Xây dựng quy trình phát hiện tính kích thích miễn dịch của một số chất bằng real time rt pcr

PHẦN MỞ ĐẦU Tên đề tài: XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN TÍNH KÍCH THÍCH MIỄN DỊCH CỦA MỘT SỐ CHẤT BẰNG REAL-TIME RT-PCR Chủ nhiệm đề tài: Trần Quốc Vũ Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học Công nghệ Trẻ Thời gian thực đề tài: 12 tháng Kinh phí duyệt: 80 triệu Kinh phí cấp: 80 triệu theo TB số : TB-SKHCN ngày / / Mục tiêu: Xây dựng, hoàn chỉnh quy trình in vitro xác định khả tăng cường miễn dịch hợp chất tự nhiên Nội dung: Công việc dự kiến Công việc thực Nội dung 1: Xây dựng hồn chỉnh Tối ưu hóa số điều kiện phản ứng, quy trình real-time RT-PCR đo thay xây dựng hồn chỉnh quy trình đổi biểu mRNA hai loại real-time RT-PCR cytokine IL-2 TNF-α dòng tế bào Nội dung 2: Áp dụng real-time RT-PCR Kết tác động số hợp để phát khả kích thích miễn chất biểu mRNA IL-2 dịch số chất TNF-α CHƯƠNG I: TỔNG QUAN Hệ miễn dịch người bảo vệ thể chống lại tác hại vi sinh vật xâm nhiễm gây Hệ miễn dịch bao gồm miễn dịch bẩm sinh miễn dịch đặc hiệu Trong đó, tế bào giết tự nhiên (NK-nature killer), hệ thống bổ thể, đại thực bào, tế bào trình diện kháng nguyên bạch cầu trung tính tạo thành hệ miễn dịch bẩm sinh, chúng đáp ứng lập tức, không đặc hiệu với tác nhân gây bệnh Nếu tác nhân gây bệnh (như vi khuẩn, virus) vượt qua hàng rào này, hệ miễn dịch đặc hiệu, bao gồm miễn dịch dịch thể trung gian tế bào bắt đầu hoạt động Các kháng nguyên (nấm, virus, vi khuẩn, độc tố…) bị xử lý tế bào trình diện kháng nguyên trình diện với tế bào T hỗ trợ (TH có mang protein bề mặt CD4), qua hoạt hóa tiết cytokine Ngồi chế tự nhiên, có yếu tố bổ sung có khả kích thích ức chế miễn dịch thể Tính kích thích miễn dịch nâng cao khả miễn dịch tổng thể thể phản ứng miễn dịch không đặc hiệu chống lại tác nhân gây bệnh vi sinh vật Các tác nhân kích thích miễn dịch hoạt động để nâng cao đáp ứng miễn dịch dịch thể tế bào, cách tăng cường tiết cytokine, cách trực tiếp kích thích tế bào lympho T B Cytokine peptide glycoprotein có nhiều tác động, có nhiều nguồn, nhiều mục tiêu, nhiều chức Chúng điều khiển đáp ứng miễn dịch thông qua khả kích thích ức chế hoạt động tế bào thể qua hoạt hóa, tăng sinh, biệt hóa tế bào điều hịa tiết kháng thể cytokine khác Trong đáp ứng miễn dịch, cytokine bám lên thụ thể đặc hiệu màng tế bào đích khởi đường truyền tín hiệu dẫn đến thay đổi biểu gene tế bào đích phân tử cytokine tác động theo kiểu tự tiết, cận tiết nội tiết Vì vậy, cytokine quan trọng phản ứng viêm bẩm sinh thích ứng Trong đó, tế bào tiết cytokine tế bào TH đại thực bào Cytokine tế bào TH tiết tác động trở lại làm biệt hóa tế bào TH thành tế bào TH1 TH2 Hoạt động tế bào TH1 liên quan đến hoạt hóa đại thực bào, đồng thời liên quan đến đường miễn dịch qua trung gian tế bào; tế bào TH2 lại có ảnh hưởng đến tạo tiết kháng thể Một loại tế bào T khác tế bào T gây độc (có mang protein CD8 bề mặt) lại cảm ứng apoptosis tế bào thể mang kháng nguyên lạ (Tan & cs, 2004; Oppenheim, 2001) TNF-α cytokine đáp ứng miễn dịch, đại thực bào tế bào T tạo đáp ứng viêm với vi khuẩn hay tác nhân kích thích TNF-α hoạt động yếu tố dẫn dụ hóa học, lôi kéo đại thực bào hay tế bào bạch cầu đến vị trí viêm Ngồi ra, TNF-α cịn cho thấy có khả tăng cường đáp ứng kháng ung thư Trong đó, IL-2 coi yếu tố tăng trưởng tế bào T, thúc đẩy tăng sinh, hoạt hóa biệt hóa tế bào T, B IL-2 kích thích tế bào NK tế bào gây viêm tế bào mono/đại thực bào tế bào trung tính Bên cạnh đó, IL-2 cịn có tác động lên sản xuất cytokine khác IL-1, IL-4, IL-6, TNF-α Người ta ý đến ứng dụng lâm sàng IL-2 khả hoạt hóa tế bào NK tăng cường đáp ứng kháng tế bào ung thư Các liệu pháp dựa IL-2 FDA cho phép tiến hành điều trị ung thư thận suốt thập niên qua (McDermott & cs, 2004) Thảo dược sử dụng để điều trị bệnh từ lâu đời Hiện nay, người ta ước tính khoảng 50% loại thuốc tổng hợp có nguồn gốc từ chất hóa học thực vật Các nghiên cứu khoa học gần chứng minh nhiều loại thảo mộc có khả giúp tăng cường hệ thống miễn dịch cách kích thích tế bào bạch cầu điều hòa biểu cytokine quan trọng hoạt động miễn dịch thể (Tan & cs, 2004) Một số nghiên cứu tiêu biểu như: Melanin, chiết từ Nigella sativa L cảm ứng biểu TNF-α, IL-6 VEGF mRNA monocyte, tế bào đơn nhân ngoại vi, dòng tế bào THP-1; mức độ protein, melanin cảm ứng tạo thành TNF- α, IL-6 (El-Obeida & cs, 2006) LZ-8, protein từ Ganoderma lucidum có khả kích thích tế bào lympho ngoại vi tạo IL-2, đồng thời làm tăng biểu thụ thể IL-2 (Hsu & cs, 2008) Các cycloartane phân lập từ Astragalus melanophrurius (Fabaceae) có hoạt tính điều hòa miễn dịch tế bào lympho người phân lập Các nhà nghiên cứu nhận thấy dùng astrasieversianins II, X; astragalosides I, II, IV, VI; cyclocanthosides E, G nồng độ từ 0,01 đến 10 µg/mL kích thích tăng sinh tế bào lympho người Trong oleanolic acid and echinocystic acid phân lập từ Luffa cylindrica (Cucurbitaceae) làm tăng số thực bào, kích thích đại thực bào, làm gia tăng đáp ứng miễn dịch dịch thể miễn dịch qua trung gian tế bào (Ríos & cs, 2010) Các nghiên cứu biểu cytokine bị cảm ứng tác nhân gây kích thích đa dạng, với nhiều kỹ thuật áp dụng với mơ hình động vật, tế bào Sau phương pháp tiêu biểu: + Kỹ thuật phát protein cytokine: - Phương pháp ELISA: dùng để đo hàm lượng cytokine tế bào thuộc hệ thống miễn dịch (tế bào lympho, đại thực bào…) tiết sau cảm ứng với hợp chất Trong phương pháp này, kháng thể kháng cytokine sơ cấp gắn bề mặt giếng đĩa 96 giếng bắt giữ cytokine tương ứng diện mẫu (dịch nuôi cấy tế bào) Những kháng thể kháng cytokine thứ cấp đánh dấu biotin bổ sung sau gắn vào cytokine nói Streptavidin-horseradish peroxidase (HRP) gắn với biotin phân cắt chất tạo sản phẩm màu phát huỳnh quang HRP Cường độ tín hiệu phản ánh khả cảm ứng tạo cytokine chất thử nghiệm Phương pháp cịn cho phép đo lượng cytokine có máu người sử dụng thuốc - Phương pháp ELISPOT: tương tự ELISA, tế bào gây cảm ứng phát triển giếng gắn sẵn kháng thể sơ cấp kháng cytokine Cytokine tế bào tiết kháng thể sơ cấp bắt giữ Sau đó, kháng thể kháng cytokine thứ cấp đánh dấu biotin bổ sung sau gắn vào cytokine nói Streptavidin-horseradish peroxidase (HRP) gắn với biotin phân cắt chất tạo đốm màu Số lượng đốm màu tạo thành quan sát định lượng kính hiển vi phần mềm xử lý hình ảnh (Christian & cs, 2008) - Phương pháp flow cytometry: phát thay đổi thành phần tế bào quần thể tế bào miễn dịch hàm lượng cytokine chúng tiết Trong kỹ thuật này, tế bào thu nhận từ máu toàn phần hay tế bào máu đơn nhân ngoại vi ủ với kháng thể marker bề mặt đặc trưng cho loại tế bào (CD3, CD14, CD15, CD69…) Sau đó, tế bào trải qua xử lý đưa vào máy flow cytometry để phát phân tách thành quần thể tế bào khác (Christian & cs, 2008) + Kỹ thuật phát biển gene cytokine: - Phương pháp RT-PCR real-time RT-PCR: phương pháp phản ánh mức độ biểu gene mã hóa cho cytokine mức phiên mã Những năm gần real-time RT-PCR ngày sử dụng nhiều để định lượng mRNA cytokine mục tiêu Điều cho thấy tiềm việc định lượng biểu mRNA nhằm xác định đáp ứng tế bào miễn dịch thử nghiệm thuốc hay hợp chất tự nhiên Tuy nhiên, mức độ phiên mã lúc phản ánh xác cytokine tiết Do đó, để đánh giá xác ảnh hưởng chất cảm ứng lên tế bào miễn dịch cần có phối hợp phương pháp (Christoph & cs, 2001; Prescilla, 2008; Stephan & cs, 2008) Nguồn tế bào sử dụng để thử nghiệm chất cảm ứng kích thích miễn dịch tế bào thuộc hệ thống miễn dịch thể: tế bào mono, tế bào lympho T, Phương pháp phổ biến để phân lập tế bào từ máu sử dụng ly tâm đệm Ficoll nhằm tách chúng khỏi hồng cầu, tiều cầu huyết tương Theo nhiều mục đích nghiên cứu khác nhau, tế bào miễn dịch tiếp tục xử lý để thu nhận nhóm tế bào hơn, ví dụ sử dụng tế bào mono, sử dụng quần thể tế bào lympho T (CD4, CD8) (Christian & cs, 2008) Hiện nay, việc phân lập tế bào miễn dịch từ máu cho thí nghiệm đo ảnh hưởng chất cảm ứng, việc sử dụng máu tồn phần (khơng loại bỏ hồng cầu, huyết tương ) áp dụng rộng rãi Ưu điểm phương pháp lượng mẫu máu nhỏ không đủ để tách Ficoll; hạn chế tế bào miễn dịch bị biến đổi mặt sinh lý trình tách chiết ảnh hưởng hóa chất; đồng thời việc sử dụng máu toàn phần nhằm tạo điều kiện tương tự với điều kiện tự nhiên thể Tuy nhiên, việc sử dụng tế bào máu từ người tình nguyện địi hỏi phải có quản lý chặt chẽ hồ sơ sức khỏe biến động khả đáp ứng khác chất thử nghiệm (Christoph & cs, 2004; Prescilla, 2008; Stephan & cs, 2008) Bên cạnh đó, số dịng tế bào người sử dụng cho nghiên cứu ảnh hưởng thuốc hay hợp chất tự nhiên lên khả biểu sản xuất cytokine Các dịng tế bào sử dụng gồm có: dịng tế bào Jurkat (tế bào lympho T) có khả biểu tiết cytokine IL-2 ; U937 (dòng tế bào mono) có khả biểu tiết cytokine TNF-α, hay dòng THP1 (dòng tế bào mono)… Việc sử dụng dòng tế bào sử dụng nghiên cứu giới chế điều hòa miễn dịch, chế điều hòa biểu gene cytokine thông qua NF-kB (El-Obeida & cs, 2006; Grzanna & cs, 2006; Hsu & cs, 2008) Ở Việt Nam, nghiên cứu liên quan đến tăng cường hệ miễn dịch từ thuốc công bố thời gian gần Một số cơng trình sử dụng mơ hình chuột gây suy giảm miễn dịch cách chiếu xạ, kết cho thấy số cao chiết từ thảo dược có tác dụng làm phục hồi đáng kể tổn thương mô lympho, tăng chức đại thực bào tỷ lệ tế bào lách tạo quầng dung huyết, tăng chuyển dạng tế bào lympho lách chuột Ngoài ra, thử nghiệm in vitro cho thấy làm tăng chuyển dạng tế bào lympho máu ngoại vi người khỏe mạnh, tăng khả thực bào, khả tiết nitric oxide bạch cầu đa nhân trung tính người (Nguyễn Thị Thư & cs, 2008) Có sản phẩm chiết xuất từ thuốc thương mại hóa Phylamin chiết từ lồi Azolla microphylla có tác dụng hoạt hố đại thực bào lympho bào, tăng cường khả tiêu diệt tế bào ung thư (Trần Công Yên & cs, 2005) Trong đó, nghiên cứu trung tâm Sâm dược liệu TP.HCM tính kích thích miễn dịch hợp chất chiết xuất từ thuốc thuộc họ Nhân sâm cho thấy cao chiết Đinh lăng có tính tương tự zymosan (một chất kích thích khả thực bào), có khả làm gia tăng số thực bào chuột bình thường chuột gây suy giảm miễn dịch Đặc biệt nghiên cứu sâm Ngọc Linh hợp chất majonosid-R2 chiết xuất từ sâm Ngọc Linh cho thấy có hoạt tính làm gia tăng số thực bào in vivo đại thực bào chuột, tương tự chất kích thích thực bào điển hình zymosan – A Các thử nghiệm chuột gây suy giảm miễn dịch cyclophosphamid cho thấy bột chiết sâm trì lượng bạch cầu, làm tăng trọng lượng lách tuyến ức, gia tăng số thực bào (Nguyễn Thượng Dong & cs, 2007) Trong đề tài này, sử dụng kỹ thuật real-time RT-PCR để phát thay đổi mức độ biểu gene cytokine quan trọng hoạt động miễn dịch Vì real-time RT-PCR sử dụng rộng rãi để định lượng cytokine từ tế bào, dịch thể, mô sinh thiết Đây phương pháp mạnh nhạy, dùng để xác định mức độ biểu mRNA cytokine, thường biểu thấp mô nghiên cứu Phương pháp cho phép phát trực tiếp sản phẩm PCR pha tăng trưởng phản ứng nhờ vào việc sử dụng mẫu dò huỳnh quang (Taqman probe) Sự biểu cytokine kiểm soát nhiều cấp độ phiên mã gene bước đầu tiên, quan trọng trình tạo thành protein cytokine Do đó, chúng tơi sử dụng kỹ thuật real-time RT-PCR, nhằm mục đích phát thay đổi tế bào cảm ứng với hợp chất tự nhiên mức phiên mã gene, từ phát khả kích thích miễn dịch hợp chất Ngồi ra, phạm vi đề tài này, chi phí cho việc xây dựng qui trình real-time RT-PCR nhằm phát biểu cytokine thấp nhiều so với việc sử dụng kit ELISA phát protein cytokine (giá thành kit ELISA cho loại cytokine với khoảng 192 phản ứng 25-30 triệu đồng) Vì vậy, dùng ELISA để nghiên cứu ảnh hưởng hợp chất tự nhiên lên biểu nhiều loại cytokine khơng có lợi kinh tế Trong đó, chi phí đặt mua mồi mẫu dị cho gene mã hóa cytokine thấp, nên phát triển cho nhiều loại cytokine với mục đích sàng lọc Những hợp chất có tiềm lựa chọn cho nghiên cứu chuyên sâu sau mức độ biểu protein hay lâm sàng Mơ hình tế bào mà sử dụng đề tài dòng tế bào ung thư: dòng tế bào Jurkat, đại diện cho tế bào lympho T dòng tế bào U937 đại diện cho tế bào mono/đại thực bào thí nghiệm cảm ứng với hợp chất tự nhiên Chúng tơi chọn hai dịng tế bào dịng tế bào người, đặt mua từ ATCC, có khả biểu cytokine IL-2 (Jurkat), TNF-α (U937) kích thích với phytohaemagglutinin (PHA), lipopolysaccharide (LPS); ngồi ra, thí nghiệm dịng tế bào cho phép chúng tơi kiểm sốt tính biến động tế bào so với việc dùng tế bào máu ngoại vi hay máu toàn phần thu từ nhiều người khác Bên cạnh đó, thử nghiệm với dịng tế bào cho phép đánh giá tác động hợp chất tự nhiên lên hai loại tế bào miễn dịch tế bào lympho T mono/đại thực bào cách riêng rẽ Vì vậy, mơ hình phù hợp để xây dựng quy trình phát tính kích thích miễn dịch hợp chất tự nhiên thông qua biểu gene IL-2 TNF-α Sau xây dựng tối ưu hóa quy trình real-time RT-PCR xong, chúng tơi sử dụng chứng dương phytohaemagglutinin (PHA) lipopolysacchride (LPS) để thử nghiệm quy trình trước tiên Hai chất chứng minh có khả kích thích biểu gene IL-2, TNF-α tế bào lympho T tế bào mono / đại thực bào (Dupuis & cs, 1988) Ở giai đoạn thử nghiệm quy trình, chọn hợp chất chiết xuất từ sâm Việt Nam majonosid-R2 ginsenosid-Rg1 làm chất gây cảm ứng; hợp chất Trung tâm Sâm dược liệu TP.HCM nghiên cứu, cho thấy có khả gây kích thích miễn dịch, làm tăng số thực bào thử nghiệm chuột (Nguyễn Thượng Dong & cs, 2007) Ngồi ra, nhiều cơng trình giới cho thấy ginsenosid-Rg1 có số ảnh hưởng định hoạt động miễn dịch Theo Qu cộng (2011), tiêm chuột với hỗn hợp Rg1 kháng nguyên Toxoplasma gondii SAG1 tái tổ hợp làm gia tăng đáng kể đáp ứng miễn dịch với kháng nguyên chuột Trong đó, nghiên cứu Sun cộng (2008) cho thấy Rg1 nâng cao đáng kể việc sản xuất isotypes IgG chuyên biệt kháng nguyên tiết IL-5 IFN-γ (Qu & cs, 2011; Sun & cs, 2008) Trong đó, majonosid-R2 có khả ức chế đáng kể lượng TNF-α có huyết chuột tiêm DGaIN/LPS Mặt khác, majonosid-R2 có khả bảo vệ tế bào gan chuột ni cấy sơ cấp cách ức chế trình apoptosis cảm ứng D-GalN/TNF-alpha in vitro (Tran & cs, 2002) Đề tài “Xây dựng quy trình phát tính kích thích miễn dịch số chất real-time RT-PCR” tạo cơng cụ hữu ích việc phát hợp chất (đặc biệt chất có nguồn gốc từ tự nhiên) có tác dụng kích thích hệ miễn dịch thơng qua biểu cytokine quan trọng (IL-2, TNF-α) tế bào T, monocyte; qua góp phần đưa hợp chất có cỏ vào nghiên cứu ứng dụng sau CHƯƠNG II NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Đề tài “Xây dựng quy trình phát tính kích thích miễn dịch số chất real-time RT-PCR” có hai nội dung nghiên cứu chính: - Xây dựng quy trình phát tính kích thích miễn dịch - Áp dụng quy trình với số chất thử nghiệm 2.1 Xây dựng quy trình phát tính kích thích miễn dịch Mục tiêu: thiết lập thông số cần thiết cho quy trình phát tính kích thích miễn dịch 2.1.1 Nuôi cấy tế bào - Tế bào Jurkat U937 ni cấy mơi trường RPMI1640Glutamax (Gibco) có bổ sung 10% FBS (Gibco), 1% HEPES (Gibco), 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco) 37oC, 5% CO2 - Sau đó, ly tâm thu sinh khối 5.000 vòng / phút phút 4oC - Rửa lại PBS, tiếp tục ly tâm thu sinh khối 5.000 vòng / phút phút 4oC - Tách chiết RNA KIT illustra RNAspin Mini (GE Healthcare) - Điện di kiểm tra RNA thu nhận được, sau chuyển thành cDNA reverse transcriptase (Khoa Thương) - cDNA tạo thành xác định nồng độ bảo quản -20oC cho thí nghiệm 2.1.2 Kiểm tra hoạt động cặp mồi mẫu dị Chúng tơi thu nhận trình tự cặp mồi mẫu dị cho IL-2, TNF-α βactin cơng trình cơng bố trước [28] Sau đó, chúng tơi sử dụng phần mềm chuyên dùng cho việc thiết kế mồi Annhyb 4.943 Oligo analyzer 10 chung cho phản ứng multiplex real-time-PCR cặp mồi il2-F/R bactin-F/R, tnf-F/R bactin-F/R Bảng 3.2: Giá trị Ct phản ứng real-time monoplex PCR nhiệt độ bắt cặp khác Nhiệt độ (oC) β-actin Ct IL-2 Ct trung bình 22,05 65 21,72 21,70 ± 0,736 33,09 20,04 ± 0,648 32,8 20,68 59,5 20,92 20,69 ± 0,356 33,01 20,58 ± 0,403 32,54 Chứng âm 28.65 32,56 ± 0,715 a a,b 29.82 29,17 ± 0,596 29.04 31.23 33,23 ± 0,242 a 32,51 ± 0,316 a 29.98 30,61 ± 0,884a 30.83 31.53 32,18 21,28 21,41 31.95 32,81 a 20,35 50 31,95 ± 1,005a 33.49 20,68 20,72 32.95 33,2 a 20,47 53 33,11 ± 0,057 31,76 20,69 Ct trung bình 30.94 33,13 a,b Ct a 33,06 20,59 18,84 Ct trung bình 33,17 a,b 21,33 62,3 Ct TNF-α 32.33 33,6 21,25 ± 0,177 a 33,19 31.77 33,40 ± 0,206 a a,b 34.84 33,60 ± 1,616 21,06 33,42 34.18 - - - a, b: khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) 24 31,56 ± 0,751a 3.1.3.2 Kết kiểm tra phản ứng multiplex real-time PCR với nhiệt độ chọn  IL-2 β-actin Trong thí nghiệm này, thiết lập phản ứng multiplex với cặp mồi il2-F/R bactin-F/R Nhiệt độ bắt cặp 62,3oC phản ứng monoplex Bảng 3.3: Giá trị Ct phản ứng real-time multiplex PCR IL-2 chứng nội (β-actin) nhiệt độ tối ưu IL-2 Ct β-actin Ct trung bình Ct 32,98 32,15 20,73 32,62 ± 0,426 20,65 32,73 Chứng âm Ct trung bình 20,74 ± 0,095 20,84 - Chứng âm - Kết multiplex real-time PCR IL-2 β-actin (bảng 3.3) cho thấy nhiệt độ 62,3oC, giá trị Ct phản ứng multiplex PCR không khác biệt so với phản ứng monoplex real-time PCR; giá trị Ct trung bình cặp mồi IL-2, βactin phản ứng multiplex 32,62 20,74 so với giá trị Ct 32,56 20,04 monoplex Do đó, chúng tơi sử dụng nhiệt độ cho phản ứng multiplex real-time PCR nhằm phát biểu gene IL-2 với gene chứng nội β-actin  TNF-α β-actin Trong thí nghiệm này, chúng tơi tiếp tục thiết lập phản ứng multiplex với cặp mồi tnfa-F/R bactin-F/R giữ nguyên nhiệt độ bắt cặp 62,3oC 25 Bảng 3.4: Giá trị Ct phản ứng real-time multiplex PCR TNF-α chứng nội (β-actin) nhiệt độ tối ưu TNF-α Ct β-actin Ct trung bình 28,07 28,72 Ct Ct trung bình 16,60 28,55±0,422 28,86 Chứng âm 17,70 17,40±0,704 17,91 - Chứng âm - Từ kết (bảng 3.4), nhận thấy nhiệt độ 62,3oC, giá trị Ct phản ứng multiplex PCR không khác biệt so với phản ứng monoplex PCR Do đó, chúng tơi tiếp tục sử dụng nhiệt độ cho phản ứng multiplex real-time PCR nhằm phát biểu gene TNF-α với gene chứng nội β-actin Với kết khảo sát nhiệt độ phản ứng multiplex real-time PCR, nhận thấy giá trị Ct phản ứng multiplex tương đương với giá trị Ct phản ứng monoplex chênh lệch giá trị Ct phản ứng không nhiều Do đó, chúng tơi khơng khảo sát thêm điều kiện khác nồng độ mồi, MgCl2 mẫu dị 3.1.4 Quy trình phát tính kích thích miễn dịch Với bước thực gồm: nuôi cấy tế bào, tách chiết RNA, tạo cDNA kiểm tra chuẩn hóa thơng số phản ứng real-time PCR Chúng tơi đưa quy trình phát tính kích thích sau:  Ni cấy tế bào - Giải đơng tế bào Jurkat (U937), kiểm tra tình trạng nhiễm kính hiển vi soi ngược 26 - Tế bào Jurkat (U937) ni mơi trường RPMI1640-Glutamax có bổ sung 10% FBS, 1% HEPES, 1% Penicillin/Streptomycin - Ủ tủ ấm 5% CO2, 37oC - Tế bào cấy chuyền sau – ngày nuôi cấy  Cảm ứng tế bào - Đếm tế bào buồng đếm hồng cầu với phương pháp Trypan blue : chuyển dịch tế bào huyền phù Trypan blue vào cạnh buồng đếm phủ lamelle ; để tế bào cố định vài phút trước đếm kính hiển vi, vật kính 10X Các tế bào sống sáng rõ, tế bào chết bị nhuộm xanh Xác định tổng số tế bào mL : (Tổng số tế bào đếm được/5) x x 104 = số tế bào/mL  Lưu ý : 104 thể tích buồng đếm ( ô 1x1 mm dày 0,1 mm) - Tạo dịch tế bào đồng có mật độ mong muốn cách trộn dịch huyền phù tế bào ban đầu với mơi trường theo tính tốn - Tế bào nuôi cấy đĩa giếng với mật độ tế bào x 106 tế bào / mL xử lý với chất cảm ứng nồng độ cuối µg/mL (đối chứng), µg/mL 10 µg/mL Mỗi nồng độ chất cảm ứng lặp lại lần - Ủ điều kiện 5% CO2, 37oC giờ, 12  Thu nhận cDNA - Thu nhận tế bào cách ly tâm 5.000 vòng / phút phút 4oC - Tách chiết RNA KIT illustra RNAspin Mini (GE Healthcare) - Điện di kiểm tra RNA thu nhận được, sau chuyển thành cDNA reverse transcriptase (Khoa Thương) sau : 27 o Thành phần phản ứng : o Thành phần Thể tích Reverse transcriptase μl Mix 10μl RNA 38 μl Tổng 50 μl Chương trình nhiệt phản ứng : Nhiệt độ Thời gian 25oC phút 42oC 30 phút 85oC phút - cDNA tạo thành xác định nồng độ bảo quản -20oC sử dụng - Thực phản ứng multiplex real-time PCR với cặp mồi il2-F/R, bactinF/R mẫu dò il2-p, bactin-p - Phản ứng multiplex sử dụng cặp mồi cho phản ứng : il2-F/R với bactin-F/R ; tnfa-F/R với bactin-F/R Trong bactin-F/R dùng để phát biểu gene chứng nội β-actin 28 o Thành phần phản ứng PCR : Thành phần Thể tích h-Taq polymerase 2,5U/µL 0,5 µL Hỗn hợp dNTP 10 mM 0,5 µL MgCl2 mM 2,5 µL il2-F/R tnfa-F/R 25 µM 1,0 µL bactin-F/R 25 µM 1,0 µL il2-p tnfa-p 25 µM 0,5 µL bactin-p 25 µM 0,5 µL Dung dịch đệm h-Taq polymerase, 10X 2,5 µL Bản mẫu 1,0 µL Nước cất lần 15,0 µL Tổng 25,0 µL o Chương trình PCR : Số chu kỳ 45 Nhiệt độ Thời gian 95oC 15 phút 95 oC 30 giây 62,3oC 30 giây 72 oC 30 giây 73 oC phút - Sự tăng/giảm biểu gene phản ứng multiplex real-time PCR tính dựa vào cơng thức sau (Livak & cs, 2001): Mức độ tăng tương đối biểu gene = –∆∆Ct Trong đó: ∆∆Ct = ∆Ct cảm ứng – ∆Ct không cảm ứng ∆Ct = Ct gene mục tiêu – Ct gene chứng nội - Kết xử lý thống kê phần mềm GraphPad Prism 29 3.2 Áp dụng quy trình real-time RT-PCR với số chất thử nghiệm Đầu tiên, kiểm tra khả phát biểu gene IL-2 TNF-α quy trình real-time RT-PCR vừa xây dựng với hai chất làm chứng dương phytohaemagglutinin (PHA) lipopolysacchride (LPS) Đây chất chứng minh có khả kích thích biểu gene IL-2, TNF-α tế bào lympho T tế bào mono / đại thực bào (Graham & cs, 1982 ; Dupuis & cs, 1988) 3.2.1 Sự biểu IL-2 tế bào Jurkat cảm ứng PHA Để thử nghiệm quy trình real-time RT-PCR phát khả làm gia tăng biểu mRNA IL-2 dòng tế bào Jurkat, sử dụng PHA làm chất cảm ứng Theo nghiên cứu trước biểu cytokine IL-2 tế bào Jurkat cảm ứng đồng thời PHA phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) cho thấy biểu mRNA IL-2 sau giờ, đạt mức cao thời điểm giờ, sau giảm dần; đồng thời mức độ biểu protein IL-2 bắt đầu tăng dần sau – cảm ứng, đạt đỉnh 16 cảm ứng (Nordmann & cs, 1989) Do đó, chúng tơi cảm ứng tế bào Jurkat vịng giờ, sau kiểm tra biểu gene Kết (hình 3.3) cho thấy có gia tăng biểu mRNA IL-2 tế bào Jurkat cảm ứng với nồng độ PHA 10 µg/mL 12,61 13,29 lần; mức độ biểu tăng có ý nghĩa thống kê so với đối chứng 30 Hình 3.3: Mức độ thay đổi biểu gene IL-2 tế bào Jurkat cảm ứng PHA Kết tương đối phù hợp với nghiên cứu cảm ứng PHA tế bào lympho T bình thường người Khi cảm ứng tế bào T với 10 µg/mL PHA, phát biểu mRNA IL-2 vòng sau cảm ứng biểu thời điểm sau 12 (Kumagai & cs, 1988) Trong đó, q trình cảm ứng tế bào lympho hạch người với PHA 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) cho thấy làm tăng đáng kể biểu mRNA IL-2, đạt mức tối đa thời điểm 12 giờ, trì mức độ cao 48 tiếp theo, sau giảm nhanh thời điểm 72 (Yamamoto & cs, 2002) 3.2.2 Sự biểu TNF-α tế bào U937 cảm ứng LPS Chúng sử dụng LPS làm chất cảm ứng dòng tế bào U937 để thử nghiệm quy trình real-time RT-PCR phát khả làm gia tăng biểu mRNA TNF-α Kết cho thấy gia tăng biểu mRNA TNF-α nồng độ cảm ứng 10 µg/mL so với đối chứng thời điểm Trong đó, cảm ứng LPS nồng độ 10 µg/mL thời điểm 12 làm tăng biểu TNF- α lên 3,42 lần (hình 3.4) Như vậy, thí nghiệm này, U937 cần thời gian 31 dài để tăng cường biểu mRNA TNF-α đáp ứng với LPS Điều phù hợp với nghiên cứu trước cho tế bào U937 cảm ứng với LPS có biểu mRNA TNF-α, nhiên gia tăng biểu không cao Bên cạnh đó, biểu mRNA TNF-α mạnh tế bào U937 xử lý với 1,25-(OH)2D3 vòng 24 trước cảm ứng với LPS (Prehn & cs, 1992) Ngoài ra, cảm ứng U937 PMA trước xử lý với LPS làm tăng mạnh biểu mRNA TNF-α lên đến 11,8 lần so với đối chứng (Liu & cs, 2012) Hình 3.4: Mức độ thay đổi biểu gene TNF- α tế bào U937 cảm ứng LPS Như vậy, từ kết (mục 3.2.1 3.2.2) cho thấy phản ứng multiplex real-time PCR xây dựng phát thay đổi biểu mRNA IL-2 TNF-α Chúng tiếp tục áp dụng quy trình nhằm thử nghiệm khả làm tăng biểu IL-2 TNF-α majonosid-R2 ginsenosid-Rg1 Chúng tơi chọn hai hợp chất hợp chất Trung tâm Sâm dược liệu TP.HCM nghiên cứu, cho thấy có khả gây kích thích miễn dịch thử nghiệm chuột (Nguyễn Thượng Dong & cs, 2007) 32 Ngoài ra, nhiều cơng trình giới cho thấy ginsenosid-Rg1 có số ảnh hưởng định hoạt động miễn dịch (Qu & cs, 2011; Sun & cs, 2008) Tuy nhiên, chưa có cơng trình cơng bố ành hưởng hai chất lên biểu mRNA IL-2, TNF-α dòng tế bào Jurkat U937 3.2.3 Ảnh hưởng majonosid-R2 lên biểu IL-2 tế bào Jurkat Theo kết (hình 3.5), mRNA IL-2 tế bào Jurkat biểu mạnh thời điểm Tại thời điểm này, nồng độ majonosid-R2 cảm ứng 10 μg/mL làm tăng biểu mRNA IL-2 đến 5,81 lần, khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng, nồng độ μg/mL, tăng biểu mRNA IL-2 khơng có ý nghĩa thống kê Tuy nhiên, đến thời điểm 12 giờ, biểu IL-2 giảm mạnh nồng độ cảm ứng Như vậy, majonosid-R2 có khả gây cảm ứng biểu gene IL-2 biểu phụ thuộc nồng độ majonosid-R2 thời điểm Đây điểm đáng lưu ý khả gây kích thích miễn dịch majonosid-R2 Hình 3.5: Mức độ thay đổi biểu gene IL-2 tế bào Jurkat cảm ứng majonosid-R2 33 3.2.4 Ảnh hưởng majonosid-R2 lên biểu TNF-α tế bào U937 Kết kiểm tra real-time RT-PCR (hình 3.6) cho thấy nồng độ 5, 10 μg/mL, với thời gian khảo sát 6, 12 giờ, majonosid-R2 làm giảm biểu mRNA TNF-α so với đối chứng Kết phù hợp với nghiên cứu cho majonosid-R2 có khả ức chế đáng kể lượng TNF-α có huyết chuột chuột tiêm DGaIN/LPS (Tran & cs, 2002) Qua kết chúng tơi cho thấy majonosid-R2 có khả ức chế cytokine gây viêm TNF-α Hình 3.6: Mức độ thay đổi biểu gene TNF-α tế bào U937 cảm ứng majonosid-R2 3.2.5 Ảnh hưởng Ginsenosid-Rg1 lên biểu IL-2 tế bào Jurkat Sự biểu IL-2 tế bào Jurkat cảm ứng ginsenosid–Rg1 tất nồng độ vào thời gian khảo sát giảm có ý nghĩa thống kê so với đối chứng (hình 3.7) Trong đó, nghiên cứu Lee cộng (2004) cho thấy nồng độ µg/mL, ginsenosid-Rg1 cảm ứng tế bào T CD4+ chuột gia tăng nhẹ biểu gene IL-2 Điều mâu thuẫn, nhiên khác biệt 34 sử dụng loại tế bào nghiên cứu khác cần có nghiên cứu sâu để làm rõ vấn đề Hình 3.7 : Mức độ thay đổi biểu gene IL-2 tế bào Jurkat cảm ứng ginsenosid-Rg1 3.2.6 Ảnh hưởng ginsenosid-Rg1 lên biểu TNF-α tế bào U937 Từ kết (hình 3.8), ginsenosid-Rg1 ảnh hưởng đến biểu gene TNF-α Ở thời điểm 12 giờ, với nồng độ 5µg/mL, 10µg/mL ginsenosid-Rg1 cho thấy khả làm giảm biểu gene TNF-α so với đối chứng Kết chúng tơi phù hợp với nghiên cứu Wang cộng (2000), ginsenosid-Rg1 có hiệu ức chế sản xuất TNF-α tế bào THP-1 cảm ứng với LPS 100 µg/mL Ngồi ra, ginsenosid-Rg1 cho thấy có tác dụng làm giảm tạo TNF-α NO tế bào thần kinh đệm N9 (Wu & cs, 2007) 35 Hình 3.8: Mức độ thay đổi biểu gene TNF-α tế bào U937 cảm ứng ginsenosid-Rg1 Với kết thu từ việc áp dụng quy trình phát tính kích thích miễn dịch kỹ thuật real-time RT-PCR majonosid-R2 ginsenosidRg1, chúng tơi đánh giá ảnh hưởng chất lên biểu mRNA IL-2 TNF-α dòng tế bào Jurkat U937 36 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ  Kết luận Chúng tơi hồn thành đề tài với mục tiêu xây dựng, hoàn chỉnh quy trình in vitro xác định khả tăng cường miễn dịch hợp chất tự nhiên thông qua việc phát biểu mRNA IL-2, TNF-α kỹ thuật real-time RT-PCR, cụ thể sau: TT Sản phẩm Sản phẩm đạt Quy trình phát tính kích - thích miễn dịch real- bào /mL); thời gian cảm ứng (6 giờ, 12 ); nồng độ time RT-PCR cảm ứng (5 μg/mL 10 μg/mL ); ủ 37 C, 5% CO2 Nuôi cấy tế bào:Jurkat, U937 ; mật độ cấy (10 tế o Tách chiết RNA: KIT illustra RNAspin Mini (GE - Healthcare) Thu cDNA: reverse transcriptase (Khoa Thương), - o bảo quản -20 C Thành phần phản ứng : Nồng độ mồi: 500 nM ; - nồng độ mẫu dò: 500 nM, dNTP: 200 μM, đệm hTaq: 1X; h-Taq: 1,25U Chu trình nhiệt: - 95oC (15’); 95oC (30’’), 63,2oC (30’’) ,72oC (30’’) (x 45), 72oC (5’) Tính tốn: Mức độ tăng tương đối biểu gene –∆∆Ct =2 Trong đó: ∆∆Ct = ∆Ct cảm ứng – ∆Ct không cảm ứng ∆Ct = Ct gene mục tiêu – Ct gene chứng nội - 37 Số liệu tính gây kích thích - PHA làm tăng biểu gene IL-2 tế bào Jurkat miễn dịch PHA, LPS, lên đến 13,29 lần thời điểm sau cảm ứng , majonosid-R2, nồng độ cảm ứng 10 µg/ml Rg1 ginsenosid- - LPS làm tăng biểu gene TNF-α tế bào U937 lên 3,42 lần thời điểm sau cảm ứng , nồng độ cảm ứng 10 µg/ml - Majonosid-R2 làm tăng biểu gene IL-2 tế bào Jurkat lên đến 5,81 lần với nồng độ cảm ứng 10 µg/ml thời điểm làm giảm biểu gene TNF-α tế bào U937 - Ginsenosid-Rg1 làm giảm biểu gene IL-2, TNF-α hai dòng tế bào Jurkat U937 Bài báo khoa học - Poster hội nghị CNSH phía Nam 2013  Đề nghị Trong tương lai, mong muốn hỗ trợ để tiếp tục: - Mở rộng quy trình phát biểu gene cytokine khác có liên quan đến hoạt động miễn dịch IL-6, INF-γ, IL-8… - Phát triển thêm quy trình ELISA phát biểu protein cytokine 38