Xây dựng quy trình phát hiện nhanh vi khuẩn salmonella spp trên nền mẫu thịt và rau bằng kỹ thuật lamp loop mediated isothermal amplification năm thứ 2

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP HCM TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO BÁO CÁO NGHIỆM THU NHIỆM VỤ KHOA HỌC - CƠNG NGHỆ XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN NHANH VI KHUẨN SALMONELLA SPP TRÊN NỀN MẪU THỊT VÀ RAU BẰNG KỸ THUẬT LAMP (LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION) (NĂM THỨ 2) ThS Nguyễn Phạm Trúc Phương Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 12/2019 BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP HCM TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO BÁO CÁO NGHIỆM THU NHIỆM VỤ KHOA HỌC - CÔNG NGHỆ XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN NHANH VI KHUẨN SALMONELLA SPP TRÊN NỀN MẪU THỊT VÀ RAU BẰNG KỸ THUẬT LAMP (LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION) (NĂM THỨ 2) CHỦ NHIỆM NHIỆM VỤ Nguyễn Phạm Trúc Phương CƠ QUAN QUẢN LÝ CƠ QUAN CHỦ TRÌ Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 12/2019 BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP.HCM TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO BÁO CÁO NGHIỆM THU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN NHANH VI KHUẨN Salmonella spp TRÊN NỀN MẪU THỊT VÀ RAU BẰNG KỸ THUẬT LAMP (LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION) CHỦ NHIỆM NDNC Nguyễn Phạm Trúc Phương THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 12/2019 BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP.HCM TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO BÁO CÁO NGHIỆM THU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN NHANH VI KHUẨN Salmonella spp TRÊN NỀN MẪU THỊT VÀ RAU BẰNG KỸ THUẬT LAMP (LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION) CHỦ NHIỆM NDNC Nguyễn Phạm Trúc Phương THÀNH PHỐ HỜ CHÍ MINH THÁNG 12/2019 TĨM TẮT ĐỀ TÀI Salmonella vi khuẩn gây bệnh dịch từ thực phẩm phân lập hầu hết thực phẩm (chủ yếu rau xà lách tươi thịt heo tươi) Mục tiêu nghiên cứu thiết lập quy trình phát nhanh vi khuẩn Salmonella spp mẫu thịt rau kỹ thuật LAMP đáp ứng yêu cầu ứng dụng phân tích Kết nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích trực tiếp Salmonella từ thực phẩm dựa phản ứng LAMP, bao gồm: tăng sinh mẫu môi trường (150 ml BPW: 75 ml RVS), thời gian 10 ± mẫu rau tươi thịt tươi; cải tiến phương pháp tách chiết nhanh thu DNA từ dịch tăng sinh mẫu thực phẩm sử dụng đệm NaOH 50 mM (rau) NaOH 100 mM (thịt)), gia nhiệt phút 95ᴼC, siêu âm 30 giây, ly tâm 10.000 g phút thu dịch DNA cho phản ứng LAMP Kết nghiên cứu cho thấy phương pháp xây dựng có độ đặc hiệu (SP) đạt 94%; độ xác (AC) đạt 94%; độ nhạy (SE) đạt 100%; tỷ lệ âm tính giả 0% tỷ lệ dương tính giả 6%, LOD50 CFU/25g Hiệu phân tích Salmonella phương pháp được xây dựng tương đương với phương pháp phương pháp real-time PCR (theo quy trình ISO 16140:2003) có kết cho thời gian phân tích ngắn, sau 12 Từ khóa: LAMP, Salmonella, gen invA, HNB, thịt, rau Trang i MỤC LỤC Trang TÓM TẮT ĐỀ TÀI i MỤC LỤC ii DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT .v DANH SÁCH BẢNG .vi DANH SÁCH HÌNH viii THÔNG TIN ĐỀ TÀI .2 MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung Salmonella spp .5 1.2 Tình hình nhiễm Salmonella thực phẩm 1.3 Các phương pháp phát Salmonella spp 1.4 Kỹ thuật Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) 10 1.5 Các nghiên cứu nước ứng dụng LAMP 12 1.6 Kết nghiên cứu năm 2018 23 1.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình tăng sinh Salmonella …………………… 24 1.7.1 Ảnh hưởng thành phần môi trường đến trình tăng sinh …………….25 1.7.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình tăng sinh ………………… ……….26 1.7.3 Ảnh hưởng mẫu thực phẩm đến trình tăng sinh ………………… 27 1.8 Một số kỹ thuật tách chiết thu nhận nhanh DNA cho phản ứng khuếch đại DNA………………………………………………………………………… 1.8.1 Các yêu cầu DNA sử dụng cho kỹ thuật nhân gen … …28 ……… 29 1.8.2 Tách chiết tinh DNA ………………………………………… … 30 Chương NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 31 2.2 Vật liệu nghiên cứu 31 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 31 2.2.2 Hóa chất thí nghiệm 31 2.2.3 Thiết bị thí nghiệm 31 Trang ii 2.3 Nội dung nghiên cứu 32 2.3.1 Nội dung 1: Xây dựng quy trình tăng sinh Salmonella spp nhanh 32 2.3.2 Nội dung 2: Xây dựng quy trình tách chiết nhanh DNA Salmonella spp 34 2.3.3 Nội dung 3: Đánh giá quy trình phân tích Salmonella mẫu thịt heo rau 36 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 3.1 Nội dung 1: Xây dựng quy trình tăng sinh nhanh Salmonella spp .40 3.2 Nội dung 2: Xây dựng quy trình tách chiết nhanh DNA Salmonella spp 48 3.2.1 Khảo sát khả tách chiết DNA vi khuấn Salmonella spp Triton X100 NaOH kết hợp siêu âm gia nhiệt 95ᴼC mẫu rau tươi 49 3.2.2 Khảo sát khả tách chiết DNA vi khuẩn Salmonella spp Triton X100 NaOH kết hợp siêu âm gia nhiệt 95ᴼC mẫu thịt heo 56 3.2.3 Đánh giá hiệu tách chiết DNA vi khuẩn Salmonella spp phương pháp mẫu rau tươi thịt heo tươi 63 3.3 Nội dung 3: Đánh giá quy trình phân tích Salmonella mẫu thịt heo tươi rau tươi 66 3.3.1 Đề xuất quy trình phân tích Salmonella spp nhiễm mẫu rau tươi thịt heo tươi phương pháp LAMP dựa gen mục tiêu invA 66 3.3.2 Kiểm tra độ chọn lọc theo phương pháp (Theo ISO 16140: 2016) 67 3.3.3 Xác định giới hạn phát (LOD50) phương pháp xây dựng 69 3.3.4 Xác định thông số kỹ thuật phương pháp 70 3.3.5 Chứng thực phương pháp cách so sánh liên phòng 71 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .75 4.1 Kết luận 75 4.2 Kiến nghị 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO .80 PHỤ LỤC I ………………………………………………………………………….-1PHỤ LỤC II - PHỤ LỤC III - PHỤ LỤC IV - - Trang iii PHỤ LỤC V - PHỤ LỤC VI - PHỤ LỤC VII - 39 PHỤ LỤC VIII - 40 - Trang iv DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT THUẬT NGỮ TIẾNG ANH LAMP LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION PCR Polymerase Chain Reaction inv Invasion protein InvA BPW Buffer Pepton Water RVS Rappaport Vassiliadis Salmonella Enrichment Broth Trang v [86] Rantakokko-Jalava K., Jalava J., 2002, Optimal DNA isolation method for detection of bacteria in clinical specimens by broad-range PCR, Journal of Clinical Microbiology, 40 (11), pp 4211-4217 [87] Ravan H., Amandadi M., 2017, Molecular detection of pathogenic serovar Salmonella enteritidis by LAMP method using a specific marker screened by comparative genomic methods, Iran J Med Microbiol, 11 (1), pp 18-29 [88] Ravan H., Yazdanparast R., 2012a, Development and evaluation of a loopmediated isothermal amplification method in conjunction with an enzyme-linked immunosorbent assay for specific detection of Salmonella serogroup D, Analytica Chimica Acta, 733, pp 64–70 [89] Ravan H., Yazdanparast R., 2012b, Development of a new loop-mediated isothermal amplification assay for prt (rfbS) gene to improve the identification of Salmonella serogroup D, World Journal of Microbiology and Biotechnology, 28(5), pp 2101–2106 [90] Reeves M.W., Evins G.M., Heiba A.A., Plikaytis B.D., Farmer J.J 3rd, 1989, Clonal nature ofSalmonella typhi and its genetic relatedness to other salmonellae as shown by multilocus enzyme electrophoresis, and proposal of Salmonella bongori comb Nov, Journal of Clinical Microbiology, 27, 313– 320 [91] Rossen L., Norskov P., Holmstrom K., Rasmussen O F., 1992, Inhibition of PCR by components of food samples, microbial diagnostic assays and DNAextraction solutions, International Journal of Food Microbiology, 17 (1), pp 37-45 [92] Saulnier P., Andremont A., 1992, Detection of genes in feces by booster polymerase chain reaction, Journal of Clinical Microbiology, 30 (8), pp 2080-2083 [93] Selander R.K., Smith N.H., Li J., Beltran P., Ferris K.E., Kopecko D.J., Rubin F.A., 1992, Molecular evolutionary genetics of the cattle-adapted serovar Salmonella Dublin, Journal of Bacteriology, 174 (11), pp 3587–3592 Trang 90 [94] Shao Y, Zhu S, Jin C, Chen F (2011) Development of multiplex loopmediated isothermal amplification-RFLP (mLAMP-RFLP) to detect Salmonella spp and Shigella spp in milk Int J Food Microbiol 148(2):75–79 [95] Shao Y., Zhu S., Jin C., and Chen F., 2011, Development of multiplex loopmediated isothermal amplifiation-RFLP (mLAMPRFLP) to detect Salmonella spp and Shigella spp in milk, International Journal of Food Microbiology, 148 (2), pp 75–79 [96] Shigeko U and Yoshihiro K., 2009, The rapid detection of Salmonella from Food Samples by Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP), Biocontrol Science, 14 (2), 73- 76 [97] Sifin, 2004, Screening and serotyping of Salmonellae with Test Reagents Based primarily on Monoclonal Antibodies, Institute für Immunpäparate und Nährmedien GmbH Berlin, Germany [98] Siju M.V., Jeena A and Sarita G.B., 2012, Rapid and Sensitivity Detection of Low Number of Salmonella in Water by Loop-Mediated Isothermal Amplification, Adv Bio Tec [99] Silvia H.-L., Raquel R., Margarita A., Rosa D., Angel U M and Echeita M A., 2006, Blind comparison of traditional serotyping with three multiplex PCRs for the identification of Salmonella serotypes, Research onn Microbiology, 158(2), pp.122-127 [100] Sutlovic D., Gamulin S., Definis-Gojanovic M., Gugic D., Andjelinovic S., 2008, Interaction of humic acids with human DNA: proposed mechanisms and kinetics, Electrophoresis, 29 (7), pp 1467-1472 [101] Tang M J., Zhou, S., Zhang, X Y., Pu, J H., Ge, Q L et al, 2011, Rapid and sensitive detection of Listeria monocytogenes by loop-mediated isothermal amplification, Current Microbiology, 63 (6), pp 511-516 [102] Tang T., Cheng A., Wang M., Li X., He Q., Jia R., Zhu D., Chen X., 2012, Development and clinical verification of a loop-mediated isothermal amplification method for detection of Salmonella species in suspect infected ducks, Poultry Science, 91(4), pp 979–986 Trang 91 [103] Teare J M., Islam R , Flanagan R , Gallagher S , Davies M.G and Grabau C., 1997, Measurement of Nucleic Acid Concentrations Using the DyNA Quant and the Gene Quant, BioTechniques, 22, pp 1170-1174 [104] Techathuvanan C., Draughon F.A., D'Souza D.H., 2011, Comparison of reverse transcriptase PCR, reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification, and culture-based assays for Salmonella detection from pork processing environments, Journal of Food Protection , 74(2), pp 294– 301 [105] Techathuvanan C., Frances A D., And Doris H D., 2010, Comparison of Reverse Transcriptase PCR, Reverse Transcriptase Loop-Mediated Isothermal Amplification, and Culture-Based Assays for Salmonella Detection from Pork Processing Environments, Journal of Food Protection, 74(2), pp 294–300 [106] Tourlousse D.M., Ahmad F., Stedtfeld R.D., Seyrig G., Tiedje J.M., Hashsham S.A (2012) A polymer microfluidic chip for quantitative detection of multiple water- and foodborne pathogens using real-time fluorogenic loop-mediated isothermal amplification Biomed Microdevices 14(4), pp 769–778 [107] Ueda S., Kuwabara Y., 2009, The rapid detection of Salmonella from food samples by loop-mediated isothermal amplification (LAMP), Biocontrol Science, 14(2), pp 73–76 [108] Van T.T.1, Moutafis G, Istivan T, Tran LT, Coloe PJ, 2007, Detection of Salmonella spp in Retail Raw Food Samples from Vietnam and Characterization of Their Antibiotic Resistance, Applied and Enviromental Microbiology, 73(21), pp 6885-6890 [109] Van Tongeren S P., Degener, J.E., Harmsen, H.J (2011), Comparison of three rapid and easy bacterial DNA extraction methods for use with quantitative real-time PCR, European Journal of Clinical Microbiology, 30 (9), pp 1053–1061 [110] Vingataramin L., Frost, E H (2015), A single protocol for extraction of gDNA from bacteria and yeast, BioTechniques, 58 (3), pp 120–125 Trang 92 [111] Wang D., Huo, Guicheng, Ren, Daxi, Li, Yonggang (2010), Development and Evaluation of a Loop-Mediated Isothermal Amplification (Lamp) Method for Detecting Listeria monocytogenes in Raw Milk, Journal of Food Safety, 30 (2), pp 251- 262 [112] Wang L., Shi L., Alam M J., Geng Y., and Li L., 2008, Specifi and rapid detection of foodborne Salmonella by loop-mediated isothermal amplifiation method, Food Research International, 41 (1), pp 69–74 [113] Wang X L., Geng, F Z., Zhang, X Z., Wang, Y., Ma, X Y., Su, X D., Tan, J X And Zhang, W (2011), A loop mediated isothermal amplification assay for rapid detection of Listeria monocytogenes, Journal of Food Safety, 31, pp 546–552 [114] Wang Y., Zhang W., Yuan Y., Ma X., Zhang H., Su X., Wang Z., Ma B., 2009, Study on loop-mediated isothermal amplification assay for detection of Salmonella in meat products, 3rd International Conference on Bioinformatics and Biomedical Engineering (ICBBE 2009), pp 1–6 [115] Wang Y-Z, Wang D-G, 2013, Development and evaluation of a loopmediated isothermal amplification (LAMP) method for detecting foodborne Salmonella in raw milk, Advanced Materials Research, 647, pp 577–582 [116] Wilson I G (1997), Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification, Applied Environmental Microbiology, 63 (10), pp 3741-3751 [117] Xiong Z., Zhan, J., Kang M., 2016, Sensitive And Specific Detection Of Foodborne Pathogens In Pork By A Loopmediated Isothermal Amplification Methodology, Acta Medica Mediterranea, 32(1143) [118] Xu X., Wu Q., Zhang J., Zhou Y., Deng M., 2008, Study on a specific detection of Salmonella in foods by dulplex PCR (Chinese), International Journal of Hygiene and Environmental Health, 37, pp 483–486 [119] Yang J.-L., Ma G.-P., Yang R., Yang S.Q., Fu L.Z., Cheng A.C., Wang M.S., Zhang S.H., Shen K.F., Jia R.Y., Deng S.X., Xu Z.Y , 2010, Simple and rapid detection of Salmonella serovar Enteritidis under fild conditions by loopmediated isothermal amplifiation, Journal of Applied Microbiology, 109 (5), pp 1715–1723 Trang 93 [120] Yang Q., Chen S.Y., and Beilei G., 2013, Detecting Salmonella Serovars in Shell Eggs by Loop-Mediated Isothermal Amplification, Journal of Food Protection, 76(10), pp 1790–1796 [121] Yang, Q., Wang, F., Jones, K L., Meng, J., Prinyawiwatkul, W., & Ge, B., 2015, Evaluation of loop-mediated isothermal amplification for the rapid, reliable, and robust detection of Salmonella in produce, Food Microbiology,46,485–493 doi:10.1016/j.fm.2014.09.011 [122] Yin H., Li Q., Liu L., Chen J., Wang L., & Liu Z., 2012, Detection of Salmonella choleraesuis by Loop-mediated Isothermal Amplification, International Conference on Biomedical Engineering and Biotechnology doi:10.1109/icbeb.2012.131 [123] Zhang G., Brown E.W., González-Escalona N., 2011, Comparison of realtime PCR, reverse transcriptase real-time PCR, loop-mediated isothermal amplification, and the FDA conventional microbiological, Applied and Environmental Microbiology, 77 (18), pp 6495 -6501 [124] Zhang L., Pan Z.M., Geng S.Z., Chen X., Liu Z.Y., Zhao F., Jiao X.A., 2012, A loop-mediated isothermal amplification method targets the HisJ gene for the detection of foodborne Salmonella, European Food Research and Technology, 234(6), pp 1055–1062 [125] Zhang T., Wang C., Wei X., Zhao X., and Zhong X., 2012, Loop-Mediated Isothermal Amplification for Detection of Staphylococcus aureus in Dairy Cow Suffering from Mastitis, Journal of Biomedicine and Biotechnology, 435982, doi: 10.1155/2012/435982 [126] Zhongqiang C., Ke Z., Huan Y., Qi L., Lan W., Zhiguo L., 2015, Detection of Salmonella and several common Salmonella serotypes in food by loopmediated isothermal amplification method, Food Science and Human Wellness, 4, pp 75–79 [127] Zhu S.M., Wu J.J., Xu C., Qu J., Cheng W., Chen F.S (2008) Rapid detection of Salmonella spp by loop-mediated isothermal amplification method Mod Food Sci Technol 24(7), pp 725–730 Trang 94 [128] Zhuang L., Gong J., Li Q., C Zhu, Yu Y., Dou X., Liu X., Xu B and Wang C., 2014, Detection of Salmonella spp by a loop-mediate isothermal amplification (LAMP) method targeting bcfD gene, Letter in Applied Microbiology, 59, pp 658- 664 Trang 95 PHỤ LỤC I Kết kiểm tra Salmonella enteritidis ATCC13076 Salmonella typhimurium ATCC 14028 phương pháp nuôi cấy truyền thống TTNC/ STPPVS.01 - tham chiếu TCVN 10780 – : 2017, ISO 6579 – : 2017 Diễn giải kết quả: – – – – – – TSI: Nghiêng đỏ, đáy vàng, H2S (+/-), gas (–/+) Urease (–), không đổi màu môi trường LDC (+), đục tím đậm ban đầu β-galactosidase (–), khơng đổi màu mơi trường VP (–), khơng có màu đỏ hồng xuất Indole (–), vòng màu vàng PL- - PHỤ LỤC II Kết PCR khuếch đại DNA vi khuẩn Salmonella enteritidis ATCC 13076 với cặp mồi S139/S141 Chú thích: Giếng (1): mẫu âm; Giếng (2): Escherichia coli ATCC 25922, Giếng (3): Listeria monocytogenes ATCC1911, Giếng (4): Staphylococcus aureus ATCC 6538; Giếng (5): Salmonella enteritidis ATCC 13076; M: Ladder PL- - PHỤ LỤC III Kết PCR khuếch đại DNA serotype vi khuẩn Salmonella spp với cặp mồi S139/S141 Chú thích: Giếng (1): mẫu âm; Giếng (2): Salmonella enterica subsp enterica derived from ATCC® 51741™*; Giếng (3): Salmonella enterica subsp enterica serovar Abaetetuba derived from Silliker®SLR156; Giếng (4): Salmonella enterica subsp enterica serovar Abony derived from NCTC 6017; Giếng (5): Salmonella enterica subsp enterica serovar Anatum derived from ATCC® 9270™*; Giếng (6): Salmonella enterica subsp enterica serovar Choleraesuis derived from ATCC® 10708™*; Giếng (7): Salmonella enterica subsp enterica serovar Choleraesuis derived from ATCC® 7001™*; Giếng (8): Salmonella enterica subsp enterica serovar Paratyphi B derived from ATCC® 8759™*; Giếng (9): Salmonella enterica subsp Enterica serovar Poona derived from NCTC 4840; Giếng (10): Salmonella enterica subsp Enterica serovar Pullorum derived from ATCC® 13036™*; Giếng (11):Salmonella enterica subsp enterica serovar Typhimurium derived from ATCC® 25241™* PL- - PHỤ LỤC IV Kết phân tích 50 mẫu gây nhiễm nồng độ khác để xác định LOD50 mẫu thịt heo tươi rau LAMP real-time PCR Thịt Rau Thịt Rau PL- - PHỤ LỤC V Kết phân tích Salmonella mẫu thịt heo tươi rau phương pháp LAMP để xác định thông số kỹ thuật phương pháp PL- - PHỤ LỤC VI So sánh kết phân tích Salmonella mẫu thực phẩm (rau, thịt heo tươi) phương pháp LAMP phương pháp real-time PCR Nền mẫu Rau Tên mẫu R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11 R12 R13 R14 R15 R16 R17 R18 R19 R20 R21 R22 R23 R24 R25 Mẫu không gây nhiễm Real-time PCR - LAMP + - Mẫu gây nhiễm (5-10 CFU/25g) Real-time PCR LAMP + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + PL- - Nền mẫu Thịt heo tươi Tên mẫu T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 T13 T14 T15 T16 T17 T18 T19 T20 T21 T22 T23 T24 T25 Mẫu không gây nhiễm Real-time PCR - LAMP + - Mẫu gây nhiễm (5-10 CFU/25g) Real-time PCR LAMP + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + PL- - PHỤ LỤC VII TÊN VÀ THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU Môi trường Buffered Peptone Water (BPW): Proteose peptone (10g/l); Natri clorua (5g/l); Disodium phosphate Na2HPO4 (3,5g/l); Monopotassium phosphate KH2PO4 (1,5g/l); pH 7.2 ± 0,2 Môi trường Rappaport Vassiliadis Salmonella Enrichment Broth (RVS): Magensium chloride (hexahydrate) (29g/l); Sodium chloride (8g/l); Soya peptone (4,5g/l); Potassium phosphate, monobasic (0,6g/l); Dipotassium phosphate (0,4g/l); Malachite green (0,4 g/l) Môi trường Nutrient Agar (NA): Extract yeast (3g/l); Peptone (5 g/l); Agar (15g/l) PL -10- PHỤ LỤC VIII PL -10-