Xây dựng quy trình phát hiện cucumber mosaic virus tomato mosaic virus potato virus xvà potato virusy bằng kỹ thuật rtpcr phục vụ công tác tầm soát bệnh virus trên dưa leo cà chua và khoai tây

SỞ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN TP HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM CƠNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO NGHIỆM THU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN Cucumber mosaic virus, Tomato mosaic virus, Potato virus X VÀ Potato virus Y BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR PHỤC VỤ CÔNG TÁC TẦM SOÁT BỆNH VIRUS TRÊN DƯA LEO, CÀ CHUA VÀ KHOAI TÂY Mã số: TV02/14-15 Chủ nhiệm đề tài: ThS Nguyễn Xuân Dũng Cán thực hiện: KS Nguyễn Thị Hồng Trâm ThS Phạm Văn Hiểu ThS Nguyễn Xuân Dũng TP Hồ Chí Minh, tháng năm 2016 MỤC LỤC TĨM TẮT I THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI 10 II ĐẶT VẤN ĐỀ 12 III TỔNG QUAN TÀI LIỆU 13 III.1 Cucumber mosaic virus 13 III.1.1 Sơ lược Cucumber mosaic virus 13 III.1.2 Triệu chứng Cucumber mosaic virus 14 III.2 Tomato mosaic virus 15 III.2.1 Sơ lược Tomato mosaic virus 15 III.2.2 Triệu chứng Tomato mosaic virus 16 III.3 Potato virus X 16 III.3.1 Sơ lược Potato virus X 16 III.3.2 Triệu chứng Potato virus X 17 III.4 Potato virus Y 18 III.4.1 Sơ lược Potato virus Y 18 III.4.2 Triệu chứng Potato virus Y 19 III.5 Giới thiệu phương pháp phát virus 19 III.5.1 Phương pháp ELISA 19 III.5.2 Phương pháp RT-PCR 20 III.6 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 21 III.6.1 Tình hình nghiên cứu nước 21 III.6.2 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 21 IV VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 IV.1 Vật liệu 21 IV.2 Phương pháp nghiên cứu 22 IV.2.1 Thu thập nguồn mẫu nhiễm virus 22 Trang IV.2.2 Thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho việc phát virus 22 IV.2.3 Ly trích virus (RNA virus) từ mẫu nhiễm bệnh 22 IV.2.4 Thực phản ứng RT-PCR khuếch đại đoạn gen virus 23 IV.2.5 Dịng hóa kiểm tra trình tự đoạn gen sau khuếch đại 24 IV.2.5.1 Gắn đoạn gen mục tiêu vào vector nhân dòng 24 IV.2.5.2 Biến nạp plasmid vào vi khuẩn E coli phương pháp sốc nhiệt 24 IV.2.5.5 Tách plasmid từ tế bào vi khuẩn E.coli giải trình tự 25 IV.2.6 Tối ưu hóa phản ứng RT-PCR phát virus 25 IV.2.6.1 Tối ưu hóa thành phần phản ứng RT-PCR 25 IV.2.6.2 Thiết lập phản ứng multiplex RT-PCR 26 IV.2.6.3 Xác định ngưỡng phát phản ứng PCR 26 IV.2.6.4 Thiết lập phản ứng Real-time RT-PCR 26 IV.2.6.4.1 Thực phản ứng 26 V KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 V.1 Thu thập nguồn mẫu nhiễm virus 28 V.2 Thiết kế cặp mồi đặc hiệu phát virus 29 V.3 Ly trích RNA virus từ mẫu nhiễm bệnh 30 V.4 Khuếch đại đoạn gen virus phản ứng RT-PCR 33 V.4.1 Chọn cặp mồi thích hợp 33 V.4.2 Xác định nhiệt độ bắt cặp mồi tối ưu 36 V.4.2.1 Trường hợp mồi phát virus PVX 36 V.4.2.2 Trường hợp mồi phát virus PVY 38 V.4.2.3 Trường hợp mồi phát virus CMV 39 V.4.2.4 Trường hợp mồi phát virus ToMV 40 V.5 Dịng hóa kiểm tra trình tự gen sau khuếch đại 41 V.5.1 Kết chọn dòng tế bào mang vector tái tổ hợp 42 V.6 Tối ưu hóa phản ứng RT-PCR phát virus 48 V.6 Kết tối ưu hóa thành phần phản ứng RT-PCR 48 Trang V.6.2 Kết phản ứng multiplex RT-PCR phát đồng thời loại virus phản ứng 50 V.6.3 Kết xác định ngưỡng phát phản ứng PCR thường, multiplex PCR 51 V.6.4 Kết phản ứng Real-time RT-PCR 55 V.6.4.1 Phản ứng Real-time 55 V.6.4.2 Phân tích Melt curve (điểm nóng chảy) 56 V.6.4.3 Xây dựng đường chuẩn 57 VI KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 57 VI.1 Kết luận 57 VII TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 VII.1 Tiếng Việt 62 PHỤ LỤC 66 Trang DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CMV Cucumber mosaic virus ToMV Tomato mosaic virus PVX Potato virus X PVY Potato virus Y PLRV Potato leafroll virus TSWV Tomato spotted wilt virus Mo-MLV Murine leukemia virus AMV Avian myeloblastosis virus RNA Ribonucleic acid sgRNA Subgenomic RNA SatRNA Satellite RNA cDNA Complementary DNA CP Coat protein MP Movement protein PP Polyprotein TGB Triple gene block ORF Open reading frame PCR Polymerase chain reaction RT-PCR Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction ELISA Enzyme- Linked ImmunoSorbent Assay Taq polymerase Thermus aquaticus polymerase FAO Food and Agriculture Organization NCBI National Center for Biotechnology Information Trang DANH SÁCH BẢNG Bảng Các thành phần phản ứng RT-PCR 23 Bảng Chu kỳ nhiệt phản ứng RT-PCR 24 Bảng Các thành phần phản ứng phản ứng Real-time RT-PCR 27 Bảng Chu kỳ nhiệt phản ứng Real-time RT-PCR 27 Bảng Các cặp mồi thiết kế để phát loại virus CyMV, PVX, PVY,ToMV… 29 Trang DANH SÁCH HÌNH Hình Hình dạng cấu trúc gen virus CMV 14 Hình Triệu chứng nhiễm CMV trái dưa leo 15 Hình Hình dạng (Scholthof, 2000) cấu trúc gen (Ishibashi, 2012) CMV 15 Hình Triệu chứng nhiễm ToMV trái cà chua 16 Hình Hình dạng (Abbas, 2013) cấu trúc gen (Mecuria, 2008) PVX 17 Hình Triệu chứng nhiễm PVX c ủ khoai tây 18 Hình Hình dạng cấu trúc gen virus PVY 18 Hình Triệu chứng nhiễm PVY c ủ khoai tây 19 Hình Triệu chứng mẫu nhiễm bệnh 28 Hình 10 Kết điện di sản phẩm RT-PCR phát virus PVX với cặp mồi FPxCP/RPxCP mẫu RNA ly trích từ khoai tây in vitro 31 Hình 11 Kết điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR phát virus PVY với cặp mồi FPyCP/RPyCP mẫu RNA ly trích từ củ khoai tây 32 Hình 12 Kết điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR phát virus CMV với cặp mồi FCMVCP/RCMVCP mẫu RNA ly trích từ dưa leo 33 Hình 13 Kết điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR phát virus ToMV với cặp mồi FTCP RTCP mẫu RNA ly trích từ cà chua 33 Hình 14 Kết điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR kiểm tra khả phát cặp mồi FPxRd/RPxRd mẫu virus PVX 34 Hình 15 Kết điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR kiểm tra khả phát cặp mồi FPyPP/RPyPP mẫu virus PVX 35 Hình 16 Kết điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR kiểm tra khả phát cặp mồi FCMVMP/RCMVMP mẫu virus CMV 35 Hình 17 Kết điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR kiểm tra khả phát cặp mồi FTCP1/RTCP1 mẫu virus ToMV 36 Hình 18 Kết điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR phát virus PVX với cặp mồi FPxCP/RPxCP nhiệt độ Ta khác 37 Hình 19 Kết điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR phát virus PVX với cặp mồi FPxRd/RPxRd nhiệt độ Ta khác nhau…………………………………… 38 Hình 20 Kết điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR phát virus PVY với cặp mồi FPyCP/RPyCP nhiệt độ Ta khác 38 Hình 21 Kết điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR phát virus PVY với cặp mồi FPyPP/RPyPP nhiệt độ Ta khác 39 Hình 22 Kết điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR phát virus CMV với cặp mồi FCMVCP/RCMVCP nhiệt độ Ta khác 40 Trang Hình 23 Kết điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR phát virus ToMV với cặp mồi FTCP/RTCP nhiệt độ Ta khác 40 Hình 24 Cấu trúc vector nhân dịng pJET1.2/blunt 41 Hình 25 Khuẩn lạc phát triển môi trường chọn lọc 42 Hình 26 Kết PCR khuẩn lạc kiểm tra diện gen virus PVX cặp mồi pJET1.2 43 Hình 27 Kết PCR khuẩn lạc kiểm tra diện gen virus PVY cặp mồi pJET1.2.1 44 Hình 28 Kết PCR khuẩn lạc kiểm tra diện gen virus CMV cặp mồi pJET1.2.1 44 Hình 29 Kết PCR khuẩn lạc kiểm tra diện gen virus ToMV cặp mồi pJET1.2.1 45 Hình 30 Kết so sánh trình tự đoạn gen khuếch đại virus PVX với trình tự công bố Ngân hàng Gen quốc tế NCBI 46 Hình 31.Kết so sánh trình tự đoạn gen khuếch đại virus PVY với trình tự cơng bố Ngân hàng Gen quốc tế NCBI 46 Hình 32 Kết so sánh trình tự đoạn gen khuếch đại virus CMV với trình tự cơng bố Ngân hàng Gen quốc tế NCBI 47 Hình 33 Kết so sánh trình tự đoạn gen khuếch đại virus ToMV với trình tự cơng bố Ngân hàng Gen quốc tế NCBI 47 Hình 34 Kết điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR phát virus PVX với cặp mồi FPxCP/RPxCP nồng độ enzyme reverse transcriptase khác 48 Hình 35 Kết điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR phát virus PVX với cặp mồi PxRd nồng độ enzyme Taq polymerase khác 49 Hình 36 Kết điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR phát virus PVX với cặp mồi PxRd nồng độ inhibitor khác 50 Hình 37 Kết điện di sản phẩm phản ứng multiplex RT-PCR phát đồng thời virus PVX PVY 51 Hình 38 Kết điện di sản phẩm phản ứng multiplex RT-PCR phát đồng thời loại virus ToMV, PVX PVY 51 Hình 39 Kết điện di sản phẩm khuếch đại kiểm tra ngưỡng phát phản ứng PCR mẫu DNA virus PVX nồng độ 52 Hình 40 Kết điện di sản phẩm khuếch đại kiểm tra ngưỡng phát phản ứng PCR mẫu DNA virus CMV nồng độ 52 Hình 41 Kết điện di sản phẩm khuếch đại kiểm tra ngưỡng phát phản ứng PCR mẫu DNA virus ToMV nồng độ 53 Trang Hình 42 Kết điện di sản phẩm khuếch đại kiểm tra ngưỡng phát phản ứng multiplex PCR (35 chu kỳ) mẫu DNA virus PVX PVY nồng độ 53 Hình 43 Kết điện di sản phẩm khuếch đại kiểm tra ngưỡng phát phản ứng multiplex PCR (39 chu kỳ) mẫu DNA virus PVX PVY nồng độ 54 Hình 44 Kết điện di sản phẩm khuếch đại kiểm tra ngưỡng phát phản ứng triplex PCR (39 chu kỳ) mẫu DNA virus PVX, PVY ToMV nồng độ 55 Hình 45 Biểu đồ khuyếch đại dựa tín hiệu huỳnh quang (trục y) chu kỳ ngưỡng (trục x) cho PVX (A); PVY (B); CMV (C) ToMV (D) 56 Hình 46 Biểu đồ phân tích điểm nóng chảy sản phẩm khuyếch đại cho PVX (A); PVY (B); CMV (C) ToMV (D) 56 Hình 47 Đường chuẩn thể mối liên hệ chu kì ngưỡng (Ct) (trục y) độ pha loãng mẫu theo bậc 10 (trục x) cho PVY (B) ToMV (D) 57 Hình 48 Thành phần Kit RT-PCR phát virus Tomoto mosaic virus (ToMV)…… 62 Trang TÓM TẮT Cucumber mosaic virus (CMV), Tomato mosaic virus (ToMV), Potato virus X (PVX) Potato virus Y (PVY) virus gây hại phổ biến dưa leo, cà chua khoai tây, ba loại rau ngành trồng rau Việt Nam Do vậy, việc phát nhanh virus loại trồng nêu có ý nghĩa quan trọng Trong nghiên cứu này, phản ứng RT-PCR sử dụng để xây dựng quy trình phát riêng lẽ hay lúc loại virus mục tiêu Theo đó, nguồn mẫu bệnh ban đầu ly trích khuếch đại phản ứng RT-PCR với cặp mồi thiết kế chuyên biệt cho loại virus Kết khuếch đại đoạn gen virus quan tâm với độ nhạy phản ứng đạt mức 100, 1000 10000 tương ứng phản ứng đơn (monoplex), phản ứng đôi (doubleplex) phản ứng ba (triplex) Các đoạn gen mục tiêu sau khuếch đại gắn vào vector nhân dòng pJET1.2/blunt biến nạp vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5 Sự diện gen mục tiêu vector tái tổ hợp khẳng định, trình tự gen xác định thơng qua giải trình tự Kết cho thấy trình tự đoạn gen virus khuếch đại có độ tương đồng cao (94%-99%) so với trình tự virus công bố Ngân hàng Gen NCBI Các kết đạt giúp khẳng định quy trình phát loại virus mục tiêu phản ứng RT-PCR thực thành cơng Ngồi ra, để hướng đến việc phát triển khả định lượng virus cho quy trình phát hiện, phản ứng Realtime RT-PCR sử dụng thay cho phản ứng RT-PCR quy trình phát virus Trang Trong trường hợp, điểm nóng chảy chứng dương mẫu có nhiệt độ Điều cho thấy sản phẩm khuyếch đại phản ứng đoạn gen virus PVX, PVY, CMV ToMV (hình 46) V.6.4.3 Xây dựng đường chuẩn Các mẫu pha loãng từ 10 đến 10 sao/ μl có số chu kỳ ngưỡng (Ct) tăng tuyến tính theo nồng độ pha lỗng, tương ứng cho PVY ToMV Trái lại mẫu 10 0, 10 sao/ μl, hai trường hợp, số chu kỳ ngưỡng khơng tăng tuyến tính theo nồng độ pha lỗng Do đường chuẩn xây dựng với mẫu có nồng độ từ 10 đến 10 Hệ số tương quan R2 có giá trị 0,982 0,990 cho PVY ToMV Phương trình khuyếch đại: y = -3,587x + 17,019 với PVY y = -4,010x+ 43,499 với ToMV (hình 47) (B) (D) Hình 47 Đường chuẩn thể mối liên hệ chu kì ngưỡng (Ct) (trục y) độ pha loãng mẫu theo bậc 10 (trục x) cho PVY (B) ToMV (D) VI KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ VI.1 Kết luận Đã xây dựng thành cơng quy trình phát virus Cucumber mosaic virus (CMV), Tomato mosaic virus (ToMV), Potato virus X (PVX), Potato virus Y (PVY) Từ quy trình tạo Kit phát cho loại virus tương ứng 1.1 Các quy trình phát virus 1.1.1 Quy trình phát virus CMV Quy trình sử dụng chuyên biệt để phát Cucumber mosaic virus, bao gồm bước Bước 1: Mẫu nhiễm virus tách chiết RNA theo quy trình ly trích sucrose (Mẫu nghiền với dung dịch sucrose; đun nóng nhiệt độ 100 oC 15 phút; làm lạnh nhanh đá vòng phút; ly tâm 13.000 vòng/phút để loại bỏ cặn, thu phần Trang 57 dịch trích có chứa RNA virus) ly trích theo quy trình Kit ( phụ lục 1) Bảo quản mẫu sau ly trích -80 0C Bước 2: Thực phản ứng RT-PCR với thành phần hóa chất, mồi bắt cặp chu kì nhiệt sau: Các thành phần phản ứng phản ứng monoplex RT-PCR Hóa chất Thể tích 10X My Taq Buffer Nồng độ µl 2X My Taq DNA Polymerase (5U/ µl) 0,2 µl 1U RiboSafe RNase Inhibitor (40U/µl) 0,2 µl 6U AMV Reverse transcriptase (10U/µl) 0,1µl 1U FCMVCP primer (10 µM) 0,5 µl 0,2 µM RCMVCP primer (10 µM) 0,5 µl 0,2 µM 17,5 µl - RNA mẫu µl - Tổng cộng 25 µl - Nước khử DEPC Chu kỳ nhiệt phản ứng RT-PCR Chu kỳ Chu kỳ 50 0C/ 10 phút (RT-PCR) 950 C/ phút Chu kỳ (lập lại 39 lần) 95 0C /15 giây 52 0C/ 30 giây 72 0C/ 60 giây Chu kỳ 720 C / 15 phút Bước 3: Điện di sản phẩm PCR gel agarose 1,5% với hiệu điện 100 volt thời gian 30 phút, nhuộm gel sau điện di với ethidium bromide (1ng/μl) 15 phút Quan sát kết máy đọc gel (Geldoc) 1.1.2 Quy trình phát virus ToMV Quy trình sử dụng chuyên biệt để phát Tomato mosaic virus, bao gồm bước Bước 1: Mẫu nhiễm virus tách chiết RNA theo quy trình ly trích sucrose (Mẫu nghiền với dung dịch sucrose; đun nóng nhiệt độ 100 oC 15 phút; làm lạnh nhanh đá vòng phút; ly tâm 13.000 vòng/phút để loại bỏ cặn, thu phần dịch trích có chứa RNA virus) ly trích theo quy trình Kit ( phụ lục 1) Bảo quản mẫu sau ly trích -80 0C Trang 58 Bước 2: Thực phản ứng RT-PCR với thành phần hóa chất, mồi bắt cặp chu kì nhiệt sau: Các thành phần phản ứng phản ứng monoplex RT-PCR Hóa chất Thể tích 10X My Taq Buffer Nồng độ µl 2X My Taq DNA Polymerase (5U/ µl) 0,2 µl 1U RiboSafe RNase Inhibitor (40U/µl) 0,2 µl 6U AMV Reverse transcriptase (10U/µl) 0,1µl 1U FTCP primer (10 µM) 0,5 µl 0,2 µM RTCP primer (10 µM) 0,5 µl 0,2 µM 17,5 µl - RNA mẫu µl - Tổng cộng 25 µl - Nước khử DEPC Chu kỳ nhiệt phản ứng RT-PCR Chu kỳ Chu kỳ (RT-PCR) (lập lại 39 lần) Chu kỳ 95 0C /15 giây 50 C/ 10 phút Chu kỳ 950 C/ phút 52 0C/ 30 giây 720 C / 15 phút 72 0C/ 60 giây Bước 3: Điện di sản phẩm PCR gel agarose 1,5% với hiệu điện 100 volt thời gian 30 phút, nhuộm gel sau điện di với ethidium bromide (1ng/μl) 15 phút Quan sát kết máy đọc gel (Geldoc) 1.1.3 Quy trình phát virus PVX Quy trình sử dụng chuyên biệt để phát Potato virus X, bao gồm bước Trang 59 Bước 1: Mẫu nhiễm virus tách chiết RNA theo quy trình ly trích sucrose (Mẫu nghiền với dung dịch sucrose; đun nóng nhiệt độ 100 oC 15 phút; làm lạnh nhanh đá vòng phút; ly tâm 13.000 vòng/phút để loại bỏ cặn, thu phần dịch trích có chứa RNA virus) ly trích theo quy trình Kit ( phụ lục 1) Bảo quản mẫu sau ly trích -80 0C Bước 2: Thực phản ứng RT-PCR với thành phần hóa chất, mồi bắt cặp chu kì nhiệt sau: Các thành phần phản ứng phản ứng monoplex RT-PCR Hóa chất Thể tích 10X My Taq Buffer Nồng độ µl 2X My Taq DNA Polymerase (5U/ µl) 0,2 µl 1U RiboSafe RNase Inhibitor (40U/µl) 0,2 µl 6U AMV Reverse transcriptase (10U/µl) 0,1µl 1U FPxCP primer (10 µM) 0,5 µl 0,2 µM RPxCP primer (10 µM) 0,5 µl 0,2 µM 17,5 µl - RNA mẫu µl - Tổng cộng 25 µl - Nước khử DEPC Chu kỳ nhiệt phản ứng RT-PCR Chu kỳ Chu kỳ 50 0C/ 10 phút (RT-PCR) 950 C/ phút Chu kỳ (lập lại 39 lần) 95 0C /15 giây 50 0C/ 30 giây 72 0C/ 60 giây Chu kỳ 720 C / 15 phút Bước 3: Điện di sản phẩm PCR gel agarose 1,5% với hiệu điện 100 volt thời gian 30 phút, nhuộm gel sau điện di với ethidium bromide (1ng/μl) 15 phút Quan sát kết máy đọc gel (Geldoc) 1.1.4 Quy trình phát virus PVY Quy trình sử dụng chuyên biệt để phát Potato virus Y, bao gồm bước Bước 1: Mẫu nhiễm virus tách chiết RNA theo quy trình ly trích sucrose (Mẫu nghiền với dung dịch sucrose; đun nóng nhiệt độ 100 oC 15 phút; làm Trang 60 lạnh nhanh đá vòng phút; ly tâm 13.000 vòng/phút để loại bỏ cặn, thu phần dịch trích có chứa RNA virus) ly trích theo quy trình Kit ( phụ lục 1) Bảo quản mẫu sau ly trích -80 0C Bước 2: Thực phản ứng RT-PCR với thành phần hóa chất, mồi bắt cặp chu kì nhiệt sau: Các thành phần phản ứng phản ứng monoplex RT-PCR Hóa chất 10X My Taq Buffer My Taq DNA Polymerase (5U/ µl) RiboSafe RNase Inhibitor (40U/µl) AMV Reverse transcriptase (10U/µl) FPyCP primer (10 µM) Thể tích µl 0,2 µl 0,2 µl 0,1µl 0,5 µl Nồng độ 2X 1U 6U 1U 0,2 µM 0,5 µl 17,5 µl µl 25 µl 0,2 µM - RPyCP primer (10 µM) Nước khử DEPC RNA mẫu Tổng cộng Chu kỳ nhiệt phản ứng RT-PCR Chu kỳ Chu kỳ 50 0C/ 10 phút (RT-PCR) 950 C/ phút Chu kỳ (lập lại 39 lần) 95 0C /15 giây 50 0C/ 30 giây 72 0C/ 60 giây Chu kỳ 720 C / 15 phút Bước 3: Điện di sản phẩm PCR gel agarose 1,5% với hiệu điện 100 volt thời gian 30 phút, nhuộm gel sau điện di với ethidium bromide (1ng/μl) 15 phút Quan sát kết máy đọc gel (Geldoc) Ghi chú: Khi thực phản ứng multiplex sử dụng đồng thời cặp mồi nên làm thay đổi thể tích phản ứng, phải thay đổi thể tích nước khử DEPC để tổng thể tích phản ứng khơng thay đổi, thành phần cịn lại giữ nguyên 1.2 Bộ kit RT-PCR phát cho loại virus Từ quy trình phát loại virus trên, phát triển Kit tương ứng, với thành phần cụ thể sau: Dịch ly trích mẫu (30 ml) Trang 61 Master mix: My Taq Buffer, My Taq DNA Polymerase, RiboSafe RNase Inhibitor, AMV Reverse transcriptase (300 µl) Nước khử trùng DEPC (1 ml) Mồi khuếch đại gen virus (60µl) Trong đó, thành phần dịch ly trích mẫu, master mix, nước khử trùng giống cho Kit Thành phần mồi thay đổi Kit cụ thể (hình 48) Hình 48 Thành phần Kit RT-PCR phát virus Đã dịng hóa giải trình tự đoạn gen virus sau khuếch đại Kết giải trình tự khẳng định đoạn gen khuếch đại đoạn gen virus quan tâm Ngân hàng Gen quốc tế NCBI Đã thiết lập phản ứng Real-time RT-PCR định lượng xác định điểm nóng chảy đặc trưng sản phẩm khuếch virus PVX, PVY, CMV, ToMV xây dựng đường chuẩn cho loại virus PVY, ToMV VI.2 Đề nghị Tiếp tục xây dựng Realtime RT-PCR định lượng xây dựng đường chuẩn cho loại virus cịn lại Ứng dụng quy trình phát virus Cucumber mosaic virus, Tomato mosaic virus, Potato virus X Potato virus Y phục vụ công tác tầm soát virus gây bệnh loại rau VII TÀI LIỆU THAM KHẢO VII.1 Tiếng Việt Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2002 Sinh học phân tử NXB Giáo dục Lâm Ngọc Hạnh, 2005 Đánh giá tình trạng nhiễm bệnh virus (Cucumber mosaic virus, Tobacco mosaic virus Tomato spotted wilt virus) cà chua (Solanum lycopersicum) tỉnh Lâm Đồng kỹ thuật ELISA bước đầu xây dựng quy trình chẩn đốn Tobacco mosaic virus kỹ thuật RT-PCR Khóa luận Tốt nghiệp Bộ mơn Cơng nghệ Sinh học Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Trang 62 Nguyễn Đình Trường, 2005 Nghiên cứu trạng nhiễm bệnh TSWV (Tomato spotted wilt virus) ớt kỹ thuật ELISA bước đầu xây dựng phương pháp chẩn đoán kỹ thuật RT - PCR Khóa luận tốt nghiệp Bộ mơn Cơng nghệ Sinh học Trường Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Phạm Hùng Vân, 2009 PCR Real-time PCR, vấn đề áp dụng thường gặp Nhà xuất Y Học Vương Hồ Vũ, 2005 Nghiên cứu số virus khoai tây (PVX, PVY, PLRV) Đà Lạt kỹ thuật ELISA, RT-PCR giải trình tự Khóa luận Tốt nghiệp Bộ mơn Công nghệ Sinh học Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Vũ Triệu Mân, 2003 Chẩn đốn nhanh bệnh hại thực vật NXB Hà Nội VII.2 Tiếng Anh Abbas M F., 2013 New molecular tools for the detection of Potato virus X in potato crop of Pakistan Zaraimedia.com Atabekov J G., Rodionova N P., Karpova O V., Kozlovsky S V., Novikov V K., and Arkhipenko M V., 2001 Translational Activation of Encapsidated Potato Virus X RNA by Coat Protein Phosphorylation Journal of Virology 286, 466-474 A Jeevalatha Detection of potato viruses through molecular techniques Castello J D., Rogers S O., Starmer W T., Catranis C M., Ma L., Bachand G D., Zhao Y., and Smith J E., 1999 Detection of Tomato mosaic tobamovirus RNA in ancient glacial ice Polar Biol 22: 207-212 Dharmaraj MS S., 2008 RT-PCR: The basic Decai Tuo 1,2 , WentaoShen1 and cs, 2014 Development and Validation of a Multiplex Reverse Transcription PCR Assay for simultaneous Detection of Three Papaya Viruses Viruses of Plants, Fungi and Protoza, 6(10), 3893-3906 FAO, 2000 Tomato intergrated pest mangement An ecological Guide FAO interCountry programme for the development and aplication of intergrated pset management in vegetable growing in South and South-East Asia.15 Gawande S.J., Shukla A., Chimote V.P., Kaushal N., Kaundal P., Garg I.D and Chimote K.P., 2011 Development of PCR-based techniques for the detection of immobilised Potato virus Y virions Journal of Plant Pathology, 93 (1): 127-132 Ghosh S.B and Bapat A., 2006 Development of RT-PCR based method for detection of Potato virus Y in tobacco and potato Indian Journal of Biotechnology, 5: 232-235 10 Hu J S., Ferreira S and Wang M., 1993 Detection of cymbidium mosaic virus, odontoglossum ringspot virus, tomato spotted wilt virus, and potyviruses infecting orchids in Hawaii Plant Disease, 77(5): 464-468 Trang 63 11 Hu J S., Li H P., Barry K., Wang M., 1995 Comparison of Dot blot, Elisa, and RT-PCR assays for detection of two Cucumber mosaic virus isolates infecting banana in Hawaii Plant Disease 79(9): 902-906 12 Hu X., Karasev A V., Brown C J and Lorenzen J H., 2009 Sequence characteristics of potato virus Y recombinants Journal of General Virology, 90, 3033– 3041 13 Ishibashi1 K., Mawatari1 N., Miyashita1 S., Kishino H., Meshi T., Ishikawa M., 2012 Coevolution and Hierarchical Interactions of Tomato mosaic virus and the Resistance Gene Tm-1 PLOS Pathogens, 8(10):1-12 14 Jones R., Kumar S and Mackie A., 2003 Potato virus Y Department of Agriculture Factsheeta 2p 15 Kerlan C., 2006 Potato virus Y Descriptions of plant viruses Association at Applied Biologists http://www.dpvweb.net 16 Kubota K., Tsuda S., Tamai A And Meshi T., 2003 Tomato mosaiv virus replication protein suppresses virus-targeted posttranscriptional gene silencing Journal of Virology 77(20): 1016-1026 17 Kumar S., Udaya Shankar AC., Lun OS.,Prakash HS., 2011 Detection of Tobacco mosaic virus and Tomato mosaic virus in pepper and tomato by multiplex RT-PCR Lett Appl Microbiol 53(3): 359-363 18 Lorenzen, J H., Piche, L M., Gudmestad, N C., Meacham, T., and Shiel, P 2006 A multiplex PCR assay to characterize Potato virus Y isolates and identify strain ixtures Plant Disease 90:935-940 19 Mecuria T A., 2008 Agrobacterium study of vascular movement of potato virus X (PVX) TGBp1, TGBp2 and CP using the commelina yellow mottle virus promotor and GFP ProQuest Information and Learning Company.16 20 Mortimer-Jones S.M., Jones M.G.K., Jones R.A.C., Thomson G and Dwyer G.I., 2009 A single tube, quantitative real-time RT-PCR assay that detects four potato viruses simultaneously Journal of Virological Methods, 161 (2): 289-296 21 Mackenzie TD., Nie X., SinghM., 2015 RT-PCR and real-time RT-PCR methods for the detection of potato virus Y in potato leaves and tubers Methods Mol Biol, 2015;1236: 13-26 22 Przemyslaw Wieczorel and cs., 2013 Multiplex RT-PCR reaction for simultaneous detection of Tomato torrado virus and Penino mosaic virus Journal of plant protection research, Vol 53, No (2013) 23 Peiman M and Xie C., 2006 Sensitive detection of potato viruses, PVX, PLRV and PVS, by RT-PCR in potato leaf and tuber Australasian Plant Disease Notes, 1: 41–46 Trang 64 24 Raj S.K., Saxena S, Hallan V and Singh B.P., 1998 Reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RT-PCR) for direct detection of Cucumber mosaic virus (CMV) in gladiolus Biochemistry and Molecular Biology International 44(1): 89-95 25 Scholthof, K-B.G 2000 Tobacco mosaic virus The Plant Health Instructor DOI:10.1094/PHI-I-2000-1010-0 Updated 2005 26 Seoh ML., Sek-Man Wong and Lee Zhang, 1998 Simultaneous TD:RT-PCR detection of cymbidium mosaic potexvirus and odontoglossum ringspot with a single pair of primers Journal of Virological Methods 72(2): 197-204 27 Sicora, 2011 Virus diseases of tomato Alabama cooperative extention system ARN0836:1-6 28 Singh Z., Jones R A C., and Jones M G K., 1995 Identification of Cucumber mosaic virus subgroup I isolates from banana plant affected by infecton chlorosis diseae using RT-PCR Plant Disease 79: 713-716 29 Verchot-Lubicz J., Ye C M., Bamunusinghe D., 2007 Molecular biology of Potexviruses: recent advances Journal of Gen Viroogy 88: 1643-1655 30 Zitikaitė I and Staniulis J The use RT-PCR for detection of viruses infecting cucumber Agronomy Research 4(special issue): 471-474 31 Zitikaitė I., Staniulis J., Urbanavičienė L., Žižytė M., 1995 Cucumber mosaic virus identification in pumpkin plants Žemdirbystė=Agriculture, 98 (4): 421‒426 32 Zitter T A., and Murphy J.F., 2009 Cucumber mosaic virus The Plant Health Instructor DOI: 10.1094/PHI-I-2009-0518-01 TP Hồ Chí Minh, ngày tháng năm PHĨ GIÁM ĐỐC TRƯỞNG PHỊNG CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI CHUN MƠN TS Hà Thị Loan ThS Nguyễn Xuân Dũng ThS Nguyễn Xuân Dũng GIÁM ĐỐC TS Dương Hoa Xô Trang 65 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Quy trình ly trích RNA Kit EZ-10 Spin RNA Minipreps - Nghiền 0,01-0,05 g mẫu thực vật nitơ lỏng chày sứ thành bột mịn - Thêm 450 l Buffer Rlysis-PG vào ống Ủ 5’ nhiệt độ phòng để dung dịch ly giải hoàn toàn - Ly tâm 12000 xg, 5’ Chuyển dịch ly giải phía vào epp 1,5 ml - Thêm 1/2 thể tích ethanol, trộn cách đảo ống - Chuyển dịch ly giải phía vào cột spin, ly tâm 12000 xg, 30’’ nhiệt độ phòng, loại dịch qua cột - Thêm 500 l Universal GT solution vào cột, ly tâm 12000 xg, 30’’ nhiệt độ phòng, loại dịch qua cột - Thêm 500 l Universal NT solution vào cột, ly tâm 12000 xg, 30’’ nhiệt độ phòng, loại dịch qua cột - Ly tâm 12000 xg, 30’’ nhiệt độ phòng - Đặt cột vào ống epp 1,5 ml mới, thêm 50 l nước RNase-free, giữ nhiệt độ phòng 2’ Ly tâm 12000 xg, 30’’ - Giữ mẫu RNA -80 0C Phụ lục 2: Trình tự cặp mồi FpJET1.2/RpJET1.2 Mồi Trình tự Nhiệt độ bắt cặp FpJET1.2 5’-CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC-3’ 61,0 0C RpJET1.2 5’-AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-3’ 54,0 0C Phụ lục 3: Thành phần phản ứng PCR kiểm tra khuẩn lạc Trang 66 STT Thành phần nồng độ Thể tích (µl) H2O deion khử trùng 16,7 5X My Taq buffer Mồi FpJET1.2 (0.2 M) 0,5 Mồi RpJET1.2 (0.2 M) 0,5 enzyme Taq polymerase 0,3 Dịch khuẩn 2,0 Tổng 25 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR khuẩn lạc Bước Phản ứng Nhiệt độ (0C) Thời gian Biến tính 94 phút Biến tính 94 30 giây Gắn mồi 60 30 giây Kéo dài chuỗi 72 phút Hoàn tất kéo dài chuỗi 72 10 phút Kết thúc phản ứng ∞ Chu kỳ 35 Phụ lục 4: Quy trình tách plasmid Kit ISOLATE II Plasmid Mini Kit - Thêm 250 l Buffer P1 đảo ống vài lần Thêm 250 l Buffer P2, trộn việc đảo ống Ủ 5’ nhiệt độ phòng Thêm 600 l Buffer P3 Ly tâm 5’, 11000 xg, nhiệt độ phòng Hút 750 l dịch lỏng ống vào cột Isolate II Plasmid Mini Spin Column đặt ống ml Ly tâm 1’,11000 xg, nhiệt độ phòng Loại dịch chảy qua cột Thêm 600 l Wash Buffer PW2 (bổ sung ethanol) Ly tâm 1’ 11000 xg Loại dịch chảy qua cột dùng lại ống Ly tâm 2’ 11000 xg để loại lượng ethanol cịn sót lại Đặt cột Isolate II Plasmid Mini Spin Column vào epp 1,5 ml Thêm 50 l Buffer P, ủ 2’ 70 0C Ly tâm 1’ 11000 xg Phụ lục 5: Các thành phần phản ứng RT-PCR khảo sát nồng độ Trang 67 Hóa chất 5X My Taq Buffer My Taq DNA Polymerase (5U/ µl) RiboSafe RNase Inhibitor (40U/µl) Tetro Reverse Transcriptase (10U/µl) Primer F (10 µM) Primer R (10 µM) Nước deion khử trùng RNA mẫu Tổng cộng Thể tích µl 0,2-0,4 µl 0,1-0,3 µl 0,1-0,3 µl 0,5 µl 0,5 µl 16,95 µl µl 25 µl Nồng độ 2X 1-2U 4-12U 1-2,5U 0,2 µM 0,2 µM - Phụ lục 6: Các thành phần phản ứng multiplex RT-PCR phát loại virus Hóa chất 5X My Taq Buffer Nước deion khử trùng Primer1 F (0,2 µM) Primer1 R (0,2 µM) Primer2 F (0,2 µM) Primer2 R (0,2 µM) RiboSafe RNase Inhibitor (6U) Tetro Reverse Transcriptase (2U) My Taq DNA Polymerase (1U) RNA virus RNA virus Tổng thể tích Thể tích µl 16,4 µl 0,5 µl 0,5 µl 0,5 µl 0,5 µl 0,15 µl 0,25 µl 0,2 µl 0,5 µl 0,5µl 25 µl Hóa chất 5X My Taq Buffer Nước deion khử trùng Primer1 F (0,2 µM) Primer1 R (0,2 µM) Primer2 F (0,2 µM) Primer2 R (0,2 µM) Primer3 F (0,2 µM) Primer3 R (0,2 µM) Thể tích µl 15,4 µl 0,5 µl 0,5 µl 0,5 µl 0,5 µl 0,5 µl 0,5 µl Trang 68 RiboSafe RNase Inhibitor (6U) Tetro Reverse Transcriptase (2U) My Taq DNA Polymerase (1U) RNA virus RNA virus Tổng thể tích 0,15 µl 0,25 µl 0,2 µl 0,5 µl 0,5µl 25 µl Phụ lục 7: Các thành phần phản ứng PCR kiểm tra độ nhạy Hóa chất 5X My Taq Buffer My Taq DNA Polymerase (1,5U) Primer F (0,2 µM) Primer R (0,2 µM) Nước deion khử trùng DNA plasmid Tổng thể tích Thể tích µl 0,3 µl 0,5 µl 0,5 µl 17,7 µl µl 25 µl Phụ lục 8: Quy trình phát virus Hóa chất - Bộ kit tách chiết RNA (Kit EZ-10 Spin RNA Minipreps) - Emzyme Taq polymerase (My Taq DNA Polymerase 5U/ µl) - Dung dịch đệm cho Taq polymerase (10X My Taq Buffer) - Enzyme Reverse transcriptase (AMV Reverse Transcriptase 10U/µl) - Chất ức chế RNase Inhibitor (RiboSafe RNase Inhibitor 40U/µl) - dNTP (10mM) - Nước khử DEPC - Mồi phát virus Thiết bị dụng cụ - Máy ly tâm (Ly trích RNA virus) - Máy PCR (Khuếch đại đoạn gen) - Bồn điện di (Điện di sản phẩm sau khuếch đại) - Máy đọc gel (Phân tích chụp ảnh kết sau điện di) - Micropipett (Hút loại hóa chất) Trang 69 Các bước tiến hành 3.1 Tách chiết RNA theo quy trình (phụ lục 1) 3.2 Thực phản ứng RT-PCR với thành phần hóa chất, chu kì nhiệt loại mồi sau: - Các thành phần phản ứng phản ứng monoplex RT-PCR, multiplex RT-PCR Hóa chất Thể tích 10X My Taq Buffer Nồng độ µl 2X My Taq DNA Polymerase (5U/ µl) 0,2 µl 1U RiboSafe RNase Inhibitor (40U/µl) 0,2 µl 6U AMV Reverse transcriptase (10U/µl) 0,1µl 1U Primer F (10 µM) 0,5 µl 0,2 µl Primer R (10 µM) 0,5 µl 0,2 µl Nước khử DEPC 17,5 µl - µl - RNA mẫu Tổng cộng 25 µl * Ghi chú: Đối với phản ứng multiplex sử dụng đồng thời cặp mồi nên làm thay đổi thể tích phản ứng, phải thay đổi thể tích nước khử DEPC để tổng thể tích phản ứng khơng thay đổi, thành phần lại giữ nguyên - Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR/RT-PCR Chu kỳ Chu kỳ Chu kỳ (lập lại 39 lần) Chu kỳ 950 C/ phút 95 0C /15 giây 53 0C/ 30 giây 72 0C/ 60 giây 720 C / 15 phút 50 C/ 10 phút (RT-PCR) - Loại mồi sử dụng tương ứng với loại virus Kí hiệu FCMVCP Trình tự mồi Mồi phát virus CMV 5’- TTCTACCGTGTGGGTGACG - 3’ Nhiệt độ bắt cặp (o C) Kích thước sản phẩm (bp) 52 286 Trang 70 RCMVCP FPxCP RPxCP FPyCP RPyCP FTCP RTCP 5’- AGATGTGGGGATGCGTTG - 3’ Mồi phát virus PVX 5’ - CGGATGGGGATTTCTTTAGT - 3’ 5’ - GGCAGGTGGACTGTTGTTAG – 3’ Mồi phát virus PVY 5’ - AGAATGCCCAAAAGCAAGG - 3’ 5’ - CTGGTGTTCGTGATGTGACC - 3’ Mồi phát virus ToMV 5’ - CAGAGCACCGTCAGATTTCC – 3’ 5’ - AGACCGAATTGCAACCGTAG – 3’ 50 332 50 469 52 201 3.3 Điện di sản phẩm PCR gel agarose 1,5% với hiệu điện 100 volt thời gian 30 phút, nhuộm gel sau điện di với ethidium bromide (1ng/μl) 15 phút Quan sát kết máy đọc gel (Geldoc) * Giá thành phản ứng phát (từ ly trích quan sát đánh giá kết quả): 100.000đ/phản ứng Phụ lục 9: Các sinh viên đào tạo từ đề tài TT Họ tên Tên đề tài tốt nghiệp Năm tốt nghiệp Cơ sở đào tạo Đinh Thị Xuân Diệu Phát Potato virus Y Tomato mosaic virus gây bệnh cà chua kỹ thuật RT-PCR 2014 Đại học Tơn Đức Thắng Đặng Hồng Nhi Phát Cucumber mosaic virus gây bệnh dưa leo kỹ thuật RT-PCR 2014 Đại học Tôn Đức Thắng Trang 71