTC ngày 14/10/2009 | các đề tài liên quan đến cúm
A/HINI
7 |Số16854/BTCHCSN | Ứng trước kinh phí năm 2010 để ngày 27/11/20009 thực hiện các đề tài liên quan đến
cúm A/HINL
8 |S61347/PAS ngày Xin ứng trước kinh phí đề tài 19/11/2009 “nghiên cứu kít chẩn đoán cam
AJ/HIN1 bing ky thugt RT-PCR”
Trang 54 Cá nhân tham gia thực hiện È tài, dự án: (Người tham gia thực hiện đề tài tuộc lễ chức chủ trìvà cơ quan phối lợp, không quá 10 người kế cả chủ nhiệm)
Số| Tên cá nhân | Têm cá nhân Sâm phẩm 3
T | đăng Ký theo | đãthamgila | TVÔ dung Am | sờ vấu age | OE
T | Thuyết mình | _ thục hiện 'gia chính, được | “HH 1|TS CaoThị | ViệnPasteur | Chủ nhiệm, chịu
Bảo vận TPHCM | trách nhiệm về kỹ
thuật, điều phối giám sát
2 |Ths Ngô Viện Pasteur | Thư ký, phối hợp Men
Chung Chỉnh TP.HCM sản xuất men, | polymerase,
chuẩn hóa các chỉ | tiêu chuẩn iêu bộ Kit bo kit
3 | Ths Lê Hà Viện Pasteur | Thiết kếmôi và | Các môi đặc Tam Duong TP.HCM chuẩn hóa các | hiệu, chương
điều kiện RT- trình phản
PCR img RT-PCR
4 |Ths Nguyễn | Vién Pasteur | Sản xuất và khảo Men
"Thị Yến Nhi TP.HCM sát men polymerase
polymerase
3 |Ths Nguyễn | Viện Pasteur | Kiểm định cơ sở Kết quả
Kim Dung TP.HCM bộ Kit
6 |Ths Phing | ViệnPasfeur | Tạo chứng đương Lê Trâm TP.HCM | và chứng nội của
kit
7 |CN.Nguyễn | Vién Pasteur | Khảo sát các điều | Kết quả điều
Thị Hạnh Lan | TP.HCM Kiện bảo quản kiện bảo
quản tốt nhất 8 |CN Lê Thị Viện Pasteur | So sánh hiệu quả | Kết quả so
Trang 65 Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:
(Nều tại mục Ì Š của thuyết mình, không bao gầm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sắt
trong nước và nước ngoài) Thời gian
số | Các nội đụng, công việc Ýt đầu, kết “húc Ngồi,
Tr _chhyếm nim) | cơquam
(Các mắc đánh giá chủ yêu) Thue té thực hiện a đạt được 1 | Thiết kế mỗi 9/2009— |9/2009-— 10/2009 — [10/2009 2 |Sanxuétmen Polymerase |10/2009-— |10/2009 — 12/2009 — [12/2009 3 | Chuẩn hóa các điều kiện RT- |10/2009— |10/2009 — PCR 12/2009 — |12/2009 4 | Khảo sát độ nhạy, độ đặc 11/2009 — |11/2009 — hiệu 12/2009 — [12/2009
3 | Đánh giá khả năng phát hiện |11/2009-— |11/2009 — cia RT-PCR so với phương |01/2009 |01/2009 pháp real-time RT-PCR và nuôi cắt 6 | Tạo chứng đương, chứng nội |12/2009-— [12/2009 — 01/2010 — |01/2010 7 |Khảonghiệm các điêukiện |11/2009- |11/2009— bảo quan kit 02/2010 _| 02/2010 8 | Xây dựng œy trình xét 01/2009 — [01/2009 — nghiệm bing RT-PCR 02/2009 — |02/2009 9 | Sản xuất bộ kithoàn chỉnh |02/2010— [02/2010 — 03/2010 — |03/2010 10 | Kiểm định cơ sở 03/2010 — 06/2010 11 | Báo cáo nghiệm thucơsở |06/2010 |06/2010
12 | Kiếm định tại Trung tâm 10/2010
Kiểm định Quốc gia NICVB
Trang 7
I SAN PHAMKH&CN CUA DE TAL DU AN
1 Sản phẩm KH&CN đã tạo ra: a) Sin phẩm Dạng I và II: Yêu cẫu khoa học số _ cần đạt _ Tên sản phẫm "Theo kế hoạch Thực tế| Gữchú IT đại được
1 | Qui trình chế tạo bộ | Phát hiện chuẩn xác, Đạt | Đã thông qua
kit chin đoán cúm _| đặc hiệu Được thông Hội đồng khoa
A/HIN1 qua Hội đồng khoa học học
chuyên ngành
2 | Qui trình sử dụng | Đơn giản, chuẩn xác Đạt | Đã thông qua
bộ Kit trong chẩn _ | và để thực hiện Được Hội đồng khoa đoán cúm A/H1NI | thông qua hội đồng học và triển
khoa học chuyên Khai ở một số
ngành TTYTDP các
tỉnh phía Nam 3 | Tiêu chuẩn cơsở | Giới hạn pháthi Đạt | Thông qua
của bộ kít 10° copies, d6 nhay > kiém dinh co
90% độ đặc hiệu sở và Trung,
95%; lai Tam kiém
>99%; giá trị tiên đoán định Quốc gia
âm — duong >90% NICVB
4 |KIRT-PCRphát |5000te#kit Đạt
hiện cúm A/HIN1/09
b) Sản phẩm Dạng II:
Yêu câu khoa học SỐ lượng,
Số ¬.- cân đạt nơi công bố
TT đến sản phẩm Theo Tete | (62 5
kế hoạch đạt được xuất bản)
Trang 8NXB Khoa học và Công nghệ Bài báo khoa học Không Có 1, Tạp chí Ý học dự phòng năm 2011, NXB Tổng Yhọc Việt Nam ©) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN đã được ứng dụng vào thực tế
Số Tên Kết quả ares Dia diem Két qua
TT |_ đã được ứng đụng | TRI | Onan ee | sobs T BO kit pFLU 1072010 | Trung tam ¥ té | Pháthiện
Du phing | virus cim A
Trang 92 Đánh giá về hiệu quả do để tài, dự án mang lại:
3) Hiệu quả về khoa học và công nghệ
(lều rõ danh mục công nghệ và mức độ nắm vững, làm chủ, so sánh với trình độ công,
nghệ so với khu vục và thê giới )
ĐÈ tài ứng dụng thành công thành tựu mới về công nghệ sinh học phân tử trong chẩn đoán các tác nhân gây bệnh trên người đặc biệ là virus mà các
quốc gia trên thế giới đang và sẽ tiếp tục ứng dụng trong tương lai
Đ) Hiệu quả về kinh tế xa hi
(Nều rõ biệu quả làm lợi (nh bằng Hầu dự kiến do để lài, dự án tạo ra so với các sẵn phẩm
cùng loại trên thị trường )
Kết quả của đề tài đã tao ra bd sinh phim chan đoán virus cúm A nói chung và virus cúm A/HIN1/09 nói riêng đạt các tiêu chuẩn kỹ thuật (độ nhạy, độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện ) tương đương hoặc cao hơn các sản phẩm tương tự trên thị trường với giá thành dự kiến sẽ thấp hơn Mặc khác bộ sinh phẩm này có thể được sử dụng rộng rãi ở nhiều phòng xét nghiệm tuyến tỉnh mà
một số ảnh phẩm như realtime RT-PCR (CDC) khó có thể được áp dụng
3 Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của để tài, dự án:
Nội đưng
Ghi chit
(Tom tắt kết quả, kết luận
chính, người chit tri.) số TT 1 Kiểm tra báo cáo định kỳ
Lần 1 03/2010 Hoan tat co ban khéi
lượng công việc theo yêu
cầu của đề tài và đạt tiến
độ đề ra (BKHCN),
TT | Nghiệm fhu cơ sở 06/2010
Đề tài được đánh giá Đạt
Trang 10MỤC LỤC Lời mỡ đầu Chương1: Tổng quan tài 11 111 112 1.2 121 1.2.2 1.23 13 131 1.3.2, 13/21 1.3.2.2 1.3.23 1.33 134 1.4 Tình hình dịch tẾ virút cúm đại dịch A/H1N1-2009 Tình hình thể giới Tình hình V iệt Nam Virút cúm đại địch Virút cúm A Các đại dịch cúm trong quá khứ Virút cúm A đại dịch HTN1/2009
Các phương pháp chan đoán cúm
Phương pháp huyết thanh học Phương pháp rniễn dịch
Phương pháp mién dich enzyme Phương pháp chẵn đoán nhanh
Phương pháp rniễn dịch huỳnh quang
Trang 11141 142 1.5 abi 1.5.2 16 1.61 1611 161.2 1.6.1.3 1.6.14 1.62 1.63 Phương pháp chẩn đoán nhanh kháng nguyên Phương pháp phân tử 'Tác nhân ảnh hưởng đến kết quả chẵn đoán virút cum Loại mẫu bệnh phẩm Chất lượng mẫu Các đặc tính quyết định việc đánh giá chính xác trong chan đoán Các đặc tính hiệu suất
Độ nhạy và đô đặc hiệu
Giá trị tiên đoán đương và tiên đoán âm Độ lấp lại
Độ chính xác
Các đặc tính sử dụng
Chọn lựa phương pháp chuẩn tham khảo
Trang 122.3 2.3.1 2311 2.3.1.2, 2.3.2 2.3.2.1 2.3.2.2, 23.3 23.4 2.3.5 2.3.5.1 2.3.5.2, 2.3.6 23.7 23.8 23.9 2.3.10,
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp thu mẫu bệnh phẩm
Loại mẫu
'ận chuyển và trữ mẫu
Phương pháp nuôi cấy phân lập virút cúm trên tế bào MDCK: Chuẩn bị tế bào MDCK trước nuôi cấy
Nuôi cấy virút
Phản ứng ngưng kết hồng cầu
Tach chiét RNA vinit
Phuong phap real-time PCR Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng, Thực hiện phản ứng Phuong phap RT-PCR Phân tích sản phẩm PCR bing dién di Thiết kế mỗi Xây dựng chứng nội Phương pháp biến nạp
2.3.10.1 Nối DNA mục tiêu vào vector
Trang 132.3.10.4 2.3.10.5, 2.3.11 23111 23.112 23.12 2.3.13 23.14 23.141 2.3.14.2 23.143 2.3.15 2.3.15.1 2.3.15.2 2.3.15.3 2.3.15.4 2.3.15.5,
'Tách plasmid mục tiêu từ tế bào chọn lọc Cắt plasrnid mục tiêu bằng enzyrne cắt giới hạn Phương pháp sản xuất enzyme
Điều kiên nuôi cây và biển hiện
Chiết xuất và tính sạch enzyrne
ign di SDS-PAGE
Dinh luong plasmid DNA Phương pháp giải trình tự
Tinh sạch sản phẩm DNA cần giải trình tự PCE đánh dấu sản phẩm DNA cần giải trình bự Xử lý mẫu DNA và nạp mẫu vào máy giải trình tự,
Các phương pháp thống kê Độ nhạy,
Độ đặc hiệu
Giá trị tiên đoán đương Giá trị tiên đoán âm
Ước tính cỡ mẫu cho phân tích độ nhạy và độ đặc hiệu
Chương3: Kết quả và bàn luận
Trang 14Sua 3111 3.1.1.2 3/5 3121 819/2, Bled, 3141 3.1.4.2, 3.1.5, 315.1 32 31873 3.1.6 3.1.61 3.1.6.2, 3.1.63 3.2 Thiết kế mỗi So sánh trình tự và thiết kế mỗi
Kiểm tra độ đặc hiệu của mỗi được thiết kế
Điều chế enzyme Taq polymerase
Biéu hién va tinh sach Taq polymerase
Hoat tinh Taq polymerase
Khảo sát hỗn hợp enzyme phản ứng RT-PCE Chuẩn hóa các điều kiện phản ung RT-PCR Khảo sát điều kiện phản ứng RT-PCR đơn Khảo sát điều kiên multiplex ET-PCE
Xây dựng chứng nội cho phản ứng multiplex RT-PCE Quy trình tạo chứng nội
Khảo sát nồng độ chứng nội tối thiểu cho phản ung RT-PCR
Khảo sát nồng độ mỗi cho phản ứng multiplex ET-PCR có chứng nội
hảo sát đô nhạy và độ đặc hiệu
Trang 153ã 3.2.2 3.23 3.3 33.1 3.3.2 3.3.3
hảo sát điều kiện bảo quản 34
Quy trình xét nghiém bing RT-PCR 85
Tiêu chuẩn cơ sở 87
Trang 16aa ATCC BHI BHIA BSA cpe CPE cDNA ddH20 ddNTP DDT DEPC dNTP DNA DNase dsDNA E.coli EDTA EIA ER FAO
DANH MUC CHU VIET TAT
Amino acid (axit amin)
The American Type Culture Collection
(Ngân hàng giống tế bào tại Hoa Kỷ)
Brain-Heart Infusion (Moi trường nước thịt đạng lỏng) Brain-Heart Infusion Agar
(Môi trường nước thịt dang thach) Base pair (Cặp base)
Bovine serum albumin (Albumin huyét thanh bò) Center of Disease Prevention and Control
(Trung tâm ngăn ngửa và kiểm soát dịch bệnh Hoa kỳ)
Cytopathic effect (Hiện tượng hủy hoại tế bào) Complementary DNA (DNA bé sung)
Deionized distilled water (ước cất khử ion) Dideoxy nucleoside triphosphates Dichlorodiphenyltrichloroethane Diethyl pyrocarbonate Deoxynucleotide Triphosphate Deoxyribonucleic acid Deoxyrib onuclease
Double-stranded DNA (DNA mạch đôi)
Vị khuẩn Escherichia coli
Ethylene-Di-amine-T etra-acetic acid Enzyme irnmuno assay
Endoplasmic reticulum (Luéi n6i chất) Food and Agriculture Organization
(Tỗ chức Lương - Nông Thế giới)
Trang 17HAU HBSS HPAL Ic INF TG kb LB LPAI MDAS MDCK MEM mRNA mRT-PCR NA NASBA NCBI ng
False negative (Am tinh gia)
False positive (Duong tinh gid) Haemagglutinin
Hermagglutination unit (Don vi ngung kết hỗng cầu)
Hank's Buffered Salt Solution Highly pathogenic avian influenza Cúm gia cầm độc lực cao Intemal control (Chứng nội) Tnterferon Isopropyl B-D-1 -thiogalactopyranoside Kilobasepairs 1000bp)
Luria Bertani medium (Méi trong LB) Low pathogenic avian influenza
(Cúm gia cầm độc lực thấp)
Melanoma differentiation antigen 5 Madin-Darby Canine Kidney cell
(Tế bào thân chó Madin-Darby) ‘Mminimum essential medium
(Môi trường thiết yếu tối thiểu)
Milimolar
Messenger RNA (RNA théng tin)
Multiplex reverse transcription - polymerase chain reaction
Neuraminidase
Nucleic acid sequence-based amplification
National Center for Biotechnology Information (Trung tâm Quốc gia về thông tin công nghệ sinh học của Hoa kỳ)
Nuclear export protein ŒProtein xuất nhân)
Trang 18GIE PCR PFU PPV RBC Realtime PCR RT-PCR RIDT RIGI RNA RNP rpm RT-PCR SDs 8.0.C ssDNA Ta TCIDsp Nanometer Nuclear located signal (Tín hiệu hướng nhân) Nueleoprotein Negative predictive value (Gid trị tiên đoán âm), Nghiệm thức
Optical đensity (Mật độ quang)
‘World organisation for animal health (Tổ chức Thú y Thể giới)
Polymerase chain reaction (Phan ting khuéch dai chudi) Plaque forming unit on vi hinh thanh vét tan)
Positive predictive value (Giá trị tiên đoán đương) Red blood cell (Té bào hồng cầu)
Real — time polymerase chain reaction
Real — time reverse — transcription polymerase chain Reaction
Rapid influenza diagnostic test ectinoi acid inducible gene - 1 Ribonucleic acid
Ribonucleoprotein
Round per minute (V ong/phiit)
Reverse transcription - polymerase chain reaction (Phản ứng khuếch đại chuỗi kết hợp phiên mã ngược) Sodiur dodecyl sulfate
Super optinal broth with catabolic repressor (Môi trường giàu định dưỡng)
Single-sranded DNA (DNA mạch đơn)
.Annealing temperature (Nhiệt độ bắt cặp)
50% tissue culture infectious dose
Trang 19TEMED Tm TN TP vRNA vRNP WHO Hệ 'Tetramethylethylenediamine
Melting temperature @thiét độ tan chảy)
True negative (Am tính thực)
True positive (Duong tinh thc) Ultraviolet (Tia oe tím)
Viral RNA (RNA cia virit)
Viral ribonucleoprotein (Rib onucleoprotein ca virit)
‘World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới)
Microgram Microliter
Trang 20DANH MỤC BANG VA HÌNH
DANH MUC BANG
Bing 1.1 C4c axit amin quan trong trên các protein có vai trò trong độc tính virút
củm 15
Bảng 1.2 So sánh các xét nghiệm chẩn đoán cúm hiện có 21 Bảng 2.1 Thành phần hỗn hop (mix) chẵn đoán cúm A/H1N1 2009 bằng rRT-PCE
37 Bing 2.2 Chong trình nhiệt cho phản ứng rRT-ĐCR chẩn đoán cúm A/HIN1 38
Bang 2.3 Chuyển đỗi 1 đơn vị hấp phụ ở bước sóng 260nm 43 Bảng 3.1 Bảng nồng độ mỗi được khảo sát trong phản ứng multiplex RT-PCR cé
chứng nội 7
Bằng 3.2 So sánh kết quả 2 phương pháp rnultiplex RT-PCR và rET-PCE S0
Bảng 3.3 Tiêu chuẩn cơ sở cho qui trình sản xuất kit xét nghiêm virút cúm đại địch
Trang 21DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình 1.2 Hình 1.3 Hình 1.4 Hình 1.5 Hinh L6 Hinh 1.7 Hình 1.8 Hình 2.1 Hình 2.2 Hình 2.3 Hình 2.4 Hình 3.1 Hình 3.2 Hình 3.3: Hình 3.4 Hình 3.5 Hình 3.6 Hình 3.7
Ban dé phân bố số ca mắc và tử vong do cúm đại dịch 2009
Ban đỗ hoạt động của các type (subtype) virút cúm đầu năm 2010
Biểu đồ số ca tử vong tại các tỉnh phía Nam (V iện Pasteur TP.HCM)
Cấu trúc hạt virút cam A
Chu trình sinh trưởng của virút cúm A trong tế bảo chủ
Mối liên hệ của các chủng virút gây đại dich từ 1918-2009
Hình dang virút cúm A/HIN1
Nguồn gốc tái tổ hợp của virút cúm A đại dịch HIN1/2009 Loại mẫu xét nghiệm virút cũm A/H1N1-2009
Minh họa phương pháp HA
Sơ đỗ biến nạp plasmid tái tổ hợp vao té bao E.coli Nguyễn tắc máy giải trình tự DNA tự động
Kết quả so sánh độ tương đồng các gen H,N và M trên NCBI Trinh ty gen M và gen H1 bảo tồn
Các mỗi được thiết kế để phát hiện virút cúm A/H1N1-2009
Kiểm tra đô đặc hiệu của mỗi
Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp pTTQ18 vào E Coli, K& qua phan tich SDS-PAGE Taq polymerase
Trang 22Hình 3.8 So sanh hỗn hợp enzyme RT-PCR Hình 3.9 Khảo sát tỷ lệ thành phần hỗn hợp enzyme Hình 3.10 Hình 3.11 Hình 3.12 Hình 3.13 Hình 3.14 Hình 3.15 Hình 3.16 Hình 3.17 Hình 3.18 Hình 3.19 Hình 3.20 Hình 3.21 Hình 3.22 Hình 3.23 Hình 3.24 Hình 3.25 Hình 3.26 Hình 3.27
8o sánh hỗn hợp cdc enzyme chay RT-PCR 1 tube
hảo sát nhiệt độ phản ứng phiên rã ngược cho từng cặp mỗi hảo sát nhiệt độ bắt cặp mỗi phản ứng đơn
hảo sát nông độ mỗi cho phản ứng đơn
Kết quả khảo sát nỗng độ Mg” trong phản ứng đơn
Két qua khảo sát nồng độ đNTP trong phản ứng don
hảo sát thời gian phiên mã ngược phản ứng đơn
hảo sát thời gian trong phản ứng khuếch đại chuỗi ŒCE) đơn
hảo sát nhiệt độ phiên mã ngược trong phản tng multiplex
Khao sit nhiệt đô bắt cặp trong phản ứng khuếch đại chudi multiplex
hảo sat ndng d6 mdi cho phan ting multiplex
Két qua khảo sát nồng độ Mg2+ trong phản ứng multiplex Két qua khảo sát nồng d6 dNTP trong phản tng multiplex
hảo sát thời gian phiên mã ngược trong phản ứng multiplex hảo sát thời gian khuếch đại chuỗi (CR) phan ing multiplex
Két qua khuéch dai MA1-MA2
Trang 23Hình 3.28 Kết quả kiểm tra IC chén vao plasmid bing PCR 75 Hình 3.29 Kết quả khảo sát nồng độ chứng nội trong phản ứng RT-PCR 76 Hinh 3.30 Kết quả nồng độ mỗi trong phản ứng multiplex RT-PCE có chứng nội
71
Hình 3.31 Xác định số bản sao gen H1 bằng phương pháp rRT-PCR 79
Hình 3.32 Giới hạn phát hiện của phương pháp multiplex RT-PCE 79
Hình 3.33 Kết quả 28 trong số 63 mẫu dương tính cúm A/H1N1-2009
xét nghiém bang multiplex RT-PCR 80
Hình 3.34 Kết quả nuôi cấy mẫu bệnh phẩm virút cúm A/H1N1-2009 81
Hình 3.35 Kết quả độ lặp lại của phản ứng mRT-PCR 82
Hinh 3.36 Kết quả bảo quản RNA virút %3
Tình 3.37 Khảo sát nhiệt độ và thời gian bảo quản hỗn hop multiplex %5
Hình 3.38 B6 kit pFLU thành phim 88
Hình 3.39 Két qua kiém dinh co sé tai Vién Pasteur TP.HCM 89
Hình 3.40 Giấy chứng nhận của Viện Kiểm định Quốc gia 9
Hình 3.41 Triển khai kit pFLU tai TTYTDP An Giang 93 Hình 3.42 Triển khai kit pELU tại TTYTDP Bạc Liêu 94
Hình 3.43 Trién khai kit pFLU tai TTY TDP Bến Tre 95
Hinh 3.44 Triển khai kit pFLU tại TTYTDP Đà Lạt 96
Trang 24LỜI MỞ ĐẦU
Lịch sử đã ghỉ nhận ba đại dịch cúm vào các năm 1918 (cúm Tây Ban
Nha), 1957 (cam Chau A) và 1968 (cúm Hồng Kông) So với các vụ dịch cam
mùa hàng năm thường xảy ra vào các tháng mùa đông, đại địch cúm thường, xuất hiện sau vài thập kỷ Đại dịch cúm Tây Ban Nha 1918 được cho là đã
cướp đi trên 40 triệu người trên thế giới trong vòng chưa đầy một năm
Cuối tháng ba và đầu tháng 4 năm 2009, vụ dịch cúm A H1N1 đã được
phát hiện đầu tiên ở Mexico và sau đó lan ra một số nước lân cận Bệnh cảnh
lâm sàng nhiều trường hợp nhiễm cúm H1N1-2009 khác biệt rõ rệt so với các
trường hợp nhiễm cúm mùa thông thường hàng năm, trong đó tỉ lệ mắc tập
trung vào nhóm người trẻ khỏe mạnh Ngày 11/6/2009, Tổ chức Y tế Thé giới
(WHO) tăng mức cảnh báo đại địch lên mức độ cao nhát, pha 6, cho thấy mức lan rộng trong cộng đồng ở ít nhất hai đại lục
Các dữ liệu cuối năm 2009- đầu 2010 từ nhiều vùng địch khác nhau cho
thấy chủng virút cúm đại địch HIN1-2009 lây lan rất nhanh và trở thành
chủng chiếm ưu thế tại nhiều nơi trên thế giới Theo thống kê của WHO đến
ngày 19/3/2010 đã có trên 213 quốc gia và vùng lãnh thổ có người bị nhiễm virút cúm đại địch 2009 và nâng tổng số người tử vong lên trên 16800 người
Cũng tại thời điểm này, Bộ Y tế Việt Nam đã ghi nhận trên 11000 trường hợp bị nhiễm bệnh tại 60/64 tỉnh thành Việt Nam, con số tử vong là 58 người
Hiện tại, các kỹ thuật phòng thí nghiệm trong chẩn đoán virút cúm đại
dich A/H1N1-2009 bao gồm các kỹ thuật phân tử, phân lập qua nuôi cáy, định
type bằng phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu HI hay miễn dịch huỳnh quang
và test nhanh [54] Trong đó test nhanh có thể được sử dụng rộng rãi nhất
trong chẩn đoán virút cúm ở nhiều quốc gia Tuy nhiên giá thành của các bộ
Trang 25triển Việc sử đụng các test nhanh trong chẩn đoán virút cúm đại dich A/H1N1-2009 cũng đang gặp nhiều tranh cãi do tính chính xác của nó Do đó các phương pháp chẩn đoán phân tử hiện được lựa chọn để phát hiện virút cúm đại dịch 2009
Phương pháp phiên mã ngugc real-time PCR (RT-PCR) duge CDC xây dựng và đã được sử dụng đầu tiên trong chẩn đoán virút cám dai dich
2009 [54] Phương pháp này có ưu điểm ít tốn thời gian và có độ nhạy cao
hơn một số phương pháp truyền thông Nhưng đây là phương pháp đòi hỏi sử đụng máy móc chuyên dụng đắt tiền, bộ mởi/mẫu dò phải được thay đổi phù hợp tình hình địch tễ và kỹ thuật viên có kinh nghiệm Do đó phương pháp này khó có thể sử đụng rộng rãi ở tất cả các phòng xét nghiệm, đặc biệt là phòng xét nghiệm ở vùng sâu vùng xa
Chính vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài này nhằm tạo ra bộ kít chẩn đoán đồng thời virút cúm A nói chung và virút cúm HIN1 đại địch 2009, sử dung phương pháp phân tử khá đơn giản và yêu cầu thiết bị tương đối rẻ tiền mà các phòng xét nghiệm có thể trang bị được Việc tạo ra bộ kít này có thể giúp các phòng xét nghiệm trong cả nước, kể cả các phòng xét nghiệm vùng, sâu xa phát hiện sớm bệnh nhằm kịp thời định hướng điều trị cũng như giúp ngăn ngừa 6 dich có thể xảy ra trong khu vực
Mục tiêu để tài:
1 Nghiên cứu xây đựng qui trình tao kit chin đoán virút cúm đại dịch A/HIN1-2009 bing ky thudt RT-PCR
Trang 26Chương!
TONG QUAN TAI LIEU
1.1 Tình hình địch tế virút cúm đại địch A/H1N1-2009
LALA Tink hình thể gi
Đại địch cúm do virút cũm A/HIN1 2009 là đại dịch đầu tiên của thé
kỷ 21 khởi nguồn từ các nước ở khu vực Bắc Mỹ, đầu tiên có thể từ Mexico
(7)
Khoảng cuối tháng giêng và đầu tháng hai năm 2009, Mexico ghi nhận ng cúm (ILD được cho là biểu
sự tăng vọt các bệnh nhân mang triệu chứng,
hiện đặc trưng của virút cúm mùa Các nhà chức trách về sức khỏe Mexico
cho rằng vụ dịch do virút cũm A/H1N1 “mới” có thé bắt đầu vào giữa tháng
ba khi quốc gia này xảy ra nhiều trường hợp có triệu chứng hô hấp cấp, chủ
yếu ở những người trẻ tuổi và khỏe mạnh Ngày 14 tháng 4 một bệnh nhân trẻ
tuổi đến phòng mạch tại Bang Oxaca khám với triệu chứng hô hấp cấp không,
đặc trưng và tử vong sau đó Các bác sỹ điều trị cho rằng có thể do SARS, nhưng kết quả kiểm tra âm tính Mẫu tử vong được kiểm tra một lần nữa và
xác định bệnh nhân đã bị nhiễm virúf cúm A/H1NI “mới”
Tại Hoa kỳ, các trường hợp đầu tiên được phát hiện vào giữa tháng 3/2009 là 2 trẻ em ở nam Califomia Trường hợp tử vong đầu tiên được báo cáo vào ngày 29/4/2009 ở một bệnh nhỉ 23 tháng tuổi Từ đó mạng lưới giám sát cúm trên toàn Hòa kỳ đã được tăng cường mạnh mẽ
Quốc gia thứ 3 phát hiện virút cúm đại dịch 2009 là Canada vào cuối
tháng 4 năm 2009 Các virút cũm được nhận đạng tương tự virút cúm ở Hoa kỳ và Mexico [55]
“Trước tình hình gia tăng số bệnh nhân bị nhiễm cúm A/HINI1 mới tại các nước thuộc Châu Mỹ và đặc biệt là sự lan rộng trong cộng đồng ở
Trang 27Mexico, ngày 27/4/2009 Tổ chức Y tế thế giới (WHO) cảnh báo đại dị ch cam
A/HIN1 ở mức 4 Đây là mức chỉ sự lan truyền từ người sang người của chủng virút cúm động vật hay chủng virút cúm tái tổ hợp
'WHO tiếp tục tăng mức độ báo động đại địch cúm A/HINI lên mức 5 vào ngày 29/4, mức báo động cho thấy mức độ ảnh hưởng và lan rộng của
Trang 28Đến ngày 11/6/2009, sau hai tháng kể từ khi phát hiện chủng virút cúm
“mới”, WHO tuyên bó đại địch cúm đã thực sự nỗ ra trên toàn cầu với tốc độ
lây lan từ người sang người, từ quốc gia này sang quốc gia khác và từ vùng,
này sang vùng khác một cách nhanh chóng Tại thời điểm đó gần 30.000
trường hợp dương tính đã được phát hiện ở 74 quốc gia và vùng lãnh thổ, trong đó có 114 trường hợp tử vong
Cho đến nay đã có trên 200 quốc gia và vùng lãnh thổ xác định có
trường hợp bị nhiễm virút cúm đại dịch 2009 và con số người mắc lên đến
hàng trăm ngàn trường hợp, trong đó số lượng tử vong trên 17 ngàn người
(WHO, 16/4/2010) (hình 1.1) Tuy nhiên theo đánh giá của các chuyên gia cơn số này trên thực tế có thể lớn hơn rất nhiều do số người nhiễm bệnh không được xét nghiệm hoặc không đi xét nghiệm rất lớn
Hiện tại, virút cám đại dịch 2009 phân bó chủ yếu ở các khu vực châu Mỹ, Đông phi, Tây Phi và Đông Nam Á Tại các khu vực này virút cúm đại địch 2009 vẫn là chủng cúm chiếm ưu thế và lưu hành song song với các chủng cúm mùa (A/HINI, A/H3N2 và B) và đặc biệt là cúm gia cầm
(A/H5N)) tại khu vực Đông và Đông Nam Á (hình 1.2)
Percentage of respiratory specimens that ested positive tor influenza eee
Tình 1.2 Bản đồ hoạt động của céc type (subtype) vinit cún đầu năm 2010
Trang 291.1.2 Tình hình Việt Nam
Việt Nam là nước thứ 54 trên thế giới thông báo phát hiện bệnh nhân
nhiễm virút cúm đại A/HIN1-2009 Ca đương tính đầu tiên tại Việt Nam được phát hiện vào ngày 30/5/2009 là một du học sinh từ Hoa Kỳ về Kế từ
đó Việt Nam đã thực sự bước vào cuộc chiến chống đại địch với chính sách thắt chặt việc rà soát thân nhiệt, cách ly kiểm tra đối với những người có biểu hiện thân nhiệt bất thường tại các cửa khẩu, sân bay Ngoài ra những người từng tiếp xúc với trường hợp dương tính cúm A/H1N1-2009 hay từ các vùng,
dich tế về cũng được cách ly giám sắt
Hiện tại tình hình lây lan cũng như mốt nguy hiểm do virút cúm đại
dich A/HIN1-2009 gây ra tai Vi
được lý giải: thứ nhất là đo chiến dịch giám sát virút cúm dai dich A/HIN1- Nam có vẻ lắng xuống Điều này có thể
2009 đã được thay đổi kế từ cuối năm 2009 từ chỗ xét nghỉ
đại trà trong
cộng đồng đến việc chỉ giám sát các vùng nguy cơ, phát hiện, kiểm soát và ngăn chặn tại chỗ (không cần phải xét nghiệm từng cá nhân); thứ hai virút cúm thường gây dịch theo mùa nhất định, ở vùng ôn đới virút thường gây địch vào mùa thu — đông, còn ở các nước nhiệt đới virút thường hoạt động mạnh vào mùa mưa (WHO), do đó nhiều khả năng virút cúm đại dịch HINI-
Trang 30Theo báo cáo của Bộ Y tế ngày 20/3/2010, Việt Nam đã xác định 11.202 trường hợp đương tính với virút cúm dai dich HIN1-2009 tại 60/64 tỉnh, thành phó 15 địa phương ghỉ nhận có trường hợp tử vong, nâng tổng số ca tử vong lên 58 người, trong đó phụ nữ mang thai chiếm 23%, trẻ em đưới
10 tuổi chiếm 14,39
1.2 Virút cúm đại địch 12.1 VWúf cúm 4
Virút cim A thuộc họ C#£homyxoviridae, và được chia thành các thứ type (subiype) khác nhau dựa trên hai kháng nguyên bề mặt Haemagglutinin (HA) và Neuraminidase (NA) Hiện tại, có 16 kháng nguyên HA (H1 — H16) và 9 kháng nguyên NA (N1 — N9) đã được xác định Virút cũm A có bộ gene gém 8 soi RNA don, mach 4m (-), mỗi loại mã hóa cho một hoặc hai protein
(hình 1.4) [26]
Hình 1.4 Cấu trúc hạt virút cm A
Protein HA có chức năng gắn kết với các thụ thể, và dung hợp virút với
màng tế bào chủ Sau khi xâm nhập vào tế bào theo cách thực ẩm bào
Trang 31axít, các ion H+ bên trong thể nhân đi vào hạt virút thông qua kênh ion M2 để phát vỡ tương tác protein - protein, nhờ đó cắt đứt liên kết giữa vRNA và M1,
phóng thích RNP vào nhân tế bào chủ [26] Tại đây, xảy ra quá trình sao chép và phiên mã vRNA nhd ba protein c6 hoat tinh polymerase: PB1, PB2, PA cing véi protein NP (nucleoprotein) Cac phitc hé ribonucleoprotein (vRNP)
mới tổng hợp xong sẽ được chuyên từ nhân ra tế bào chất nhờ tín hiệu xuất nhan (nuclear export protein — NEP) của N%2 và protein nền M1 [37] Tại bề
mặt tế bào chủ, các vRNP kết hợp với các thành phan cần thiết được màng tế
Trang 321.2.2 Các đại địch cúm trong quá kh"
Xirút cúm A đã gây ra nhiều trận dịch trong quá khứ, một vài trận trong, số đó phát triển thành đại dịch Đại dịch cúm xuất hiện thường là do sự phát triển của chủng virút mới, xa lạ với hệ miễn địch ở người Có hai nguyên nhân chính: quá trình tái sắp xếp vật liệu đi truyền (reassortment) và sự lây truyền qua nhiều loài khác nhau (interspecies transmission) dan đến việc hình thành chủng virút với các protein bề mặt HA, NA hoặc protein bên trong mới, rồi lưu hành trong cộng đồng người [34]
Đại dịch cúm Tây Ban Nha (Spanish influenza - H1N1) Đại dịch xảy ra
vào năm 1918 —1919 được xem như một ví dụ điển hình về tính khốc liệt của
virút cúm trong lịch sử, làm thiệt mạng khoảng hơn 50 triệu người trên toàn
thế giới Đầu tiên, đợt địch nhẹ vào mùa xuân 1918 được thay thế bởi đọt dịch
thứ hai từ tháng 9 đến tháng 11, tỉ lệ tử vong của đợt địch này lớn hơn 2,5%
so với tỉ lệ tử vong thông thường của dịch cúm là nhỏ hơn 0,1% Đợt địch thứ ba với tỉ lệ tử vong tương tự (2,596) đã lan nhanh trên toàn thé giới năm 1919
Tuy virút “cúm Tây Ban Nha” đã không được phân lập trong suốt hai năm gây đại dịch 1918-1919, nhưng trình tự bộ gene của virút này đã được
giải mã và các nhà khoa học cũng phát hiện virút HIN1 này sở hữu một số
axít amin trên nhiều protein giống với virút cúm người Virút cúm Tây Ban
Nha không có nhiều axít amin mang tinh bazo tai vị trí phân cắt trên protein
HA (multibasic HA cleavage site) — một trong số các tiêu chuẩn cho tính độc
lực cao của cúm gia cằm [34]
Bằng kỹ thuật di truyền ngược các nhà khoa học đã tái tạo ra “virút cúm
Tay Ban Nha” hoàn chỉnh cùng với những nghiên cứu trên chuột (mice) [22] và động vật linh trưởng (primates) [24] cho thấy chủng virút cúm này có khả năng gây ra những đáp ứng miễn địch bẩm sinh khác thường, một đặc điểm giống với chủng HSN1 độc lực cao Điều này góp phần gây độc lực và tỉ lệ tử
Trang 33vơng cao ở người Những nghiên cứu khác cũng cho thấy rằng, protein HA,
phức hệ sao chép (PBI, PB2, PA), NS1 và protein PB1-F2 cũng tham gia vào
tính độc lực của virút, đặc biệt protein HA va PB2 déng vai tro quan trọng hàng đầu trong khả năng lan truyền giữa các loài khác nhau của virút cúm [50]
Hinh 1.6 Mối liên hệ của các chủng virút gây đại địch từ 1918-2009
Các mũi lên màu vàng chỉ cho một hay nhiều gene được thừa hướng từ vi! cám của laài
thủy cầm Mãi lên gạch nội màu nâu cho biết chúng viưúl không lưu hành trong một thôi
lan, Mii ttn màu nâu cho thấy các con đường tiền hóa của vit cúm người, mũi lên màu xanh chỉ cho các ching cim heo (swine); vee mitt 16 mene te xank sang nâu chỉ cho virit cúm người có nguôn gắc từ hao, Cúc gone của chủng cúm người 1016, củm leo HÌN] và ctime HINH 1970 đầu có nguân gốc từ vinit cúm gia câm, một số gene khác "được lặng" cho chững cúm đại địch HINI 2009
Trang 34Dai địch cúm Chau A (Asian Influenza — H2N2) Virút cúm Châu Á ban đầu xuất hiện ở phía nam Trung Quốc vào khoảng tháng 2 năm 1957, sau đó
lan đến Singapore (tháng 3/1957), Hong Kong (thing 4/1957), Nhật Bản (tháng 5/1957), Hoa Kỳ và Vương Quốc Anh (tháng 10/1957) Chỉ tính riêng ở Hoa Kỳ, đợt địch này làm thiệt mạng khoảng 70.000 người Virút gây đại địch “cúm Châu Á” là kết quả của quá trình tái sắp xếp vật liệu đi truyền giữa virút cúm người (human) và gia cầm (avian) đẫn đến việc hình thành chủng,
H2N2 tái tổ hợp sở hữu ba gene H2, N2, PB1 của virút gia cầm va nim gene
còn lại của chủng virút cúm người [23]
Đại dịch cúm Hong Kong (Hong Kong Influenza — H3N2) Năm 1968,
chủng virút tái tổ hợp H3N2 xuất hiện và gây đại dịch, virút H3N2 này sở hữu gene H3 và PBI từ virút cúm gia cằm Virút H3N2 lần đầu tiên được phân lập
năm 1968 và gây đại địch vào mùa đông của những năm 1968 - 1970 Tại Hoa Kỳ, ước tính có khoảng 33.800 người bị tử vong trong đợt dich nay [23]
1.2.3 Vúf cúm A dai dich HIN1/2009
Hình 1.7 Hình dạng vinit chm A/H1N1
(A) Hình dáng tròn đều của hạt virlon suine HÌN) theo CDC (B) Hình dáng que dài trong thí nghiệm của Neumann, chiều dài của thanh bar
meu den lé 1 um Đa số các hạt virion cúm A đại địch H1N1/2009 có hình dang tron khé
đều đặn khi chụp đưới kính hiển vi, với đường kính từ 80 — 120 nm (CDC)
Trang 35Trong khi một số khác có hình đáng khác lạ, ví dụ khi nuôi cấy virat dai dich
HIN1/2009 trên tế bào MDCK, Neumamn thấy có khá nhiều virion có dạng
hình que đài, thậm chí có một số que virion đài hơn 1 nm (hình 1.7) [34]
Bằng phương pháp giải trình tự (sequencing) và định type gene (genotyping), các nhà khoa học đã xác định virút cúm A dai dich HIN1/2009 là kết quả tái tổ hợp của bốn dòng virút (quadruple reassortants): virút cúm heo thường (classical swine), virút cúm gia cầm Bắc Mỹ (North American
avian), virút cúm người H3N2 và virút cúm heo dòng Á — Âu (Eurasian
avian-like swine) Cụ thể, vào cuối thập niên 1990, sự tái tổ hợp của ba đòng
virút: human H3N2, North American avian va classical swine hinh thành đòng virút cúm heo H1N2 (riple reassortant H1N2) và virút cúm H3N2, đồng thời cùng lưu hành trong quần thể heo ở Bắc Mỹ Sau đó, dòng virút cúm heo
HIN2 triple này lại tái tổ hợp với virút cúm heo dòng Á — Âu tạo ra dòng
virút đại địch HIN1-2009 ngày nay [34]
Xirút cúm A dai dịch H1N1-2009 sở hữu gene PB2 và PA từ dòng virút
cúm gia cằm Bắc Mỹ, gene PBI từ dòng cúm người H3N2, gene H1, NP và
NS tir dong cúm heo thường (classical swine), gene N1 và M từ dòng cúm
heo Á — Âu (Eurasian-like swine) (hình 1.8) Các gene PB1, PB2 và PA tuy
có nguồn gốc từ người và gia cằm, nhưng chúng đã từng lưu hành trong quản thể heo từ khoảng năm 1997 ~ 1998, nên có khả năng trong thời gian đó virút
cúm heo HIN2 triple đã thích nghỉ với điều kiện sóng trong cơ thể động vật
hữu nhũ Do đó, đây cũng có thể là một trong số các yếu tố thuận lợi để cho
virút cúm heo H1N2 triple khi kết hợp với virút cúm heo dòng Á — Âu tạo thành chủng H1N1-2009 và dé dang lây nhiễm từ người sang người [34]
Trang 36& vi ` nhất 2 : } poy Ph North American
Hình 1.8 Ngudn géc tái tổ hợp của virút cúm A dai dich HIN1/2009
Sự khác biệt tại vị trí gắn kết thụ thể đặc hiệu loài trên protein HA của
virút cúm gia cầm và người do các axít amin xác định Đối với protein H2 và H3, Glutamine (Gin) tai vi tri 226 va Glycine (Gly) tai vi trí 228 sẽ đặc hiệu với thụ thể gia cầm, trong khi Leucine (Leu) va Serine (Ser) tai hai vi tri nay
sé dic hiéu voi thu thé ngudi Con déi voi H1, cdc axit amin tai vi tri190 và 225 (đếm theo chuỗi H3) xác định tính gắn kết thu thé đặc hiệu loài Asp
(Aspartic acid) tại hai vị trí 190 và 225 (được tìm thấy trong HI của virút cúm người) sẽ có nhiều khả năng đặc hiệu với thụ thể người, trong khi Giu (Glutamic acid) va Gly (Glycine) tai vị trí 190 và 225 (được tìm thấy trong HI của virút cúm gia cằm) sẽ có nhiều khả năng đặc hiệu với thụ thể gia cằm
[47] Những thông tin nghiên cứu gần đây cho thấy virút cúm đại dịch HIN1-
2009 sở hữu các axít amin “giống với H1 của chủng virút cúm người” tại hai
vi tri 190 va 225, điều này có thể giúp cho virút đại địch HIN1-2009 lan
Trang 37truyền một cách hiệu quả trên người Có một chỉ tiếc đáng lưu ý là một số chủng virút cúm đại địch H1N1-2009 lại có axít amin tại vị trí 135 hoặc 226
(chuỗi H1) giống với H5 của các chủng H5N1 phân lập từ người, mà những
vị trí này có ảnh hưởng đến chức năng gắn kết thụ thể của virat [34] Vì vậy, những đột biến này cân nên được nghiên cứu chỉ tiết hơn
Những nghiên cứu trên tế bào còn cho tháy phức hệ sao chép (PB2, PB1,
PA) cũng góp phẩn quan trọng trong độc tính virút, thông qua quá trình sinh trưởng Ngày nay, Lysine ở vị trí PB2-627 được xem là một tiêu chuẩn xác định độc tính của virúf cúm trong nhiều loài động vật hữu nhũ Những thay đổi axít amin tại vị trí này cho thấy có sự khác biệt về độc tính của virút HSN1 khi nghiên cứu trên chuột Virút với Lysine (Lys) tai vị trí này gây độc tính trên chuột, trong khi những virút với Giutamic axít (Giu) ở vị trí này không gây độc tính trên chuột [17] Điều đặc biệt là hầu hết các chủng virút cúm người sở hữu Lysine tại vị trí này, trong khi hầu hết các chủng virút gia
cằm vị trí PB2-627 là Glutamic axít, ngoại trừ các dòng H5N1 tại hồ Qinghai
(Qinghai Lake) và hậu duệ của chúng
Nhiều nghiên cứu đã mô tả cơ chế gây độc của Lysine ở vị trí PB2-627
"Thay đổi axít amin này không giúp virút ảnh hưởng đến tính hướng mô tế bào (affect tissue tropism), ma anh hưởng đến khả năng sao chép của virút Điều
này có lẽ do hoạt động ức chế trong tế bào động vật hữu nhũ nhằm ngăn cản
quá trình sao chép của virút có PB2-Giu 627 [31], hoặc cũng có thể do sự tương tác không hiệu quả giữa PB2-Glu 627 với protein NP để thực hiện quá
trình sao chép vật liệu đi truyền [42] Virút có đột biến PB2-Lys 627 sinh
trưởng hiệu quả trong đường hô háp trên của động vật hữu nhũ, điều này có lế
được lý giải từ thực tế là: virút sở hữu đột biến PB2-Lys 627 sao chép hiệu
quả ở 33C, và đây cũng chính là nhiệt độ trong đường hô háp trên của người (upper airway in human) trong khi virút sở hữu PB2-Giu 627 không có tính
Trang 38chất này Ngược lại, cả hai thể virút này lại sao chép hiệu qua 6 37°C [28]
Nhìn chung, những nghiên cứu này cho thấy virút sở hữu đột biến PB2-Lys
627 có khả năng sao chép hiệu quả trong cả đường hô hấp trên lẫn dưới — đặc điểm này có thể giúp cho quá trình lây nhiễm giữa các loài hiệu quả hơn
"Thực tế, thay thế vị trí PB2-Lys 627 bằng Giu sẽ làm giảm khả năng lây
nhiễm của virút cúm người trong thí nghiệm với chuột lang (guinea-pig) [46]
Axit amin ở vị trí 701 trên PB2 cũng được xem là một trong số các yếu
tổ góp phần vào độc tính virút, điều này có thể do khả năng gắn kết thích hợp
của PB2 đến importin ø (một nhân tố hướng nhân) trong tế bào động vật hữu
nhữ Trong chủng virút độc lực cao vị trí 701 là Asn (Asparagine), còn chủng, độc lực thấp vị trí nay 18 Asp (Aspartic acid) [14] Những nghiên cứu, so sánh
gần đây cho thấy virút cúm đại địch H1N1/2009 sở hữu các axit amin theo
đạng “độc lực tháp” (low pathogeni c-type) tại hai vị trí 627 và 701, tức là axít amin Glu va Asp (bảng 1.1) [34]
Bảng 1.1 Các axit amin quan trong trên các protein có vai trò trong độc tính virút cúm
ow ˆ Hạ, l
ie số a bs ou Teilcane ayn sone naneh dadig Hới m tn A tạ atin ice Nic int kins ti oat BE Œ Se neuro apeptsis HÀ cau Ushio Seles Te -taninalateted Ui iy NI Qungale irgehauc Mult feo pan)
NS1 14 mét protein kháng interferon (INF), chúng bất hoạt các nhân tố
phiên mã (ranscription factors) và các sản phẩm có sự kích thích từ TNE-B,
NS1 gắn kết vào các RNA sợi đôi (dsRNA) dé ngin cản khả năng hoạt hóa
phụ thuộc dsRNA của 2°-5° oligo (A) synthetase, sau d6 bat hoat RNase L — một tác nhân quan trọng của đáp ứng miễn dịch bẩm sinh Các thành quả đạt
Trang 39được trong việc nghiên cứu về cấu trúc protein những năm gần đây được hi vọng là sẽ giúp cho các nhà khoa học xác định được những vùng (đomains)
cấu trúc tiêu chuẩn cho chức năng sinh học của NSI
Đáp ứng miễn địch bẩm sinh được khỏi động sau khi thụ thể nhận biết kháng nguyên (pathogen-recognition receptor) nhận biết được một kháng nguyên lạ xâm nhập cơ thể Có nhiễu loại thụ thể nhận biết kháng nguyên như RIG-I (retinoic acid inducible gene-I) còn được gọi là DDX58, MDAS
(melanoma đifferentiation antigen 5) còn gọi là IFIHI va Toll-like 3, 7, 8
(TLRs) Khi nhiễm virút cúm, các tế bào sẽ hoạt hóa tín hiệu RTG-I, nhưng tín
hiệu này bị protein NS1 trung hòa [39], có lẽ bằng cách hình thành phức hệ
với RIG-I Ngoài ra, nhiễm virút cúm cũng ảnh hưởng đến tín hiệu TLR7 và 'TLB4, và những con chuột khiếm khuyết TLR4 thì không gây thương tổn
phổi cấp tính sau khi lây nhiễm với virút H5N1 Hiện tại, các nhà khoa học
vấn chưa hiểu rõ tác động của protein NS1 với các tín hiệu này [19]
Protein NSI của virút H5N1 kháng các tác nhân kháng virút của interferon, va lién quan dén sự biểu hiện các cytokine ở mức độ cao trong giai đoạn tién viém (pro-inflammatory), chinh tinh trạng mất cân bằng của
cytokine nay có lẽ ảnh hưởng đến tính độc lực cao của virút H5N1 khi nhiễm trên người Nhiều axít amin trên NSI liên quan đến độc tính virút, thường thì
chủng virút độc lực thấp vị trí 92 là Aspartic acid (Asp), còn chủng độc lực cao vị trí này là Glutamic acid (Giu) (Bảng 1.1) [45] Virút cúm đại dịch HIN1/2009 sở hữu axít amin thuộc dòng độc lực thấp tại vị trí này Tuy nhiên, những dữ liệu hiện tại cũng cho tháy rằng, thay đổi axit amin tai những, vị trí này mà ảnh hưởng đến độc tính cũng còn tùy thuộc từng chủng (strain-
specific manner), trong khi PB2-Lys 627 va ving phan cat trên HA chứa
nhiều axít amin mang tinh bazơ được xem như là những “yếu tố cơ bản”
(aniversal determinants) xác định về độc tính virút cúm [34]
Trang 40Khi phân tích trình tự ở quy mô lớn (large-scale), các nhà khoa học thấy
bốn axit amin tai phia đầu Carboxy (C-terminal) của NS1 hình thành PDZ
ligand domain motif Việc chuyển các PDZ ligand đomain của chủng H5N1 độc lực cao hoặc của chủng HINI đại dịch 1918 vào một chủng virút cúm người khác cũng gia tăng một phẩn nhỏ (slightly) độc tính virút trên chuột Tuy nhiên, sự gia tăng thêm chút ít độc tính này không song hành với việc gia tăng tính kháng interferon [21] Protein NS1 của virút cúm đại dich
HIN1/2009 thiếu mat 11 axít amin ở đầu Carboxy, vì vậy không có PDZ
domain motif, và đặc tính sinh học của điều này hiện tại vẫn còn là ẩn số
Gene PB1 của hầu hết virút cúm A người và gia cằm mã hóa một protein
thứ hai là PB1-F2 Độ dài protein PB1-F2 của các chủng virút cúm heo khác nhau và tùy thuộc vào nguồn gốc của chúng Virút cúm heo truyền thống (classical swine) có đoạn PBI-F2 đài khoảng 8-11 axít amin, trong khi cúm heo có nguồn gốc từ gia cầm dòng Á-Âu (Eurasian avian-like swine virus) sở
hữu đầy đủ chiều dài đoạn PB1-E2 khoảng 87-89 axít amin Virút cúm đại
địch HIN1/2009 mã hóa một đoạn PBI-E2 đài 11 axít amin PBI -E2 thúc đây
quá trình chết theo chương trình (apoptosis) của tế bào, có lẽ do tương tác với
hai protein trong ti thé [8], lam ting qué trinh viém (inflammation) trén chudt, và gia tăng tần số cũng như mức độ nghiêm trọng khi tế bào bị xâm nhiễm bởi
các vi khuẩn thứ cấp sau đó [30] PB1-F2 cũng có thể làm gia tăng độc tính bằng cách tương tác với protein PB1 để duy trì PB1 lâu hơn trong nhân tế bào
nhằm tăng hiệu quả sao chép của virút Một nghiên cứu gin đây đã chứng
minh rằng, axít amin ở vị trí 66 trên PB1-F2 ảnh hưởng đến độc tính của một
chủng virút H5N1 trên chuột Phát hiện này gây ra một sự quan tâm lớn lao, bởi vì chủng virút đại địch H1N1/1918 sở hữu axít amin thuộc dòng độc lực cao tại vị trí này [11] Còn PBI-F2 của chủng HIN1 đại địch 2009 đài 11 axít
amin, vì vậy không có axít amin 6 vị trí 66 này, và chức năng của PBI-F2