Xây dựng quy trình phát hiện vi khuẩn salmonella spp gây bệnh trên thực phẩm bằng phương pháp lamp loop mediated isothermal amplification

HCM BÁO CÁO NGHI M THU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HI N VI KHUẨN Salmonella spp GÂY B NH TRÊN THỰC PHẨM ƢƠ BẰ L (Loop-Mediated Isothermal Amplification) ThS Nguyễn Phạm Trúc Phương CN Nguyễn Văn Lượng Th nh ph Ch inh, h ng 01/2019 BAN QU N LÝ KHU NÔNG NGHI P CÔNG NGH CAO TRUNG TÂM NGHIÊN C U VÀ PHÁT TRI N NÔNG NGHI P CÔNG NGH CAO BÁO CÁO NGHI M THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đ ng nghiệm thu) XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HI N VI KHUẨN Salmonella spp GÂY B NH TRÊN THỰC PHẨM ƢƠ BẰ L (Loop-Mediated Isothermal Amplification) ƠQ Ủ TRÌ (Ký tên, đóng dấu xác nhận) CHỦ NHI ĐỀ TÀI (Ký tên) Nguyễn Phạm rúc hƣơng Th nh ph Ch Nguyễn ăn Lƣợng inh, h ng 01/2019 TÓM TẮT ĐỀ TÀI Vi khuẩn Salmonella spp nguyên nhân quan trọng gây nên vụ ngộ độc thực phẩm gây chết ngƣời toàn giới Gen invA có vai trị việc xâm nhiễm vào tế bào biểu mơ đƣợc chứng minh có mặt rộng rãi 245 chủng Salmonella spp khác đƣợc phân lập từ ngƣời, gà, nƣớc thải Do vậy, gen invA thƣờng đƣợc chọn gen đích việc phát Salmonella spp Trong nghiên cứu này, phát triển kỹ thuật LAMP để phát nhanh xác chủng vi khuẩn Salmonella spp với mồi invA2 chuyên biệt cho vùng gen invA Phản ứng dƣơng tính đƣợc quan sát mắt thƣờng sử dụng SYBR Green I Phƣơng pháp LAMP đƣợc phát triển tối ƣu hóa với tỉ lệ mồi mồi 1:8 tƣơng ứng với F3/B3 (200nM) FIP/BIP (1600nM) dựa trình tự gen invA; nồng độ betain 0,8M Với chu trình nhiệt 630C 60 phút phản ứng kết thúc cách tăng nhiệt độ lên 80℃ 10 phút Bên cạnh đó, xác định đƣợc thông số kỹ thuật quy trình LAMP phát Salmonella spp với độ đặc hiệu kỹ thuật (100%), độ nhạy kỹ thuật nồng độ DNA 5pg/phản ứng; độ nhạy kỹ thuật LAMP chủng khuẩn 4,1x101CFU/ml; độ nhạy kỹ thuật LAMP mẫu thịt đƣợc cảm nhiểm vi khuẩn Salmonella enteridis trƣớc ủ 18 ± 4x10 CFU/25g; sau ủ 18 ± 4,1 CFU/25g Độ biến thiên nội phản ứng quy trình LAMP Salmonella spp nồng độ DNA có %CV từ 0,85% đến 9,22% độ biến thiên liên phản ứng thấp 2,43%, hệ số biến thiên liên phản ứng cao 12,98% Từ khóa: LAMP, Salmonella, gen invA, SYBR Green I MỤC LỤC Trang TÓM TẮT ĐỀ TÀI i MỤC LỤC ii DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT iv DANH SÁCH BẢNG v DANH SÁCH HÌNH vii THÔNG TIN ĐỀ TÀI .1 MỞ ĐẦU Chƣơng 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU .4 1.1 Giới thiệu chung Salmonella spp .4 1.2 Tình hình nhiễm Salmonella thực phẩm 1.3 Các phƣơng pháp phát Salmonella spp 1.4 Kỹ thuật Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) .8 1.5 Các nghiên cứu nƣớc ứng dụng LAMP 11 Chƣơng 2- NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 22 2.2 Vật liệu nghiên cứu 22 2.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 22 2.2.2 Hóa chất thí nghiệm 22 2.2.3 Thiết bị thí nghiệm 22 2.3 Nội dung nghiên cứu 23 2.3.1 Nội dung 1: Chọn lọc mồi LAMP đặc hiệu cho vùng gen invA để phát Salmonella spp thực phẩm 23 2.3.2 Nội dung 2: Xây dựng tối ƣu hóa quy trình LAMP phát vi khuẩn Salmonella spp gây bệnh thực phẩm 26 2.3.3 Nội dung 3: Khảo sát thơng số kỹ thuật quy trình LAMP phát Salmonella spp gây bệnh thực phẩm 30 3.1 Nội dung 1: Chọn lọc mồi LAMP đặc hiệu cho vùng gen invA để phát Salmonella spp thực phẩm 33 Trang ii 3.1.1 Kiểm tra độ đặc hiệu insilico mồi cho vùng gen invA để phát Salmonella spp thực phẩm 33 3.1.2 Xác nhận DNA sử dụng cho phản ứng LAMP DNA ly trích từ chủng khuẩn chuẩn Salmonella spp 38 3.1.3 Kiểm tra độ hoạt động thực tế mồi để phát vi khuẩn Salmonella spp 40 3.1.4 Kiểm tra độ đặc hiệu mồi để phát vi khuẩn Salmonella spp 43 3.2 Nội dung 2: Xây dựng tối ƣu hóa quy trình LAMP phát vi khuẩn Salmonella spp gây bệnh thực phẩm 45 3.2.1 Khảo sát nồng độ mồi 45 3.2.2 Khảo sát nồng độ Betain .48 3.2.3 Khảo sát nhiệt độ ủ .50 3.2.4 Khảo sát thời gian phản ứng .51 3.3 Nội dung 3: Khảo sát thông số kỹ thuật quy trình LAMP phát Salmonella spp gây bệnh thực phẩm 53 3.3.1 Khảo sát độ đặc hiệu kỹ thuật .53 3.3.2 Khảo sát độ nhạy kỹ thuật 54 3.3.3 Độ lặp lại .60 Chƣơng 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .65 4.1 Kết luận 65 4.2 Kiến nghị 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO .66 PHỤ LỤC I Trang iii DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT THUẬT NGỮ TIẾNG VIỆT LAMP LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION PCR Polymerase Chain Reaction inv Invasion protein InvA BPW Buffer Pepton Water Trang iv DANH SÁCH BẢNG Số 1.1 Tên bảng số liệu Yêu cầu kiểm tra bắt buộc Salmonella loại thực phẩm theo Thông tƣ 01/2000/TT-BYT Bộ Y tế Trang 2.1 Bảng trình tự mồi nghiên cứu 23 2.2 Thành phần phản ứng LAMP 25 2.3 Thành phần phản ứng PCR 26 2.4 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR 26 2.5 Thành phần phản ứng LAMP 27 2.6 2.7 3.1 Tỉ lệ nồng độ mồi F3/B3 mồi FIP/BIP cho phản ứng LAMP tối ƣu hóa nồng độ mồi Thành phần phản ứng LAMP Kết so sánh trình tự gen invA chủng Salmonella typhimurium với trình tự gen Salmonella spp 28 29 33 Kết đánh giá khả phát serotype vi khuẩn 3.2 Salmonella spp mồi invA1, invA2, invA3, invA4 38 lý thuyết 3.3 3.4 So sánh giới hạn phát phƣơng pháp LAMP realtime PCR nồng độ từ 5g đến 50.000 pg So sánh giới hạn phát phƣơng pháp LAMP realtime PCR nồng độ từ nồng độ 4,1 CFU/ml đến 4,1x106 CFU/ml 55 56 So sánh giới hạn phát phƣơng pháp LAMP realtime 3.5 PCR mẫu thực phẩm cảm nhiễm Salmonella enteritidis ATCC13076 mật độ từ 4,1 CFU/25g đến 4,1x106 CFU/25g với 58 mẫu không tăng sinh 18 ± 3.6 So sánh giới hạn phát phƣơng pháp LAMP realtime PCR mẫu thực phẩm cảm nhiễm Salmonella enteritidis 59 Trang v ATCC13076 mật độ từ 4,1 CFU/25g/225 ml môi trƣờng BPW đến 4,1x106 CFU/25g/225 ml môi trƣờng BPW với mẫu thực phẩm tăng sinh 18 ± Kết độ đậm nhạt vạch (diện tích) khảo sát độ biến 3.7 thiên nội phản ứng quy trình LAMP DNA ly trích từ chủng khuẩn Salmonella enteritidis ATCC 13076 với nồng độ từ 5pg đến 62 50000 pg Kết độ đậm nhạt vạch (diện tích) khảo sát độ biến 3.8 thiên liên phản ứng quy trình LAMP mẫu DNA thu đƣợc từ ly trích chủng khuẩn mật độ từ 41 CFU/ml đến 4,1x10 62 CFU/ml Kết độ đậm nhạt vạch (diện tích) khảo sát độ biến 3.9 thiên liên phản ứng quy trình LAMP DNA ly trích từ chủng khuẩn Salmonella enteritidis ATCC 13076 với nồng độ từ 64 5pg đến 50000 pg Kết độ đậm nhạt vạch (diện tích) khảo sát độ biến 3.10 thiên nội phản ứng quy trình LAMP mẫu DNA thu đƣợc từ ly trích chủng khuẩn mật độ từ 41 CFU/ml đến 4,1x106 64 CFU/ml Trang vi DANH SÁCH HÌNH Số Tên hình Trang 1.1 Các kháng nguyên bề mặt Salmonella 3.1 3.2 3.3 Kết phân tích trình tự mồi invA1 phần mềm Annhyb 35 4.946 Kết phân tích trình tự mồi invA2 phần mềm Annhyb 36 4.946 Kết phân tích trình tự mồi invA3 phần mềm Annhyb 37 4.946 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 3.12 3.13 Kết phân tích trình tự mồi invA4 phần mềm Annhyb 37 4.946 Kết PCR khuếch đại DNA vi khuẩn Salmonella spp cặp mồi 16S-Fw/16S-Rw Phát sản phẩm LAMP quan sát kết tủa trắng Mg2P2O7 tạo thành sau ly tâm Phát sản phẩm LAMP SYBR GREEN quan sát dƣới ánh sáng tự nhiên Kiểm tra độ hoạt động thực tế của mồi invA1, invA2, invA3, invA4 để phát vi khuẩn Salmonella spp Đánh giá độ đặc hiệu mồi invA2 chất thị màu SYBR Green Hình gel độ đặc hiệu mồi invA2 DNA ly trích từ vi khuẩn Kết khảo sát tỉ lệ tỉ lệ F3/B3 FIP/BIP mồi invA2 phản ứng LAMP chất thị màu SYBR Green Ảnh hƣởng tỉ lệ F3/B3 FIP/BIP mồi invA2 đến sản phẩm phản ứng LAMP nhận biết gel agarose 39 40 41 42 43 43 45 46 Ảnh hƣởng nồng độ Betain đến phản ứng LAMP nhận biết 47 Trang vii SYBR Green 3.14 3.15 3.16 3.17 3.18 3.19 3.20 3.21 3.22 Ảnh hƣởng nồng độ Betain đến phản ứng LAMP nhận biết điện di gel agarose Ảnh hƣởng nhiệt độ đến phản ứng LAMP nhận biết SYBR Green Ảnh hƣởng nhiệt độ đến phản ứng LAMP nhận biết điện di gel agarose Ảnh hƣởng thời gian đến phản ứng LAMP nhận biết SYBR Green I Ảnh hƣởng thời gian đến phản ứng LAMP nhận biết điện di gel agarose Độ đặc hiệu phản ứng LAMP nhận biết thị SYBR Green I Độ đặc hiệu phản ứng LAMP nhận biết điện di gel agarose Ngƣỡng phát phản ứng LAMP nồng độ DNA từ pg đến 50.000 pg nhận biết chất thị SYBR Green I Ngƣỡng phát phản ứng LAMP nồng độ DNA từ pg đến 50.000 pg nhận biết điện di gel agarose 48 49 49 50 51 53 53 54 54 Ngƣỡng phát phản ứng LAMP DNA đƣợc ly trích từ 3.23 Salmonella nồng độ 4,1 CFU/ml đến 4,1x106 CFU/ml nhận biết 55 chất thị SYBR Green Ngƣỡng phát phản ứng LAMP DNA đƣợc ly trích từ 3.24 Salmonella nồng độ 4,1 CFU/ml đến 4,1x107 CFU/ml nhận biết 56 điện di gel agarose Ngƣỡng phát phản ứng LAMP DNA đƣợc ly trích từ 3.25 Salmonella enteritidis ATCC 13076 mật độ từ 4,1 CFU/25g đến 57 4,1x106 CFU/25g với mẫu không tăng sinh 18 ± nhận biết Trang viii  Kiểm tra mồi invA3-LF PL - 26 -  Kiểm tra mồi invA3-LB PL - 27 - 2.4 Bộ mồi invA4  Kiểm tra mồi invA4-F3 PL - 28 -  Kiểm tra mồi invA4-B3 PL - 29 -  Kiểm tra mồi invA4-FIP(F1c+F2) - F1c PL - 30 - - F2 PL - 31 -  Kiểm tra mồi invA4-BIP(B1c+B2) - B1c PL - 32 - - B2 PL - 33 -  Kết kiểm tra khả phát sevovar vi khuẩn Salmonella mồi invA1; invA2; invA3; invA4 PL - 34 - PL - 35 - PHỤ LỤC Kết kiểm tra Salmonella enteritidis ATCC13076 Salmonella typhimurium ATCC 14028 phƣơng pháp nuôi cấy truyền thống TTNC/ STPPVS.01 tham chiếu TCVN 4829: 2005, ISO 6579: 2002 Diễn giải kết quả: – – – – – – TSI: Nghiêng đỏ, đáy vàng, H2S (+/-), gas (–/+) Urease (–), không đổi màu môi trường LDC (+), đục tím đậm ban đầu β-galactosidase (–), khơng đổi màu mơi trường VP (–), khơng có màu đỏ hồng xuất Indole (–), vòng màu vàng PL - 36 - PHỤ LỤC  Kết độ biến thiên nội phản ứng nồng độ DNA từ pg đến 50000 pg Kết độ biến thiên nội phản ứng nồng độ DNA từ pg đến 50000 pg A 5pg; B: 50 pg; C: 500 pg; D: 5000 pg; E: 50000 pg M: Thang DNA; 1-8: Số lần lặp 1-8 PL - 37 -  Kết điện di gel agarose độ biến thiên nội phản ứng mật độ 41 CFU đến 4,1x106 CFU/ml Kết điện di gel agarose độ biến thiên nội phản ứng mật độ 41 CFU đến 4,1x106 CFU/ml A: 41 CFU/ml; B: 4,1x101 CFU/ml; C: 4,1x102 CFU/ml; D: 4,1x103 CFU/ml; D: 4,1x104 CFU/ml; E: 4,1x105 CFU/ml; F: 4,1x106 CFU/ml PL - 38 - Kết điện di gel agarose độ biến thiên liên phản ứng nồng độ DNA từ 5pg đến 50000 pg A: lần 1; B: lần 2; C: lần 3; D: lần 4; E: lần 5; F: lần 6; G: lần 7; H: lần M: Thang DNA; 1:5 pg; 2: 50 pg ; 3: 500 pg ; 4: 5000 pg; 5: 50000 pg PL - 39 - Kết điện di gel agarose độ biến thiên liên phản ứng mật độ vi khuẩn từ 4,1x101 CFU/ml đến 4,1x106 CFU/ml A: lần 1; B: lần 2; C: lần 3; D: lần 4; E: lần 5; F: lần 6; G: lần 7; H: lần M: Thang DNA; 1: Mật độ 4,1x101; 2: Mật độ 4,1x102 ; 3: Mật độ 4,1x103 ; 4: Mật độ 4,1x104; 5: Mật độ 4,1x105 ; 6: Mật độ 4,1x106 PL - 40 -