Nghiên cứu phân lập, xây dựng quy trình định lượng flavonoid trong nguyên liệu, cao chiết an xoa (helicteres hirsuta lour )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - BỘ Y TẾ TRẦN NGỌC ĐAN THANH NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG FLAVONOID TRONG NGUYÊN LIỆU, CAO CHIẾT AN XOA (Helicteres hirsuta Lour.) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - BỘ Y TẾ TRẦN NGỌC ĐAN THANH NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG FLAVONOID TRONG NGUYÊN LIỆU, CAO CHIẾT AN XOA (Helicteres hirsuta Lour.) Ngành: Kiểm nghiệm thuốc độc chất Mã số: 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Ngô Thị Thanh Diệp PGS TS Trần Anh Vũ Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2018 Luận văn Thạc sĩ Dược học Khóa 2016 – 2018 NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG FLAVONOID TRONG NGUYÊN LIỆU, CAO CHIẾT AN XOA (Helicteres hirsuta Lour.) Học viên: Trần Ngọc Đan Thanh Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Ngô Thị Thanh Diệp PGS TS Trần Anh Vũ Mở đầu Gần theo kinh nghiệm dân gian, người dân sử dụng An xoa điều trị bệnh gan, chống tiêu chảy, diệt khuẩn, trị rắn cắn, số trường hợp ung thư gan bước đầu có tác dụng khả quan Vì với mong muốn tạo sở khoa học An xoa sản phẩm chất lượng nên, đề tài “Nghiên cứu phân lập, xây dựng quy trình định lượng flavonoid nguyên liệu, cao chiết An xoa (Helicteres hirsuta Lour.)” với mục tiêu cụ thể sau: chiết xuất, phân lập chất đánh dấu flavonoid từ cao cồn chiết từ phần thân mặt đất An xoa Xây dựng qui trình định lượng flavonoid nguyên liệu cao An xoa Điều chế cao An xoa có hàm lượng flavonoid cao Đối tượng phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: Toàn mặt đất An xoa Helicteres hirsuta Lour , thu hái Bình Phước vào tháng 03/2017 Phương pháp nghiên cứu Cao toàn phần An xoa tiến hành lắc chiết với dung môi n-hexan, cloroform, ethyl acetat thu cao ethyl acetat Sử dụng kỹ thuật sắc ký để phân lập chất đánh dấu từ cao ethyl acetat Xây dựng thẩm định quy trình định lượng chất đánh dấu dược liệu cao An xoa phương pháp HPLC Khảo sát tối ưu hóa quy trình điều chế cao An xoa có hàm lượng chất đánh dấu tốt Tiến hành điều chế cao để xây dựng tiêu chuẩn sở cho cao An xoa Kết bàn luận Kết phân lập thu 7,4’-di-O-methylisoscutellarein với độ tinh khiết HPLC 98,66 % tilirosid với độ tinh khiết HPLC 99,82 % Đã xây dựng thẩm định quy trình định lượng tilirosid An xoa phương pháp HPLC với cột sắc ký Zorbax Eclipse XDB-C18 (5 µm, 250 mm x 4,6 mm), thể tích tiêm mẫu 10 µl, nhiệt độ cột 30 oC, tốc độ dòng ml/phút, pha động ACN - nước (27 : 73) với mẫu dược liệu ACN - nước (24 : 76) với mẫu cao An xoa, bước sóng phát 314 nm Đã khảo sát điều kiện tối ưu điều chế cao An xoa có hàm lượng tilirosid cao từ dược liệu phương pháp ngấm kiệt ethanol 70 % với tỉ lệ dịch chiết : dược liệu 6,5 : 1, dịch chiết cô đến cao đặc tủ sấy 60 oC khoảng - 6h đến đạt độ ẩm quy định Đã xây dựng tiêu chuẩn sở để đánh giá chất lượng dược liệu cao An xoa Kết luận Qua trình nghiên cứu thực nghiệm, đề tài đạt mục tiêu đề Với kết đạt tiền đề cho nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng dược lý An xoa sau Master’s thesis of Pharmacy Academic course 2016-2018 STUDY ON ISOLATION, QUANTITATIVE DETERMINATION OF FLAVONOID IN PLANT AND EXTRACT FROM Helicteres hirsuta Lour Tran Ngoc Dan Thanh Supervisor: Associate Professor Ngo Thi Thanh Diep Associate Professor Tran Anh Vu Introduction Recently, in Viet Nam folk medicine, people used Helicteres hirsuta Lour in treatment liver disease, diarrhea, antibacterial, snakebite treatment, some cases of liver cancer Therefore, to create a science basis about Helicteres hirsuta to make quality products, the topic of “Study on isolation, quantitative determination of makers in dry raw plant and extract from Helicteres hirsuta Lour.” was conducted with objectives such as: extraction, isolation of flavonoid makers from Helicteres hirsuta; quantitative determination of isolated makers in dry plant and herbal extract; preparation Helicteres hirsuta extract had high flavonoid concentration Materials and Methods Materials: Dried aerial part of Helicteres hirsuta were collected in Binh Phuoc province, Viet Nam in March 2018, removed physical impurities, grinded to the partical size mm Methods: Helicteres hirsuta ethanol extract was distributed extracting liquid-liquid with increasing polarization solvents such as n-hexan, cloroform, ethyl acetat respectively Using the chromatography techniques to isolate makers from ethyl acetat extract Base on the isolated makers, determinate quantitative of its by HPLC method in dry raw plant and extract from Helicteres hirsuta Lour and optimization the extracting process of Helicteres hirsuta to have extract with high maker’s concentration and establishment of standards for this Result and discussion Isolated 39 mg 7,4’-di-O-methylisoscutellarein with 98,66 % purity by HPLC method and 43 mg tilirosid with 99,82 % purity by HPLC method Method for the quantification tilirosid was determinated and validated by HPLC method with column chromatography Zorbax Eclipse XDB-C18 (5 µm, 250 mm x 4,6 mm), the sample injection volume 10 µl, the temperature column 30 oC, flow rate ml/min, mobile phase ACN - water (27 : 73) for dried plant and ACN - nước (24 : 76) for extract, detection wavelength 314 nm The preparative process of Helicteres hirsuta extract was optimized with high tilirosid concentration from dry plant by percolation method with ethanol 70 %, ratio liquid extract:dry plant was : 1, liquid extract was dried by universal oven at 60 oC for - 6h Obtained extract was established of standards Conclusion Through the process of research, this research has achieved objectives These results are the allowed for further research on the chemical components as well as its pharmacological effects in the future i LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu khác TP Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 09 năm 2018 Tác giả luận văn Trần Ngọc Đan Thanh ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc PGS.TS Ngơ Thị Thanh Diệp PGS.TS Trần Anh Vũ, người Thầy tận tình hướng dẫn, dạy tơi suốt thời gian nghiên cứu thực luận văn Tôi xin trân trọng gửi đến lời cảm ơn đến Ban giám hiệu Khoa Dược, môn Kiểm nghiệm, môn Dược liệu hết lòng tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi suốt thời gian nghiên cứu hồn thành luận văn iii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU ĐỒ vii DANH MỤC CÁC HÌNH x ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Dược liệu An xoa 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Thành phần hóa học An xoa 1.1.3 Một số nghiên cứu tác dụng dược lý 1.2 Chiết xuất - phân lập 10 1.2.1 Một số phương pháp chung chiết xuất dược liệu 10 1.2.2 Một số cơng trình nghiên cứu chiết xuất phân lập tilirosid từ loài An xoa 11 1.3 Một số nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng tilirosid dược liệu 13 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Đối tượng nghiên cứu 18 2.1.1 Nguyên vật liệu 18 2.1.2 Dung mơi, hóa chất, tá dược 18 2.1.3 Trang thiết bị 18 2.1.4 Nơi thực 19 2.1.5 Xử lý số liệu 19 iv 2.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Chiết xuất phân lập chất đánh dấu dược liệu An xoa 20 2.2.2 Xây dựng quy trình định lượng chất đánh dấu dược liệu, cao chiết An xoa 23 2.2.3 Điều chế cao An xoa 30 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 36 3.1 Chiết xuất phân lập chất đánh dấu dược liệu An xoa 36 3.1.1 Chiết xuất dược liệu An xoa 36 3.1.2 Phân lập tinh chế chất đánh dấu 36 3.1.3 Xác định cấu trúc hóa học LD1 45 3.1.4 Xác định cấu trúc hóa học LD2 51 3.2 Xây dựng quy trình định lượng tilirosid dược liệu, cao chiết An xoa 57 3.2.1 Xây dựng thẩm định quy trình định lượng tilirosid dược liệu An xoa 57 3.2.2 Xây dựng thẩm định quy trình định lượng tilirosid cao chiết An xoa 68 3.3 Điều chế cao An xoa 75 3.3.1 Xây dựng số tiêu chuẩn dược liệu An xoa 75 3.3.2 Các thí nghiệm thăm dị 77 3.3.3 Tìm điều kiện phù hợp để điều chế dịch chiết An xoa 78 3.3.4 Điều chế cao đặc An xoa 81 3.3.5 Xây dựng tiêu chuẩn cao An xoa 82 CHƯƠNG BÀN LUẬN 85 4.1 Quy trình chiết xuất, phân lập tinh chế chất đánh dấu 85 4.2 Xây dựng thẩm định tilirosid dược liệu cao An xoa 85 4.3 Điều chế cao An xoa 86 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 88 v TÀI LIỆU THAM KHẢO 90 DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ nguyên Nghĩa Tiếng Việt BĐM DĐVN D DMSO Bình định mức Dược điển Việt Nam Đỉnh đôi NMR DEPT DPPH GPT GOT HPLC IC IR J MeOH MS NMR PDA Ppm RSD SKC SKLM SKĐ S TCCS UV VS Dược điển Việt Nam Doublet Dimethyl sulfoxid Distortionless Enhancement by Polarization Transfer 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl Glutamat pyruvat transaminase Glutamat Oxaloacetat Transaminase High-performance liquid Sắc ký lỏng hiệu cao chromatography Nồng độ tối thiểu gây ức Inhibitory Concentration chế Infrared Hồng ngoại Hằng số ghép NMR Methanol Mass Spectroscopy Khối phổ Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân Photodiode array Dãy quang điện Parts per million Phần triệu Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối Sắc ký cột Sắc ký lớp mỏng Sắc ký đồ Sắc ký đồ Singlet Đỉnh đơn NMR Tiêu chuẩn sở Tiêu chuẩn sở Ultraviolet Tử ngoại Vanillin sulfuric Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-25 Luận văn thạc sỹ dược học Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Trần Ngọc Đan Thanh Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-26 Luận văn thạc sỹ dược học Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Trần Ngọc Đan Thanh Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-27 Luận văn thạc sỹ dược học Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Trần Ngọc Đan Thanh Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-28 Luận văn thạc sỹ dược học Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Trần Ngọc Đan Thanh Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-29 Luận văn thạc sỹ dược học Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Trần Ngọc Đan Thanh Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-30 Luận văn thạc sỹ dược học Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Trần Ngọc Đan Thanh Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-31 Luận văn thạc sỹ dược học Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Trần Ngọc Đan Thanh Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-32 Luận văn thạc sỹ dược học Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Trần Ngọc Đan Thanh Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-33 Luận văn thạc sỹ dược học Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Trần Ngọc Đan Thanh Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-34 Luận văn thạc sỹ dược học Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Trần Ngọc Đan Thanh Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-35 Luận văn thạc sỹ dược học Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Trần Ngọc Đan Thanh Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-36 Luận văn thạc sỹ dược học Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Trần Ngọc Đan Thanh Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-37 Luận văn thạc sỹ dược học Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Trần Ngọc Đan Thanh Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-38 Luận văn thạc sỹ dược học Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Trần Ngọc Đan Thanh Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-39 Luận văn thạc sỹ dược học Trần Ngọc Đan Thanh PHỤ LỤC Kết kiểm giới hạn kim loại nặng giới hạn vi sinh cao đặc An xoa Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... MINH - BỘ Y TẾ TRẦN NGỌC ? ?AN THANH NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG FLAVONOID TRONG NGUYÊN LIỆU, CAO CHIẾT AN XOA (Helicteres hirsuta Lour. ) Ngành: Kiểm nghiệm thuốc độc... đề tài ? ?Nghiên cứu phân lập, xây dựng quy trình định lượng flavonoid nguyên liệu, cao chiết An xoa (Helicteres hirsuta Lour. )? ?? với mục tiêu cụ thể sau: chiết xuất, phân lập chất đánh dấu flavonoid. .. flavonoid từ cao cồn chiết từ phần thân mặt đất An xoa Xây dựng qui trình định lượng flavonoid nguyên liệu cao An xoa Điều chế cao An xoa có hàm lượng flavonoid cao Đối tượng phương pháp nghiên cứu Đối