TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 12371-1:2019 QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH VI KHUẨN, VIRUS, PHYTOPLASMA GÂY BỆNH THỰC VẬT PHẦN 1: YÊU CẦU CHUNG Procedure for identification of plant disease caused by bacteria, virus, phytoplasma Part 1:General requirements Lời nói đầu TCVN 12371-1:2019 Cục Bảo vệ thực vật biên soạn, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố Bộ TCVN 12371 Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytolasma gây bệnh thực vật gồm phần sau: Phần 1: Yêu cầu chung Phần 2-1 : Yêu cầu cụ thể Plum pox virus Phần 2-2 : Yêu cầu cụ thể vi khuẩn Xylella fastidiosa Wells et al Phần 2-3 : Yêu cầu cụ thể vi khuẩn Clavibacter michiganensis subsp michiganensis (Smith) Davis et al QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH VI KHUẨN, VIRUS, PHYTOPLASMA GÂY BỆNH THỰC VẬT PHẦN 1: YÊU CẦU CHUNG Procedure for identification of plant disease caused by bacteria, virus, phytoplasma Part 1: General requirements Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định kĩ thuật chung quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật Tài liệu viện dẫn Tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm cơng bố áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn khơng ghi năm cơng bố áp dụng phiên nhất, bao gồm phiên sửa đổi, bổ sung (nếu có) TCVN 8597: 2010, Kiểm dịch thực vật - Phương pháp luận việc lấy mẫu chuyến hàng Dụng cụ, thiết bị Sử dụng thiết bị, dụng cụ thơng thường phịng thử nghiệm thiết bị sau: 3.1 Túi lấy mẫu 3.2 Tủ lạnh: nhiệt độ từ °C đến °C 3.3 Giấy 3.4 Bìa tơng 3.5 Kẹp ép mẫu thực vật 3.6 Tủ lưu trữ mẫu: có khả trì nhiệt độ ẩm độ thấp 3.7 Hộp lưu trữ mẫu 3.8 Lọ đựng mẫu: vật liệu trơ với hóa chất, suốt, có nắp kín 3.9 Hộp chứa mẫu: Kín khí, có nắp đậy 3.10 Tủ lạnh sâu: nhiệt độ từ âm 80 °C đến âm 20 °C 3.11 Đèn cồn 3.12 Hộp petri 3.13 Que cấy thẳng, que cấy vòng 3.14 Pipette 3.15 Bản giếng ELISA 3.16 Túi ni-lông: vô trùng 3.17 Giấy thấm 3.18 Ống eppendorf 3.19 Bể ổn nhiệt 3.20 Chày, cối: sứ nhựa 3.21 Máy chu trình nhiệt (PCR) 3.22 Kính hiển vi: có độ phóng đại 40 lần đến 000 lần Hóa chất Chỉ sử dụng hóa chất loại tinh khiết phân tích, trừ có quy định khác 4.1 Silicagel 4.2 Nước cất 4.3 Glycerol (C3H8O3) 4.4 Cồn (C2H5OH): 70 % 90 % 4.5 Parafin 4.6 Dung dịch Natri hypoclorit (NaOCl) 10 % 4.7 Tím kết tinh (Crystal violet) % 4.8 Dung dịch Lugol’s iodine 4.9 Dung dịch Safranin O 0,5 % 4.10 Dung dịch KOH % 4.11 CTAB 4.12 Natri carbonat (Na2CO3) 4.13 Lab- Lemco Powder 4.14 Dung dịch axit sunfuric H2SO4 10 % 4.15 Đồng sunfat CuSO4 4.16 axit sunfuro H2SO3 4.17 Fomalin CH2O 4.18 mercaptoethanol HOCH2CH2SH 4.19 Chloroform: isoamyl alcohol (24:1) 4.20 Isopropanol C3H8O 4.21 TE 4.22 Agarose 4.23 Natri bicarbonate NaHCO3 4.24 Natri azua NaN3 4.25 Natri clorit NaCl 4.26 Natri hydro phosphate Na2HPO4 4.27 Kali biphosphate KH2PO4 4.28 Kali Clorua KCl 4.29 Tween-20 4.30 Magie Clorua MgCl2 6H2O 4.31 Diethanolamine HN(CH2CH2OH)2 4.32 Yeast extract 4.33 Peptone 4.34 Agar 4.35 Kali hydro phosphate K2HPO4 4.36 Magie Suntat MgSO4 7H2O 4.37 Bacteriological agar 4.38 Nước cất vô trùng Lấy mẫu bảo quản mẫu 5.1 Lấy mẫu 5.1.1 Đối với trồng đồng ruộng - Diện tích điều tra: phụ thuộc vào loại trồng, điều kiện cụ thể vùng điều tra mục đích điều tra - Chọn điểm điều tra: Có thể chọn điểm điều tra theo số phương pháp sau + Chọn điểm theo đường chéo góc + Chọn điểm theo bàn cờ + Chọn điểm hình rẻ quạt + Chọn điểm ngẫu nhiên + Điều tra toàn ruộng theo băng Tại ruộng điều tra, điều tra toàn ruộng theo phương pháp chiếu theo băng Mỗi ruộng chia làm băng nhỏ, băng có chiều rộng m, điều tra từ đầu tới cuối băng kiểm tra toàn trồng băng điều tra - Số lượng mẫu: số lượng mẫu phụ thuộc vào mục đích điều tra phương pháp lấy mẫu + Cây ăn quả, lâu năm, công nghiệp: số lượng điều tra điểm tối thiểu từ đến + Cây hàng năm, rau màu, ngắn ngày: điểm có diện tích tối thiểu m 5.1.2 Đối với hàng hóa xuất, nhập khẩu, cảnh vận chuyển, bảo quản nước Lấy mẫu theo TCVN 8597:2010 5.2 Bảo quản mẫu 5.2.1 Mẫu nghi nhiễm vi khuẩn 5.2.1.1 Mẫu phận tươi Các phận tươi nghi nhiễm vi khuẩn gây hại thực vật chứa túi lấy mẫu (3.1) bảo quản tủ lạnh (3.2) nhiệt độ từ °C đến °C Các mẫu tươi sau giám định gửi giám định xử lý phương pháp sau Ép khô Bộ phận nhiễm bệnh ép khô cách đặt lớp giấy (3.3) thường từ đến tờ Các lớp giấy (3.3) (có chứa mẫu) đặt miếng bìa tơng đặt vào kẹp ép mẫu thực vật (3.5) sau đỏ nén chặt dây vật nặng Trong trình làm khô mẫu giấy (3.3) nên thay thường xuyên khoảng lần/ngày Kẹp ép mẫu thực vật (3.5) (có chứa mẫu) phơi nắng, để phịng có điều hòa máy sưởi để tăng hiệu làm khơ mẫu Thời gian làm khơ mẫu hồn tồn thơng thường từ đến 10 ngày Mẫu đạt tiêu chuẩn mẫu khơng bị mốc, khơ hồn tồn, không bị gập gãy nhăn nheo Các mẫu vật sau ép khô đặt túi lấy mẫu (3.1) vơ trùng, bên ngồi đề rõ thơng tin liên quan như: ngày, tháng lấy mẫu, thông tin kí chủ, thơng tin bệnh hại (hoặc nghi ngờ loại bệnh hại), địa điểm (hoặc lô hàng lấy mẫu) Các túi lấy mẫu (3.1) giấy lưu trữ tủ lưu trữ mẫu (3.6) (hoặc hộp lưu trữ mẫu (3.7)) có độ ẩm thấp (có thể sử dụng vật liệu chống ẩm Silicagel (4.1) ) Ngâm mẫu Bộ phận nhiễm bệnh rửa nhẹ vịi nước chảy sau rửa lại nước cất vơ trùng (4.38) Mẫu để chỗ thống để bề mặt khơ hồn tồn Có thể ngâm mẫu vào dung dịch H2SO410 % (4.14) bổ sung thêm từ đến giọt glycerol (4.3) từ đến giọt cồn 90 % (4.4) vòng 24 Vớt mẫu vật ra, rửa nước lạnh Chuyển mẫu vào lọ đựng mẫu có chứa dung dịch bảo quản (Xem phụ lục C) đậy chặt nắp Thay dung dịch bảo quản thấy tượng dung dịch bị vẩn đục (hoặc tháng lần) dung dịch bảo quản khơng bị vẩn đục gắn chặt lọ mẫu parafin (4.5) Dán nhãn bên lọ đựng mẫu ghi rõ thông tin liên quan như: ngày, tháng lấy mẫu; thơng tin kí chủ; thơng tin bệnh hại (hoặc nghi ngờ loại bệnh hại); địa điểm (hoặc lô hàng lấy mẫu) 5.2.1.2 Mẫu sản phẩm khô Mau để túi chứa mẫu (3.1) hộp chứa mẫu (3.9) kín có nhãn bảo quản nhiệt độ phòng 5.2.2 Mẫu nghi nhiễm virus, phytoplasma 5.2.2.1 Mẫu phận tươi Các phận tươi chứa túi chứa mẫu bảo quản tủ lạnh sâu (3.10) nhiệt độ âm 80 °C Các mẫu tươi sau giám định mẫu gửi giám định làm mẫu khô để bảo quản theo phương pháp sau: Làm mẫu khô - Bộ phận nhiễm bệnh (lá cành) đặt túi chứa mẫu có chứa Silicagel (4.1) (Chú ý thay Silicagel (4.1) phần cũ hút ẩm tối đa) - Mẫu đạt tiêu chuẩn mẫu khơng bị mốc, khơ hồn tồn, khơng bị gập gãy nhăn nheo - Các mẫu vật sau ép khô đặt túi chứa mẫu giấy bên ngồi đề rõ thơng tin liên quan như: ngày, tháng lấy mẫu; thơng tin kí chủ; thơng tin bệnh hại (hoặc nghi ngờ loại bệnh hại); địa điểm (hoặc lô hàng lấy mẫu) - Các túi lấy mẫu (3.1) giấy lưu trữ tủ lưu trữ mẫu (3.6) (hoặc hộp (3.7)) có độ ẩm thấp (có thể sử dụng vật liệu chống ẩm silicagel (4.1) ) 5.2.2.2 Mẫu sản phẩm khô Mẫu để túi chứa mẫu (3.1) hộp chứa mẫu (3.9) kín có nhãn bảo quản nhiệt độ phòng Phát bệnh Phát thu thập mẫu bệnh dựa vào số đặc tính sinh học quan trọng lồi dịch hại phân bố, ký chủ triệu chứng hại, - Phân bổ: Mỗi loài vi khuẩn virus phytoplasma có khả tồn gây hại vùng có điều kiện khí hậu phù hợp cho sinh trưởng, phát triển lồi - Ký chủ: Mỗi lồi vi khuẩn virus phytoplasma có khả gây hại cho phổ ký chủ - Triệu chứng bệnh: Triệu chứng vi khuẩn virus phytoplasma gây hại thực vật thường đặc trưng khác tùy thuộc vào loài vi khuẩn virus phytoplasma, loài ký chủ, phận bị hại giai đoạn hại Giám định bệnh 7.1 Giám định vi khuẩn gây bệnh thực vật Có thể áp dụng phương pháp sau tùy thuộc vào loài vi khuẩn cụ thể 7.1.1 Giám định phương pháp hình thái kết hợp với phản ứng sinh hóa 7.1.1.1 Phân lập ni cấy làm môi trường nhân tạo Bước 1: Khử trùng bề mặt mẫu bệnh Phần mô nghi nhiễm bệnh (cành, thân, ) rửa vòi nước chảy Khử trùng bề mặt cách ngâm mẫu dung dịch Natri hypoclorit 10 % (4.6) phút cồn 70 % (4.4) từ 30 giây đến 60 giây sau rửa lại lần nước cất vô trùng (4.38) Với mô gỗ khử trùng cách nhúng cồn 70 % (4.4) hơ qua lửa đèn cồn (3.11) Bước 2: Tách chiết vi khuẩn Có thể tách chiết vi khuẩn từ mơ cây, hạt nghi bị bệnh biện pháp: - Ngâm mẫu nước cất vô trùng (4.38) - Nghiền mẫu nước cất vô trùng (4.38) dịch chiết Bước 3: Phân lập Trang dịch chiết môi trường đặc hiệu (Xem phụ lục B) Đặt đĩa petri (3.12) nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn phát triển Bước 4: Nuôi cấy làm Chọn khuẩn lạc có hình thái phù hợp với mơ tả hình thái khuẩn lạc vi khuẩn nghi ngờ gây bệnh cấy truyền môi trường đặc hiệu 7.1.1.2 Phản ứng nhuộm Gram Có thể dùng hai phương pháp sau: Phương pháp Bước 1: Dùng que cấy vơ trùng lấy khuẩn lạc từ bước điều 7.1.1.1 hoà vào giọt nước cất (4.2) lam kính, làm khơ khơng khí Thông thường khuẩn lạc lấy sau cấy 24 Bước 2: Cố định tế bào cách hơ nhanh vết bôi lửa đèn cồn đến lần Bước 3: Nhuộm dung dịch Tím kết tinh (Crystal violet) 0,5 % (4.7) 30 giây, rửa nước, thấm khô Bước 4: Nhuộm lại dung dịch Lugol's iodine (4.8) 30 giây, rửa nước, thấm khô Bước 5: Nhỏ cồn 70 % (4.4), giữ khoảng 30 giây (cho đến vừa thấy màu), rửa nước, thấm khô Bước 6: Nhuộm bổ sung dung dịch Safranin O 0,5 % (4.9) đến phút, rửa nước, để khơ khơng khí Bước 7: Quan sát kính hiển vi (4.21) vật kính có độ phóng đại 000 lần Đọc kết quả: Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím Vi khuẩn Gram (-) bắt màu đỏ Phương pháp Bước 1: Dùng pipette (3.14) nhỏ giọt KOH % (4.10) lên lam kính Bước 2: Sử dụng que cấy vịng (3.13) lấy khuẩn từ mơi trường (xem 7.2) nuôi cấy trộn với dung dịch KOH % (4.10) tới tạo huyền phù Bước 3: Nhấc que cấy lên khỏi giọt dịch khoảng mm đến 20mm Đọc kết quả: Vi khuẩn Gram (-) có đám nhầy (dạng sợi) kéo theo que cấy Vi khuẩn Gram (+) khơng có đám nhầy (dạng sợi) kéo theo que cấy CHÚ THÍCH: Đây phản ứng sinh hóa chung giám định vi khuẩn phản ứng sinh hóa Tùy lồi vi khuẩn mà phản ứng sinh hóa để giám định khác Bộ phản ứng sinh hóa lồi vi khuẩn cụ thể nêu tiêu chuẩn cụ thể dành riêng cho loài 7.1.2 Giám định ELISA 7.1.2.1 Phân lập nuôi cấy làm môi trường nhân tạo Thực theo điều 7.1.1.1 7.1.2.2 Chuẩn bị dịch mẫu Có thể chuẩn bị dịch mẫu từ mơ bệnh từ khuẩn lạc nuôi cấy làm vi khuẩn - Mẫu mô (quả, thân, lá): lấy mẫu nhỏ mô (quả thân lá) ngâm ml nước cất (4.2) khoảng 15 phút đến 20 phút Sau nước chứa vi khuẩn ly tâm 13 000 vòng/phút phút thu kết tủa vi khuẩn Hoà tan kết tủa vi khuẩn thu 1ml dung dịch đệm chiết mẫu (xem phụ lục A) - Khuẩn lạc nuôi cấy làm vi khuẩn: Hoà tan phần khuẩn lạc (xem 7.1.2.1) 1ml dung dịch đệm chiết mẫu (xem phụ lục A) 7.1.2.3 Quy trình thực ELISA Có thể sử dụng kít ELISA thương mại làm theo phương pháp sau: Bước 1: Nhỏ vào giếng ELISA (3.15) 100 µl dịch mẫu Bước 2: Bọc giếng túi ni-lông (3.16) ủ 37 °C qua đêm (khoảng đến giờ) Bước 3: Sau đó, nhỏ thêm vào giếng 200 µl dung dịch đệm cố định mẫu (xem phụ lục A) Bước 4: Bọc giếng túi ni-lơng (3.16) ủ 30 phút nhiệt độ phịng Bước 5: Rửa giếng đệm rửa (xem phụ lục A) ba lần sau loại đệm rửa cách vỗ nhẹ giếng giấy thấm Bước 6: Thêm vào giếng 100 µl kháng thể Bước 7: Bọc giếng túi ni-lông (3.16) ủ nhiệt độ phòng Bước 8: Rửa giếng đệm rửa tám lần sau loại đệm rửa cách vỗ nhẹ giếng giấy thẩm Bước 9: Thêm vào giếng 100 µl Enzym gắn Bước 10: Bọc giếng túi ni-lông (3.16) ủ nhiệt độ phòng Bước 11: Rửa giếng đệm rửa tám lần sau loại đệm rửa cách vỗ nhẹ giếng giấy thấm Bước 12: Thêm vào giếng 100 µl đệm chất (xem phụ lục A) Ủ nhiệt độ phòng 7.1.2.4 Đọc kết Đọc kết mắt thường máy đọc bước sóng 405 nm 7.1.3 Giám định PCR 7.1.3.1 Phân lập nuôi cấy làm môi trường nhân tạo Thực theo điều 7.1.1.1 7.1.3.2 Tách chiết DNA Có thể tách chiết DNA từ mô bệnh từ khuẩn lạc nuôi cấy làm vi khuẩn - Khuẩn lạc nuôi cấy làm vi khuẩn: Dùng que cấy vi khuẩn (3.13) lấy khuẩn lạc môi trường (xem 7.1.1) cho vào ống eppendof (3.18) chứa 100µl nước cất vơ trùng khuấy (4.38) để hồ tan khuẩn lạc Tiếp theo để ống eppendof (3.18) nhiệt độ 95 °C 15 phút bể ổn nhiệt (3.19) sau đặt lên đá lạnh Ly tâm dịch vi khuẩn đến 10 giây - Mẫu mơ (quả, thân, lá): Cho 100 µl dịch chiết vi khuẩn (xem bước điều 7.1.1) vào ống eppendof (3.18) để nhiệt độ 95 °C 15 phút bể ổn nhiệt (3.11) sau đặt lên đá lạnh Tiếp theo, ly tâm dịch chiết đến 10 giây - Tách chiết CTAB (với mô nghi nhiễm bệnh) Bước 1: Nghiền nhỏ từ 0,5 g đến g mô nghi nhiễm bệnh cối chày sứ (3.20) 5ml CTAB (4.11) có chứa % mercaptoethanol (4.18) Bước 2: Lấy ml dịch nghiền vào ống eppendof (3.18) Bước 3: Ủ 65 °C 30 phút Bước 4: Ly tâm 10 phút tốc độ 12 000 vòng/phút Bước 5: Thu dịch phía sang ống eppendof (3.18) đo lượng dịch Bước 6: Thêm vào ống eppendof (3.18) lượng dịch chloroform (CHCl3):isoamyl alcohol (24:1) (4.19) lượng dịch thu bước 4, lắc Bước 7: Ly tâm 10 phút tốc độ 12 000 vòng/phút Bước 8: Thu dịch phía sang ống eppendof (3.18) mới, đo lượng dịch Bước 9: Thêm vào ống lượng dịch isopropanol (4.20) 0,7 dịch thu bước Lắc nhẹ, để tủa vòng 20 phút (nhiệt độ âm 20 °C) Bước 10: Ly tâm tốc độ 12 000 vòng/phút 20 phút, loại bỏ phần dịch phía Bước 11: Rửa kết tủa DNA lần cồn 70 % (4.4) Bước 12: Hòa tan kết tủa DNA TE (4.21), pH 8.0 7.1.3.3 Nhân gen RNA thu tiến hành nhân gen máy chu trình nhiệt (PCR) (3.21) Sử dụng đoạn mồi đặc hiệu 7.1.3.4 Đọc kết Sản phẩm điện di gel agarose(4.21) Mẫu dương tính cho đoạn gen kích thước hướng dẫn 7.2 Giám định virus, phytoplasma phương pháp RT-PCR 7.2.1 Tách chiết RNA Có nhiều phương pháp tách chiết RNA khác nhau, tùy vào điều kiện phịng thí nghiệm áp dụng cách tách chiết khác Sau số cách tách chiết phổ biến áp dụng - Tách chiết CTAB (với mô nghi nhiễm bệnh) Bước 1: Nghiền nhỏ 200 mg mô nghi nhiễm bệnh cối chày Bước 2: Chuyển phần mô nghiền vào ống eppendof (3.18) thêm vào 500 µl dịch chiết CTAB (4.11) bổ sung % mercaptoethanol (4.18) Bước 3: Ủ 65 °C 30 phút Bước 4: Ly tâm 10 phút tốc độ 12000 vịng/phút Bước 5: Thu dịch phía sang ống eppendof (3.18) đo lượng dịch Bước 6: Thêm vào ống lượng dịch chloroform: isoamyl alcohol(24:1) (4.19) gấp đôi lượng dịch thu bước 4, lắc Bước 7: Ly tâm 10 phút tốc độ 12 000 vịng/phút Bước 8: Thu dịch phía sang ống eppendof (3.18) mới, đo lượng dịch Bước 9: Thêm vào ống lượng dịch isopropanol (4.20) 2/3 dịch thu bước Lắc nhẹ để tủa vòng (nhiệt độ âm 20 °C) Bước 10: Ly tâm tốc độ 12 000 vòng/phút 10 phút, loại bỏ phần dịch phía Bước 11: Rửa tủa lần cồn 70 % (4.4) Bước 12: Hòa tan tủa TE (4.21), pH 8.0 - Tách kít (ví dụ cụ thể hãng QIAGEN) Bước 1: Thêm 10 µl 2-mercaptoethanol vào ml dịch chiết RLT Bước 2: Thêm 450 µl dịch chiết bước vào 0,1 g mẫu tươi 0,02 g mẫu đông lạnh Bước 3: nghiền nhỏ mẫu Bước 4: Chuyển dịch nghiền mẫu vào ống ly tâm màu tím (được đặt ống ly tâm ml) Bước 5: Ly tâm 13 000 vịng/phút phút Bước 6: Chuyển dịch phía ống sang ống (không lấy phần cặn ly tâm) Bước 7: Chuyển phần dịch thu bước sang cột ly tâm màu hồng (đặt ống ly tâm 2ml) Bước 8: Ly tâm 10 000 vòng/phút 15 giây Bước 9: Loại bỏ dịch ống ml Bước 10: Thêm vào cột ly tâm màu hồng 700 µl đệm RW1 Bước 11: Ly tâm 10 000 vòng/phút 15 giây Bước 12: Loại bỏ dịch ống ml Bước 13: Ly tâm 10 000 vòng/phút phút Bước 14: Đặt cột ly tâm màu hồng vào ống ly tâm 1,5 ml Bước 15: Thêm 30 µl Rnase-free water vào cột ly tâm màu hồng Bước 13: Ly tâm 10 000 vòng/phút phút 7.2.2 Nhân gen Nhân gen máy chu trình nhiệt PCR (3.21) Sử dụng đoạn mồi đặc hiệu Chu trình nhiệt thiết kế dựa theo trình tự mồi 7.2.3 Đọc kết Sản phẩm điện di gel agarose (4.21) Mẫu dương tính cho đoạn gen kích thước hướng dẫn Báo cáo Nội dung phiếu kết giám định gồm thông tin sau: - Thông tin mẫu giám định - Tên loài - Phương pháp giám định - Người giám định/cơ quan giám định Phụ lục B (Quy định) Chuẩn bị điều chế môi trường nhân tạo B.1 Hấp, sấy khử trùng B.1.1 Sấy khử trùng Dùng phương pháp để khử trùng hộp lồng dụng cụ thủy tinh Dụng cụ phải rửa gói riêng rẽ giấy nhơm đặt vào hộp chất liệu phù hợp để sấy Tránh khơng nên sử dụng giấy để gói làm dính kết vào dụng cụ gây cháy trình sấy Dụng cụ thủy tinh sấy tủ sấy khơng khí nóng, đồ sấy khơng nên xếp q chật để đảm bảo khơng khí nóng đối lưu, khí nóng phải đảm bảo tiếp xúc tất phần dụng cụ để trình sấy đạt hiệu tốt Có thể sử dụng nhiệt độ cách sấy sau: Nhiệt độ Thời gian 120 °C 140 °C 160 °C 180 °C 20 phút B.1.2 Hấp khử trùng nồi hấp Dùng phương pháp để khử trùng môi trường nhân tạo Các nồi hấp vô trùng tự động (autoclave) nồi áp suất sử dụng để hấp vơ trùng Các môi trường nhân tạo sau điều chế đựng bình thủy tinh có nắp Các bình đặt lồng, hộp nồi hấp vô trùng đặt vào nồi hấp Không nên để nghiêng hay rót mơi trường q đầy tránh làm trào mơi trường q trình khử trùng Khơng nên xếp chồng chéo đầy ảnh hưởng tới luồng khơng khí đối lưu nồi hấp Hấp khử trùng thường nhiệt độ 121 °C thời gian 30 phút Khi vận hành nồi hấp vô trùng kiểu (autoclave) hay kiểu cũ cần giám sát cẩn thận tuân thủ hướng dẫn sử dụng máy B.2 Điều chế môi trường nhân tạo B.2.1 Môi trường Nutrient agar Thành phần Lab- Lemco Powder (4.13) 1g Yeast extract (4.32) 2g Peptone (4.33) 5g NaCl (4.25) 5g Agar (4.34) 15g Nước cất (4.2) 000 ml Phương pháp điều chế: Hòa tan thành phần theo thứ tự vào nước cất, chỉnh pH 7,2 đến 7,4 Hấp khử trùng (xem B.1.2) B.2.2 Môi trường King’ B Thành phần Peptone (4.33) 20 g Glycerol (4.3) 10 ml K2HPO4 (4.13) 1,5 g MgSO4 H2O (4.36) 1,5 g Bacteriological agar (4.37) 15 g Nước cất (4.2) 000 ml Phương pháp điều chế: Hòa tan thành phần theo thứ tự vào nước cất chỉnh pH tới 7,2 ± 0,2 Hấp khử trùng (xem B.1.2) CHÚ THÍCH: Hiện nay, thị trường có nhiều loại mơi trường nhân tạo để ni vi khuẩn mua loại mơi trường sau điều chế theo hướng dẫn nhà sản xuất tự điều chế theo phương pháp nêu Phụ lục C (Quy định) Dung dịch bảo quản mẫu Có thể sử dụng dung dịch bảo quản sau: Dung dịch 1: CuSO4 (4.15) 85 g H2SO3 (4.16) 28,4 ml Nước (4.2) 485 ml H2SO3 (4.16) 284 ml Nước (4.2) 785 ml Muối bão hòa 000 ml Fomalin (4.17) 500 ml Nước (4.2) 870 ml Fomalin (4.17) 450 ml Cồn 70 % (4.4) 540 ml Nước (4.2) 810 ml Dung dịch 2: Dung dịch 2: Dung dịch 3: Cách pha dung dịch muối bão hòa: Hòa tan muối nước nóng đến mức độ bão hịa Để dung dịch nguội Lọc bỏ phần không tan hết Thư mục tài liệu tham khảo [1] Bradbury J F,1986 Guide to Plant Pathogenic Bacteria, C.A.B International, United Kingdom [2] Commonwealth Mycologycal Institute, (1983), Plant Pathologist's Pocketbook [3] IPPC, (2006), ISPM 27 Diagnostic protocols for regulated pests [4] Viện Bảo vệ thực vật, (1997), Tập 1: Phương pháp điều tra dịch hại nông nghiệp thiên địch chúng, Phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật, NXB Nông nghiệp [5] QCVN 01-175:2014 Lưu giữ, bảo quản vận chuyển mẫu kiểm dịch thực vật ... tối thiểu m 5.1.2 Đối với hàng hóa xuất, nhập khẩu, cảnh vận chuyển, bảo quản nước Lấy mẫu theo TCVN 8597:2010 5.2 Bảo quản mẫu 5.2.1 Mẫu nghi nhiễm vi khuẩn 5.2.1.1 Mẫu phận tươi Các phận tươi