Xây dựng quy trình định lượng các chất chuyển hóa dialkyl phosphat của thuốc trừ sâu phosphor hữu cơ trong nước tiểu bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯƠNG NHẬT KHÁNH XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHẤT CHUYỂN HÓA DIALKYL PHOSPHAT CỦA THUỐC TRỪ SÂU PHOSPHOR HỮU CƠ TRONG NƯỚC TIỂU BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯƠNG NHẬT KHÁNH XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHẤT CHUYỂN HĨA DIALKYL PHOSPHAT CỦA THUỐC TRỪ SÂU PHOSPHOR HỮU CƠ TRONG NƯỚC TIỂU BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ Chuyên ngành: Kiểm nghiệm Thuốc – Độc chất Mã số: 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Hướng dẫn khoa học: TS NGÔ KIẾN ĐỨC GS.TS NGUYỄN ĐỨC TUẤN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn riêng tơi, tơi nghiên cứu Các số liệu thu thập trực tiếp từ khảo sát kết nghiên cứu luận văn hoàn toàn trung thực Trong q trình viết có tham khảo số tài liệu có nguồn gốc rõ ràng thực trích dẫn theo quy định Tác giả luận văn Trương Nhật Khánh Luận văn Thạc sĩ – Khóa: 2020 – 2022 Ngành: Kiểm nghiệm Thuốc - Độc chất – Mã số: 8720210 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHẤT CHUYỂN HĨA DIALKYL PHOSPHAT CỦA THUỐC TRỪ SÂU PHOSPHO HỮU CƠ TRONG NƯỚC TIỂU BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ Trương Nhật Khánh Người hướng dẫn: TS Ngô Kiến Đức - GS.TS Nguyễn Đức Tuấn Từ khóa: Dialkyl phosphat, DMP, DEP, DMTP, DETP, DMDTP, DEDTP, nước tiểu người, LC – MS/MS Mở đầu: Phơi nhiễm thuốc trừ sâu (TTS) vấn đề quan tâm hàng đầu Việt Nam Phơi nhiễm thường xuyên với TTS đặc biệt nhóm phosphor hữu dẫn đến nguy lớn gây ung thư bệnh lý liên quan Mục tiêu: Xây dựng quy trình định lượng chất chuyển hóa DMP, DEP, DMTP, DETP, DMDTP DEDTP nước tiểu người kỹ thuật LC-MS/MS Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu tiến hành mẫu nước tiểu giả lập chứa chất phân tích chuẩn nội Thơng qua việc khảo sát điều kiện khối phổ, điều kiện sắc ký, chuẩn nội phương pháp xử lý mẫu để chọn điều kiện phân tích thích hợp Quy trình phân tích sau thẩm định theo hướng dẫn FDA EMA hành, áp dụng để định lượng chất phân tích mẫu nước tiểu người nông dân xã thuộc huyện An Phú Phú Tân, tỉnh An Giang Kết quả: Chất phân tích chuẩn nội fosfomycin ghi phổ với kỹ thuật MRM, chế độ ion hóa APCI (-) Nước tiểu xử lý cách pha loãng với NH3 10% theo tỷ lệ 1:1 Điều kiện sắc ký gồm cột Inertsustain C18 (150 x 4,6 mm; µm), pha động methanol – nước (25:75, tt/tt), tốc độ dòng 0,5 ml/phút Độ tuyến tính DMP, DEP, DMTP, DETP, DMDTP, DEDTP 5,29 – 1000,58 ng/ml, 5,10 – 1000,19 ng/ml, 5,10 – 1000,20 ng/ml, 5,06 – 1000,11 ng/ml, 5,06 – 1000,11 ng/ml, 5,30 – 1000,60 ng/ml, 5,06 – 1000,12 ng/ml Các tiêu thẩm định độ đặc hiệu, độ đúng, độ xác, ảnh hưởng mẫu, lượng mẫu tồn dư, độ pha loãng độ ổn định cho kết nằm giới hạn cho phép Kết định lượng 383 mẫu nước tiểu thu thập người nông dân phun thuốc trừ sâu cho thấy có mẫu khơng phát chất phân tích Kết luận: Đã xây dựng quy trình định lượng đồng thời DMP, DEP, DMTP, DETP, DMDTP, DEDTP nước tiểu kỹ thuật LC–MS/MS với độ nhạy, độ đặc hiệu độ xác cao Quy trình ứng dụng để xác định chất phân tích mẫu nước tiểu người nơng dân phun thuốc trừ sâu Master’s Thesis – Academic course: 2020 - 2022 Specialty: Drug Quality Control & Toxicology – Code: 8720210 DEVELOPMENT OF LC–MS/MS METHOD FOR DETERMINATION OF DIALKYL PHOSPHATE METABOLITES OF ORGANOPHOSPHORUS PESTICIDES IN URINE Truong Nhat Khanh Supervisor: Dr Ngo Kien Duc, Prof Dr Nguyen Duc Tuan Keywwords: Dialkyl phosphate, DMP, DEP, DMTP, DETP, DMDTP, DEDTP, human urine, LC – MS/MS Introduction: Exposure to pesticides is one of top concerns in Vietnam Regular exposure to pesticides, especially organophosphorus groups, leads to huge health risks such as cancer and related diseases Objectives: Developing a procedure for the quantification of DMP, DEP, DMTP, DETP, DMDTP and DEDTP metabolites in human urine by LC-MS/MS Methods: The study was performed on simulated urine samples containing analytes and internal standard The conditions of mass spectrometry, chromatography and internal standards, sample preparation methods were investigated to select the appropriate analytical conditions After being validated according to current FDA and EMA guidelines, the analytical procedure was applied to quantify the analytes in urine samples of farmers in An Phu and Phu Tan districts of the An Giang province Results: Analytes and internal standard (FOS) were ionized using negative ion atmospheric pressure chemical ionization source (Ni-APCI) They were detected by multi-reaction monitoring (MRM) mode to obtain molecular and fragment ions for quantification Molecular ions and fragmented ions for quantification were consistent with the standard spectrum Urine samples were treated by dilution method at a ratio of 1:1 with NH 10% Chromatographic conditions used were Inertsustain C18 column (150 x 4.6 mm; µm), mobile phase: methanol/water (25/75, v/v), flow rate: 0.5 ml/min The linear range of DMP, DEP, DMTP, DETP, DMDTP, DEDTP were 5.29 – 1000.58 ng/ml, 5.10 – 1000.19 ng/ml, 5.10 – 1000.20, 5.06 – 1000.11, 5.06 – 1000.11, 5.30 – 1000.60, 5.06 – 1000.12, respectively The validation results showed that the selectivity, intra- and inter-day precision and accuracy, matrix effect, carry over, dilution and stability of all the analytes were in the acceptable range Quantitative results of 383 urine samples of farmers exposed to pesticides showed that there was only one sample in which analytes were not detected Conclusion: The method for the simultaneous quantification of DMP, DEP, DMTP, DETP, DMDTP, DEDTP in urine by LC–MS/MS technique has been developed with high sensitivity, specificity and accuracy The method was applied to determine the analytes in urine samples of farmers exposed to pesticides LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh PGS.TS Trần Việt Hùng với ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh tạo đầy đủ điều kiện em học tập thực nghiên cứu khoa học Em xin gửi tới thầy GS.TS Nguyễn Đức Tuấn, thầy cô môn Kiểm nghiệm thuốc độc chất lời cảm ơn chân thành hướng dẫn giúp đỡ em hồn thành chương trình học cách tốt nhất, hướng dẫn kiến thức làm tảng cho em thực luận văn trang bị nhiều kiến thức hữu ích cho mai sau Đặc biệt em xin chân thành bày tỏ lời tri ân sâu sắc đến Thầy GS.TS Nguyễn Đức Tuấn, TS Ngô Kiến Đức, DS Phan Nguyễn Trường Thắng Cô ThS Phạm Diễm Thu đồng hành, tận tình hướng dẫn em thực luận văn cách tốt Dưới hướng dẫn Thầy, Cô em bước tiếp cận với công việc nghiên cứu khoa học, biết cách kết hợp nghiên cứu dựa lý thuyết thực tiễn Em xin chân thành cảm ơn quý Thầy PGS.TS Trần Việt Hùng, PGS.TS Trần Thanh Nhãn, TS Phan Văn Hồ Nam với quý Cô TS Lê Thị Thu Cúc TS Nguyễn Thị Ngọc Dung dành thời gian đọc đưa phản biện, giúp em hồn thiện đề tài Em xin gửi lời cảm ơn đến anh, chị khoa Nghiên cứu & Phát triển Viện kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh, bạn học viên sinh viên hỗ trợ, giúp đỡ em việc thực nghiên cứu Bên cạnh em xin cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp động viên hỗ trợ em suốt thời gian học tập trường Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn hướng dẫn, giúp đỡ động viên tất thầy, cô, gia đình, đồng nghiệp bạn Kính chúc q thầy, cô người nhiều sức khỏe thành công! i MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .iii DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH viii MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT 1.2 CHẤT CHUYỂN HÓA OPs TRONG NƯỚC TIỂU 1.3 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG - KHỐI PHỔ (LC-MS/MS) 12 1.4 LỰA CHỌN CHUẨN NỘI TRONG KỸ THUẬT SẮC KÝ LC-MS .15 1.5 ẢNH HƯỞNG NỀN MẪU VÀ MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ MẪU 16 1.6 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG DƯỢC CHẤT VÀ/HOẶC CHẤT CHUYỂN HÓA TRONG MẪU SINH HỌC THEO HƯỚNG DẪN CỦA US-FDA VÀ EMA .18 1.7 MỘT SỐ CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG CHẤT CHUYỂN HÓA DIALKYL PHOSPHAT TRONG NƯỚC TIỂU BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ (LC-MS/MS) 21 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 23 2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU .24 2.3 TRANG THIẾT BỊ 25 2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.5 VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU 33 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 34 3.1 KHẢO SÁT QUY TRÌNH PHÂN TÍCH 34 3.2 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH .52 3.3 DỰ THẢO QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHẤT CHUYỂN HÓA DIALKYL PHOSPHAT TRONG NƯỚC TIỂU BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG – KHỐI PHỔ .62 ii 3.4 KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG CÁC MẪU THỰC TẾ 66 CHƯƠNG BÀN LUẬN 68 4.1 LỰA CHỌN KỸ THUẬT PHÂN TÍCH 68 4.2 ĐIỀU KIỆN ION HÓA VÀ PHÂN MẢNH 68 4.3 ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ .69 4.4 LỰA CHỌN CHẤT CHUẨN NỘI 70 4.5 ĐIỀU KIỆN XỬ LÝ MẪU VÀ HIỆU SUẤT CHIẾT 71 4.6 ĐỘ NHẠY CỦA PHƯƠNG PHÁP 72 4.7 TÍNH ĐẶC HIỆU 72 4.8 ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA CÁC CHẤT PHÂN TÍCH .72 4.9 ĐỘ PHA LOÃNG 73 4.10 KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG MẪU THỰC TẾ .73 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 74 5.1 KẾT LUẬN .74 5.2 KIẾN NGHỊ 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC PHỤ LỤC iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, Từ nguyên chữ viết tắt ACh Acetylcholine AChE Acetylcholinesterase Nghĩa tiếng Việt Ionization by Atmosphere pressure Ion hóa áp suất khí APCI AS Chemical ionization Actice substance Hoạt chất BVTV Bảo vệ thực vật CV Coefficient of variation CYPs Enzym cytochrome P450 DAP Dialkyl phosphat DBP Dibutyl phosphat DEDTP Diethyl dithiophosphat DEP Diethyl phosphat DETP Diethyl thiophosphat DMDTP Dimethyl dithiophosphat DMP Dimethyl phosphat DMTP Dimethyl thiophosphat DPDTP Dipropyldithiophosphat EI Electron impact EMA European medicines agency FMOs Flavin containing monooxygenase FOS Fosfomycin GC Gas chromatography Hệ số phân tán Tác động điện tử Cơ quan Quản lý thuốc Châu Âu Sắc ký khí iv Ký hiệu, Từ nguyên Nghĩa tiếng Việt LC Liquid chromatography Sắc ký lỏng HQC High quality control Mẫu kiểm tra nồng độ cao IS Internal standard Chuẩn nội LLE Liquid-liquid extraction Chiết lỏng – lỏng LLOQ Lower limit of quantification Giới hạn định lượng LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lượng LQC Low quality control MQC Medium quality control MS Mass spectrometry OPs Organophosphorus insecticides PFBBr 2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl bromide QC Quality control Mẫu kiểm tra ROS Reactive oxygen species Các loại oxy phản ứng RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối SD Standard deviation Độ lệch chuẩn SPE Solid phase extraction Chiết pha rắn SPME Solid phase microextraction Vi chiết pha rắn SQC Small quality control TTS Thuốc trừ sâu ULOQ Upper limit of quantitation chữ viết tắt Mẫu kiểm tra nồng độ thấp Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình Khối phổ Thuốc trừ sâu phosphor hữu Mẫu kiểm tra có nồng độ nồng độ trung bình Giới hạn định lượng Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-78 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-79 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-80 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-81 Phụ lục Kết chạy 383 mẫu thực tế Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-82 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-83 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-84 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-85 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-86 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-87 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-88 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-89 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-90 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-91 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn