Nghiên cứu tạo kit lamp phát hiện vi khuẩn vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp ahpnd bệnh chết sớm ems trên tôm

SỞ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM CƠNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO NGHIỆM THU NHIỆM VỤ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ Tên nhiệm vụ: NGHIÊN CỨU TẠO KIT LAMP PHÁT HIỆN VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP AHPND (BỆNH CHẾT SỚM EMS) TRÊN TƠM Đơn vị chủ trì nhiệm vụ: phịng CNSH Thủy sản Chủ nhiệm nhiệm vụ: ThS Nguyễn Thị Diễm Phương Cán tham gia: TS Võ Nguyễn Thanh Thảo KS Trần Thị Thanh Hương TS Ngô Huỳnh Phương Thảo TS Nguyễn Quốc Bình Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2019 MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG BIỂU TÓM TẮT PHẦN THÔNG TIN CHUNG PHẦN NỘI DUNG KHOA HỌC 11 I ĐẶT VẤN ĐỀ 11 II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 12 II.1 Tình hình ni tơm 12 II.2 Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tơm ni nguyên nhân gây bệnh 13 II.3 Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt gen mục tiêu Loop – mediated isothermal amplification LAMP 17 II.4 Ứng dụng kỹ thuật LAMP để phát V parahaemolyticus nước: 21 II.5 Vấn đề dương tính giả ứng dụng phương pháp LAMP 22 III VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 III.1 Nội dung 1: Phân lập vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tơm 24 III.2 Nội dung 2: Thiết lập tối ưu phản ứng LAMP 29 III.3 Nội dung 3: Kiểm tra độ đặc hiệu độ nhạy kỹ thuật phản ứng LAMP 36 III.4 Nôi dung 4: Đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu lâm sàng 37 III.5 Nội dung 5: So sánh phản ứng LAMP phát V parahaemo- lyticus với phương pháp chuẩn 40 III.6 Nội dung 6: Xác định thông số kỹ thuật hoàn thiện kit LAMP 41 III.7 Nội dung 7: Thử nghiệm kit LAMP EMS chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy cấp tính số địa phương 41 IV KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 42 IV.1 Nội dung 1: Phân lập chủng vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tơm 42 IV.2 Nội dung 2: Thiết lập tối ưu quy trình phản ứng LAMP 54 IV.3 Nội dung 3: Kiểm tra độ đặc hiệu độ nhạy phản ứng LAMP 63 IV.4 Nội dung 4: Đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu lâm sàng 67 IV.5 Nội dung 5: So sánh phản ứng LAMP phát V parahaemo- lyticus với phương pháp chuẩn khác 70 IV.6 Nội dung 6: Xác định thơng số kỹ thuật hồn thiện kit LAMP chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tơm 71 IV.7 Nội dung 7: Thử nghiệm kit LAMP chẩn đốn bệnh hoại tử gan tụy cấp tính số địa phương 72 V ĐÁNH GIÁ CHUNG 78 Nhận xét đánh giá kết đạt so với yêu cầu 78 Các nội dung cơng việc chưa hồn thành lý (nếu có) 80 VI ĐỀ NGHỊ 81 PHẦN SẢN PHẨM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 82 PHẦN TÀI LIỆU THAM KHẢO 84 TIẾNG VIỆT 84 TIẾNG ANH 84 PHỤ LỤC KHOA HỌC 89 1.Kết giải trình tự gen ToxR PirA/B hai chủng V parahaemolyticus pVPA3-1 (TP01.15-3) V parahaemolyticus (BL01.15-2) – Nội dung 1(a)89 2.Kết theo dõi tỷ lệ chết thử nghiệm tôm – Nội dung 1(b) 94 3.Kết kiểm tra mô học – Nội dung 1(b) 94 PHỤ LỤC TÌNH HÌNH SỬ DỤNG KINH PHÍ 96 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT EMS Early Mortality Syndrome AHPND Acute hepatopancreatic necrosis disease LAMP Loop mediated isothermal amplification TCBS Thiosulphate-citrate-bile salts sucrose cs cộng LB Luria bertani SDS Sodium Dedocyl Sunfat SYBR-green I Sybase Replication Server TAE buffer Dung dịch đệm chứa Tris base, acetic acid EDTA TCCS Tiêu chuẩn sở PirA/B Photorhabdus insect-related A/B ToxR Protein màng có vai trị quan trọng điều hịa phiên mã TT CNSH Tp HCM Trung tâm Công nghệ sinh học Tp Hồ Chí Minh OD Optical Density DANH MỤC HÌNH Hình 1: Mẫu tơm thẻ chân trắng bị bệnh hoại tử gan tụy cấp tính AHPND (A, B) tôm khỏe mạnh (C, D) (Jee Eun Han et al., 2015) 15 Hình 2: Các giai đoạn phản ứng LAMP (Eiken GENOME SITE, 2005) 19 Hình 3: Quy trình phản ứng LAMP (Njiru, 2012) 20 Hình 4: Cấu trúc kỹ thuật LFA 22 Hình 5: Quy trình phản ứng Lyophilised Lamp 23 Hình 6: Sơ đồ thực đề tài 24 Hình 7: Mơ tả trình tự gen PirB khuếch đại giải trình tự (Snapgene) 27 Hình 8: Đoạn DNA tạo dòng pJET1.2Blunt Error! Bookmark not defined Hình 9: Sơ đồ thí nghiệm đánh giá quy trình tách DNA từ mẫu tơm 38 Hình 10: Quy trình thí nghiệm đánh giá độ đặc hiệu độ nhạy lâm sàng KIT LAMP EMS Error! Bookmark not defined Hình 11: Khuẩn lạc mọc môi trường TCBS (a) kiểm tra hình thái kính hiển vi 100X (Zeiss, Primo Star, Đức) (b) 42 Hình 12: Kết kiểm tra PCR khuẩn lạc phân lập với mồi ToxR F/R (370 bp) (a) mồi AP3 F/R (336 bp) (b) 43 Hình 13: Kết điện di plasmid pVPA3-1 gel agarose 0.3% (a) kiểm tra protein tổng số (b) 45 Hình 14: Đường chuẩn tương quan OD600 nm mật độ tế bào vi khuẩn (CFU mL-1) chủng V parahaemolyticus (a) V parahaemolyticus pVPA3-1 (b) 48 Hình 15: Hình thái khuẩn lạc chủng V parahaemolyticus pVPA3-1 49 Hình 16: Biểu đồ chết tích lũy tơm thẻ thử nghiệm độc lực vi khuẩn50 Hình 17: Mẫu tơm thu lại sau thử nghiệm ngâm với vi khuẩn 51 Hình 18: Kết kiểm tra PCR sau thử nghiệm độc lực vi khuẩn 52 Hình 19: Kết kiểm tra mô học mẫu tôm sau thử nghiệm cảm nhiễm với chủng V parahaemolyticus 53 Hình 20: Vị trí bắt cặp plasmid pVPA3-1 mồi LAMP (SnapGene2.3.2) 54 Hình 21: Kết kiểm tra phản ứng LAMP mồi LAMPToxR 55 Hình 22: Kết kiểm tra mồi LAMPA2 LAMPA3 56 Hình 23: Kết tối ưu mồi phản ứng LAMPA2 LAMA3 57 Hình 24: Kết tối ưu Betaine, enxym Bst polymerase, MgSO4 thời gian phản ứng LAMPA2 58 Hình 25: Kết khảo sát DNA cho phản ứng LAMPA2 59 Hình 26: Kết kiểm tra mồi LAMP thiết kế 60 Hình 27: Kết tối ưu nhiệt độ phản ứng LAMP 60 Hình 28: Kết tối ưu thời gian phản ứng LAMP, lần lặp lại 61 Hình 29: Kết tối ưu nồng độ betaine enzym Bst polymerase 62 Hình 30: Kết kiểm tra độ đặc hiệu phản ứng LAMP với mẫu DNA khác 63 Hình 31: Kết kiểm tra độ đặc hiệu phản ứng LAMP mẫu DNA tách chiết từ tôm khỏe mạnh 64 Hình 32: Kết kiểm tra tạo dịng đoạn pirA/B vào chủng E coli DH5α 65 Hình 33: Kết kiểm tra độ nhạy phản ứng LampP5 66 Hình 34: Kết kiểm tra PCR với mồi AP3 F/R mẫu DNA tách 68 Hình 35: Kết kiểm tra độ đặc hiệu độ nhạy lâm sàng LAMPP5 69 Hình 36: Kết điện di sản phẩm PCR với primer F3/B3 70 Hình 37: Kết kiểm tra lâm sàng 84 mẫu tôm 73 Hình 38: Kết kiểm tra LAMPP5 máy Realtime PCR 76 Hình 39: Kết PCR khuếch đại gen PirA/B để giải trình tự 89 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1: Danh sách mồi phản ứng PCR dùng đề tài 26 Bảng 2: Danh sách mồi phản ứng LAMP dùng đề tài 30 Bảng 3: Protocol LAMP sử dụng đề tài 32 Bảng 4: Danh sách chủng vi khuẩn DNA plasmid sử dụng để kiểm tra độ đặc hiệu phản ứng LAMP 36 Bảng 5: Danh sách dòng vi khuẩn V parahaemolyticus phân lập chia theo nhóm 43 Bảng 6: Kết so sánh trình tự gen ToxR PirA/B với trình tự ngân hàng gen NCBI 46 Bảng 7: Thành phần điều kiện phản ứng LAMPP5 sau tối ưu hóa 71 Bảng 8: Theo dõi số lượng tôm chết thử nghiệm đánh giá độc lực vi khuẩn 94 TÓM TẮT Trong năm vừa qua, bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) hay bệnh chết sớm (EMS) có diễn biến phức tạp gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành nuôi tôm nước ta Tác nhân gây bệnh xác định vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus mang plasmid pVPA3-1 chứa gen độc tố pirA/PirB Với tỷ lệ gây chết cao (lên đến 90-100%) thời gian phát bệnh ngắn (khoảng tuần), việc phát nhanh diện V parahaemolyticus pVPA3-1 ao nuôi tôm điều cần thiết để đưa biện pháp xử lý kịp thời trước dịch bệnh bùng phát gây tổn thất lớn Chính vậy, đề tài triển khai nhằm xây dựng KIT LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) phát V parahaemolyticus pVPA3-1 gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tơm ni Đề tài phân lập 19 chủng vi khuẩn V parahaemolyticus chia thành hai nhóm chứa (n = 11) khơng chứa (n = 8) plasmid pVPA3-1 Độc lực hai nhóm tôm đánh giá phương pháp ngâm Kết cho thấy chủng V parahaemolyticus pVPA3.1 gây chết lên đến 100% tôm, chủng không mang plasmid pVPA3.1 không gây chết tôm Năm mồi LAMP thiết kế trình tự gen gây độc PirA/B mồi LampP5 chọn để phát triển phản ứng LAMP phát V parahaemolyticus pVPA3-1 Sau trình tối ưu thành phần điều kiện cần thiết, kit LAMP có độ đặc hiệu (kiểm tra 19 mẫu DNA khác nhau) độ nhạy cao (10 gen đích) Đề tài cịn xây dựng quy trình tách DNA trực tiếp từ mẫu tơm để rút ngắn thời gian chẩn đốn bệnh, nhiên, quy trình cần phải tối ưu thêm để đảm bảo độ xác phản ứng LAMP Tuy phản ứng LAMP với mồi LAMPP5 cho kết độ đặc hiệu độ nhạy lâm sàng 20 mẫu tôm 86% 93%, vấn đề cần phải giải tượng dương tính giả thực nội dung khảo nghiệm thực tế (đến 87%), thời hạn điều kiện bảo quản KIT PHẦN THÔNG TIN CHUNG Tên nhiệm vụ: Nghiên cứu tạo KIT LAMP phát vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây hội chứng hoại tử gan tụy cấp AHPND (bệnh Chết sớm EMS) tôm (Mã số: TS03/16-17) Đơn vị chủ trì: Phịng Cơng nghệ Sinh học Thủy sản, Trung tâm CNSH Tp Hồ Chí Minh Đơn vị phối hợp chính: (nếu có) Chủ nhiệm nhiệm vụ: ThS Nguyễn Thị Diễm Phương Cán tham gia thực hiện: (Ghi rõ chức danh cán thành viên chính, thành viên, kỹ thuật viên) Thành viên: TS Võ Nguyễn Thanh Thảo – Thành viên KS Trần Thị Thanh Hương – Thành viên TS Ngô Huỳnh Phương Thảo – Thành viên TS Nguyễn Quốc Bình – Thành viên Thời gian thực hiện: 33 tháng (Từ tháng 01/2016 đến 09/2018) Kinh phí: - Tổng dự tốn: 500.000.000 VNĐ - Kinh phí sử dụng: 500.000.000 VNĐ Mục tiêu nhiệm vụ: - Thiết lập quy trình phát nhanh tác nhân gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính AHPND tơm ni kỹ thuật LAMP – Loop Mediated Isothermal Amplification - Góp phần khẳng định chủng vi khuẩn V parahaemoluticus có mang plasmid pVPA3-1 chứa gen PirA PirB nguyên nhân gây nên bệnh hoại tử gan tụy cấp tính AHPND tôm nuôi - Triển khai ứng dụng quy trình sản phẩm KIT LAMP/ KIT PCR phát nhanh tác nhân gây bệnh Hoại tử gan tụy cấp AHPND bệnh Chết sớm EMS vào thực tế đơn vị xét nghiệm chẩn đoán bệnh thủy sản - Góp phần đa dạng hóa sản phẩm nghiên cứu ứng dụng Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh nhằm đáp ứng nhu cầu thị trường Các nội dung công việc thực so với đăng ký STT Nội dung đăng ký ND1: Phân lập chủng vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tơm Thời gian (bắt đầu – kết thúc) 01-04/2016 (a) Phân lập vi khuẩn V parahaemolyticus Đánh giá (a) Đã phân lập 19 chủng V parahaemolyticus chia làm nhóm: nhóm khơng mang plasmid pVPA3-1 (n= 8) nhóm có mang pVPA3-1 (n= 11) Hồn thành 100% (b) Nhóm có mang pVPA3-1 gây chết tơm tới 100%, nhóm khơng có pVPA3-1 khơng gây chết tơm (b) Đánh giá khả gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính V parahaemolyticus ND2: Thiết lập tối ưu phản ứng LAMP phát V parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính Thực 05-08/2016 (a) Thiết kế kiểm tra độ ổn định mồi cho phản ứng LAMP (b) Đã tối ưu điều kiện (nhiệt độ, Hồn thành 100% tơm thời gian) thành phần (Betaine, enzym Bst Polymerase) phản ứng LAMP (a)Thiết kế mồi cho phản ứng LAMP (b)Tối ưu phản ứng LAMP ND3: Kiểm tra (a) độ đặc hiệu (b) độ nhạy phản ứng LAMP 09-11/2016 Đã kiểm tra độ đặc hiệu phản ứng LAMP 19 DNA khác nhau, bên cạnh đó, kiểm tra độ nhạy phản ứng 10 gen đích Hồn thành 100% ND4: Đánh giá độ đặc hiệu độ nhạy lâm sàng 12/201602/2017 (a) Thiết lập quy trình tách chiết DNA phù hợp cho KIT Hoàn thành 100% (a)Xây dựng quy trình tách chiết DNA (b) Đã thực kiểm tra độ đặc hiệu độ nhạy lâm sàng LAMP 104 mẫu tơm Tuy nhiên, dương tính giả xuất với tỷ lệ cao 90% (b)Kiểm tra độ đặc hiệu độ nhạy lâm sàng ND5: So sánh phản ứng LAMP phát V parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính với phương pháp phát khác 05-07/2017 Đã so sánh độ nhạy phản ứng LAMP so với phản ứng PCR Hoàn thành 100% ND6: Xác định thông số kỹ thuật hoàn thiện KIT LAMP 03-04/2017 Tổng hợp thông số KIT LAMP EMS như: thành phần/điều kiện phản ứng LAMP, độ đặc hiệu độ nhạy phản ứng Hoàn thành 100% PHẦN SẢN PHẨM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Dạng I: Mẫu; Sản phẩm; Vật liệu; Thiết bị, máy móc; Dây chuyền cơng nghệ; Giống trồng; Giống vật nuôi loại khác STT Nội dung đăng ký Đơn vị Bộ KIT LAMP xác định vi khuẩn gây bệnh chết sớm tôm Bộ Bộ sưu tập chủng V parahaemolyticus V parahaemolyticus pVPA3-1 Chủng Phản ứng LAMPP5 có độ nhạy 10 gen đích Phản ứng đặc hiệu cao V parahaemolyticus pVPA3-1 DNA dùng làm chứng dương – pJET1.2blunt::PirA/B DNA đối chứng âm – từ tôm khỏe mạnh Mức chất lượng cần đạt Độ nhạy ≥ KIT 01 thương mại Số lượng Đánh giá Chưa đạt Khơng đăng kí Mẫu Dạng II: Nguyên lý ứng dụng; Phương pháp; Tiêu chuẩn STT Tên sản phẩm Yêu cầu khoa học cần đạt Kết chứng tỏ chủng V parahaemolyticus pVPA3-1 Kết thử nghiệm tôm thẻ (tỷ lệ chết, kết PCR mơ Khơng đăng kí ngun nhân gây bệnh chết sớm – học) bệnh hoại tử gan tụy cấp tôm 82 thẻ 83 Kết đào tạo STT Cấp đào tạo Cử nhân Số lượng Chuyên ngành đào tạo Cử nhân Công nghệ Sinh học Đạt (4 Cử nhân) PHẦN TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Đặng Thị Hoàng Oanh, & Nguyễn Thanh Phương (2012) Các bệnh nguy hiểm tơm ni Tạp Chí Khoa Học, 22c, 106–118 Hiệp Hội Chế Biến Và Xuất Khẩu Thủy Sản Việt Nam (VASEP) (2019) http://vasep.com.vn/1192/OneContent/tong-quan-nganh.htm Tề, T B Q (2006) Bệnh học thủy sản – Tôm Vàng Viện nuôi trồng Thủy sản I Retrieved from https://www.tomvang.com/tai-lieu/benh-hoc-thuy-san-ts-buiquang-te/ Ngô Huỳnh Phương Thảo, Trần Thị Thanh Huong, Nguyễn Quốc Binh (2011) Tối ưu hóa điều kiện thiết lập KIT LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) phát bệnh đốm trắng tôm Ho Chi Minh, Viet Nam Cục Thú Y (2014) Tiêu chuẩn sở 02- 2014/TY-TS Hà Nội fistenet.gov.vn (2018) https://www.fistenet.gov.vn/nuôi-trồng-thủy-sản/-nuôi-thủysản/doc-tin/011938/2018-12-18/doi-tuong-thuy-san-nuoi-chu-luc TIẾNG ANH Bi, A., Nakajima, C., Fukushima, Y., Tamaru, A., Sugawara, I., Kimura, A., … Suzuki, Y (2012) A Rapid Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay Targeting hspX for the Detection of Mycobacterium tuberculosis Complex Japanese Journal of Infectious Diseases, 65(3), 247–251 Biswas, G., & Sakai, M (2014a) Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for detection and identification of aquaculture pathogens: current state and perspectives Applied Microbiology and Biotechnology, 98(7), 2881–2895 Biswas, G., & Sakai, M (2014b) Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for detection and identification of aquaculture pathogens: Current state and perspectives Applied Microbiology and Biotechnology, 98(7), 2881–2895 Carter, C., Akrami, K., Hall, D., Smith, D., & Aronoff-Spencer, E (2017) Lyophilized visually readable loop-mediated isothermal reverse transcriptase 84 nucleic acid amplification test for detection Ebola Zaire RNA Journal of Virological Methods, 244, 32–38 Chen, H.-W., Weissenberger, G., & Ching, W.-M (2016) Development of Lyophilized Loop-Mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Leptospira Military Medicine, 181(5S), 227–231 Chen, S., & Ge, B (2010a) Development of a toxR-based loop-mediated isothermal amplification assay for detecting Vibrio parahaemolyticus BMC Microbiology, 10, 41 Chen, S., & Ge, B (2010b) Development of a toxR-based loop-mediated isothermal amplification assay for detecting Vibrio parahaemolyticus BMC Microbiology, 10(1), 41 Current Protocols in Molecular Biology (1996) Current Protocols in Molecular Biology, 36(2.4) Dhama, K., Karthik, K., Chakrabort, S., Tiwari, R., Kapoor, S., Kumar, A., & Thomas, P (2014) Loop-mediated Isothermal Amplification of DNA (LAMP): A New Diagnostic Tool Lights the World of Diagnosis of Animal and Human Pathogens: A Review Pakistan Journal of Biological Sciences, 17(2), 151–166 Feng, C., Wang, C., Lin, X., Zhang, Y., Lv, J., Deng, J., … Wu, S (2013) Development of a loop-mediated isothermal amplification method for detection of Perkinsus spp in mollusks Diseases of Aquatic Organisms, 104(2), 141–148 Fischbach, J., Xander, N C., Frohme, M., & Glökler, J F (2015) Shining a light on LAMP assays— A comparison of LAMP visualization methods including the novel use of berberine BioTechniques, 58(4) Flegel, T W (1997) Major viral diseases of the black tiger prawn (Penaeus monodon) in Thailand World Journal of Microbiology and Biotechnology, 13(4), 433–442 Han, J., Tang, K., Tran, L., & Lightner, D (2015) Photorhabdus insect-related (Pir) toxin-like genes in a plasmid of Vibrio parahaemolyticus, the causative agent of acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) of shrimp Diseases of Aquatic Organisms, 113(1), 33–40 Han, J.E., Tang, K F J., Aranguren, L F., & Piamsomboon, P (2017) Characterization and pathogenicity of acute hepatopancreatic necrosis disease natural mutants, pirABvp (‐ ) V parahaemolyticus, and pirABvp (+) V campbellii strains Aquaculture, 470, 84–90 Han, Jee Eun, Tang, K F J., Tran, L H., & Lightner, D V (2015) Photorhabdus insect-related (Pir) toxin-like genes in a plasmid of Vibrio parahaemolyticus, the causative agent of acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) of shrimp Diseases of Aquatic Organisms, 113(1), 33–40 Hayashida, K., Kajino, K., Hachaambwa, L., Namangala, B., & Sugimoto, C (2015) 85 Direct Blood Dry LAMP: A Rapid, Stable, and Easy Diagnostic Tool for Human African Trypanosomiasis PLOS Neglected Tropical Diseases, 9(3), e0003578 Henke, W., Herdel, K., Jung, K., Schnorr, D., & Loening, S A (1997) Betaine improves the PCR amplification of GC-rich DNA sequences Nucleic Acids Research, 25(19), 3957–3958 Jun, J W., Han, J E., Tang, K F J., Lightner, D V., Kim, J., Seo, S W., & Park, S C (2016) Potential application of bacteriophage pVp-1: Agent combating Vibrio parahaemolyticus strains associated with acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) in shrimp Aquaculture, 457, 100–103 Karthik, K., Rathore, R., Thomas, P., Arun, T R., Viswas, K N., Dhama, K., & Agarwal, R K (2014) New closed tube loop mediated isothermal amplification assay for prevention of product cross-contamination MethodsX, 1, 137–143 Kim, Y B., Okuda, J., Matsumoto, C., Takahashi, N., Hashimoto, S., & Nishibuchi, M (1999) Identification of Vibrio parahaemolyticus Strains at the Species Level by PCR Targeted to the toxR Gene Journal of Clinical Microbiology, 37(4), 1173–1177 Retrieved from Kongrueng, J, Yingkajorn, M., Bunpa, S., Sermwittayawong, N., Singkhamanan, K., & Vuddhakul, V (2015) Characterization of Vibrio parahaemolyticus causing acute hepatopancreatic necrosis disease in southern Thailand Journal of Fish Diseases, 38(11), 957–966 Kongrueng, Jetnaphang, Tansila, N., Mitraparp-arthorn, P., Nishibuchi, M., Vora, G J., & Vuddhakul, V (2015) LAMP assay to detect Vibrio parahaemolyticus causing acute hepatopancreatic necrosis disease in shrimp Aquaculture International, 23(5), 1179–1188 Lightner, D ., & Redman, R (1998) Shrimp diseases and current diagnostic methods Aquaculture, 164(1–4), 201–220 Liu, L., Jiang, L., Yu, Y., Xia, X., Pan, Y., Yan, S., & Wang, Y (2017) Rapid diagnosis of Vibrio owensii responsible for shrimp acute hepatopancreatic necrosis disease with isothermal recombinase polymerase amplification assay Molecular and Cellular Probes, 33, 4–7 Liu, N., Zou, D., Dong, D., Yang, Z., Ao, D., Liu, W., & Huang, L (2017) Development of a multiplex loop- mediated isothermal amplification method for the simultaneous detection of Salmonella spp and Vibrio parahaemolyticus, (February), 1–7 Luan, X Y., Chen, J X., Zhang, X H., Jia, J T., Sun, F R., & Li, Y (2007) Comparison of different primers for rapid detection of Vibrio parahaemolyticus using the polymerase chain reaction Letters in Applied Microbiology, 44(3), 242–247 Makino, K., Oshima, K., Kurokawa, K., Yokoyama, K., Uda, T., Tagomori, K., … 86 Iida, T (2003) Genome sequence of Vibrio parahaemolyticus: a pathogenic mechanism distinct from that of V cholerae The Lancet, 361(9359), 743–749 Mao, X L., Zhou, S., Xu, D., Gong, J., Cui, H C., & Qin, Q W (2008) Rapid and sensitive detection of Singapore grouper iridovirus by loop-mediated isothermal amplification Journal of Applied Microbiology, 105(2), 389–397 NEMOTO, J., IKEDO, M., KOJIMA, T., MOMODA, T., KONUMA, H., & HARAKUDO, Y (2011) Development and Evaluation of a Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for Rapid and Sensitive Detection of Vibrio parahaemolyticus Journal of Food Protection, 74(9), 1462–1467 Njiru, Z K (2012) Loop-mediated isothermal amplification technology: towards point of care diagnostics PLoS Neglected Tropical Diseases, 6(6), e1572 Notomi, T., Okayama, H., Masubuchi, H., Yonekawa, T., Watanabe, K., Amino, N., & Hase, T (2000a) Loop-mediated isothermal amplification of DNA Nucleic Acids Research, 28(12), E63 Notomi, T., Okayama, H., Masubuchi, H., Yonekawa, T., Watanabe, K., Amino, N., & Hase, T (2000b) Loop-mediated isothermal amplification of DNA Nucleic Acids Research, 28(12), E63 Sirikharin, R., Taengchaiyaphum, S., Sritunyalucksana, K., Thitamadee, S., Flegel, T W., & Mavichak, R (2014) A new and improved PCR method for detection of AHPND bacteria Network of Aquaculture Centres in Asia-Pacific (NACA), 7–9 Soto-Rodriguez, S A., Lozano-Olvera, R., Morales-Covarrubias, M S., Gomez-Gil, B., & Betancourt-Lozano, M (2014) Field and Experimental Evidence of Vibrio parahaemolyticus as the Causative Agent of Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease of Cultured Shrimp (Litopenaeus vannamei) in Northwestern Mexico Applied and Environmental Microbiology, 81(5), 1689–1699 Xiao, J., Liu, L., Ke, Y., Li, X., Liu, Y., Pan, Y., … Wang, Y (2017) Shrimp AHPND-causing plasmids encoding the PirAB toxins as mediated by pirABTn903 are prevalent in various Vibrio species Scientific Reports, 7(1), 42177 Yabuuchi, E., Miwatani, T., Takeda, Y., & Arita, M (1974) Flagellar Morphology of Vibrio parahaemolyticus (Fujino et al) Sakazaki, Iwanami and Fukumi 19631 Japanese Journal of Microbiology, 18(4), 295–305 Yamazaki, W., Kumeda, Y., Misawa, N., Nakaguchi, Y., & Nishibuchi, M (2010) Development of a Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for Sensitive and Rapid Detection of the tdh and trh Genes of Vibrio parahaemolyticus and Related Vibrio Species Applied and Environmental Microbiology, 76(3), 820– 828 Yamazaki, Wataru, Ishibashi, M., Kawahara, R., & Inoue, K (2008) Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Vibrio parahaemolyticus BMC Microbiology, 8(1), 163 87 Yien -Ping, W., Shuhaidah, O., & Hui-yee, C (2018) Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP): A Versatile Technique for Detection of Microorganisms Journal of Applied Microbiology, 124(3), 626–643 Zorriehzahra, M J (2015) Early Mortality Syndrome (EMS) as new Emerging Threat in Shrimp Industry Advances in Animal and Veterinary Sciences, 3(2s), 64–72 TP.HCM, ngày tháng năm 20 Đơn vị chủ trì thực TP.HCM, ngày tháng năm 20 Chủ nhiệm đề tài TP.HCM, ngày tháng năm 20 Phòng Quản lý Khoa học HTQT TP.HCM, ngày tháng năm 20 Phịng Tài – Kế tốn Lâm Vỹ Nguyên Nguyễn Thị Kim Xoàng TP.HCM, ngày tháng năm 20 Phó Giám đốc phụ trách TP.HCM, ngày tháng năm 20 Giám đốc PGS.TS Dương Hoa Xô 88 PHỤ LỤC KHOA HỌC 1.Kết giải trình tự gen ToxR PirA/B hai chủng V parahaemolyticus pVPA3-1 (TP01.15-3) V parahaemolyticus (BL01.15-2) – Nội dung 1(a) (a) Kết khuếch đại gen PirA/B PCR với cặp mồi PirA/B 2F/R, 5F/R, 6F/R Hình 38: Kết PCR khuếch đại gen PirA/B để giải trình tự Giếng - thang DNA, giếng 2, – sản phẩm khuếch đại mồi PirA/B 2F/R 5F/R 6F/R, giếng – đối chứng âm, giếng – đối chứng dương Kết khuếch đại gen ToxR trình bày phần Kết - Nội dung 1, a 89 (b) Kết giải trình tự máy Genetic Analyzer 3500 (Hitachi, Nhật Bản) a Chủng V parahaemolyticus TP 01.15-3 (PirA/B+) Trình tự Gen ToxR TTACGAGTGGTTGCTGTCATGAATGTAGTTCAAAATCAGCTGGTTATTTTGTCCGCCAGTGGCAATT ACTTCCACTGGTAACGAGTCTTCTGCATGGTGCTTAACGTAGCGTTCAATGCACTGCTCAATAGAAG GCAACCAGTTGTTGATTTGCGGGTGATTTACAGGTGTCATCACTGGTACGTTCTGATACTCACCAAT CTGACGGAACTGAGATTCCGCTGGGTTTGTAAACAGCGGTACGCAAATCGGTAGTAATAGTGCCAA AAATAAAATAACGCGTGGAATCCAAGGATTCACAGCAGAAGCCACAGGTGCTTTTTCAGGTACTAC TGGCGCTTTTGGTTCAACGATTGCGTCAGAAGAC PirA/B Đoạn GGGGCCTCTTTATATGCTTATTTGGCAAAATCAAAGAGTTGAAAAAAGTTGATGTGTTTGTTCACAG TAATTTAATTTCATATTCACCTGCTGTTGGTTTTCCTAGTGGTAATTTCAACTATATTGCTACAGGTA CGGAAGATGAAATACCTCAACCATTAAAACCAAATATGTTTGGGGAACGTCGAAATCGTATTGTAA AAATTGAATCATGGAACAGTATTGAAATACATTATTACAATCGCGTAGGTCGACTTAAACTAACTTA TGAAAATGGGGAAGTGGTAGAACTAGGCAAGGCTCATAAATATGACGAGCATTACCAATCTATTGA GTTAAACGGCGCTTACATTAAATATGTTGATGTTATTGCCAATGGACCTGAAGCAATTGATCGAATC GTATTTCATTTTTCAGATGATCGAACATTTGTTGTTGGTGAAAACTCAGGCAAGCCAAGTGTGCGTTT CAAACTGGGAAGACCCACCCCCCGCCCCCCCAAAAAAA (507 bp) NNNNNCNNNNCNANTNNNNCACAATGTTCGATCATCTGANAATGAAATACGATTCGATCAATTGCT TCAGGTCCATTGGCAATAACATCAACATATTTAATGTAAGCGCCGTTTAACTCAATAGATTGGTAAT GCTCGTCATATTTATGAGCCTTGCCTAGTTCTACCACTTCCCCATTTTCATAAGTTAGTTTAAGTCGA CCTACGCGATTGTAATAATGTATTTCAATACTGTTCCATGATTCAATTTTTACAATACGATTTCGACG TTCCCCAAACATATTTGGTTTTAATGGTTGAGGTATTTCATCTTCCGTACCTGTAGCAATATAGTTGA AATTACCACTAGGAAAACCAACAGCAGGTGAATATGAAATTAAATTACTGTGAACAAACACATCAA CTTTTTTCAACTCTTTGATTTTTTGCCAAATAAGCATATGTTCAAAGCCGTGAACCGTACACCAACTA 90 Đoạn Đoạn CANNCACCCANNN (484 bp) AACCCTTTTTGTATTACATGGCGCTAGTCGTGGTTTCTGTACAATCTATTACCACTAAGAAGGTGCTC ACATGACTAACGAATACGTTGTAACAATGTCATCTTTGACGGAATTTAACCCTAACAATGCTCGTAA AAGTTATTTATTTGATAACTATGAAGTTGATCCTAACTATGCTTTCAAAGCAATGGTTTCATTTGGTC TTTCAAATATTCCTTACGCGGGTGGTTTTTTATCAACGTTATGGAATATCTTTTGGCCAAATACGCCA AATGAGCCAGATATTGAAAACATTTGGGAACAATTACGTGACAGAATCCAAGATTTAGTAGATGAA TCGATTATAGATGCCATCAATGGAATATTGGATAGCAAAATCAAAGAGACACGCGATAAAATTCAA GACATTAATGAGACTATCGAAAACTTCGGTTATGCTGCGGCAAAAGATGATTACATTGGTTTAGTTA CTCATTACTTGATTGGACTTGAAGAGAACTTTAAGCGCGAGCTAGACGGTGATAATTGGCTTGGA (537 bp) GGGCCCTTAATTCTCTTCAGTCCATCAAGTAATGAGTAACTAAACCAATGTAATCATCTTTTGCCGC AGCATAACCGAAGTTTTCGATAGTCTCATTAATGTCTTGAATTTTATCGCGTGTCTCTTTGATTTTGC TATCCAATATTCCATTGATGGCATCTATAATCGATTCATCTACTAAATCTTGGATTCTGTCACGTAAT TGTTCCCAAATGTTTTCAATATCTGGCTCATTTGGCGTATTTGGCCAAAAGATATTCCATAACGTTGA TAAAAAACCACCCGCGTAAGGAATATTTGAAAGACCAAATGAAACCATTGCTTTGAAAGCATAGTT AGGATCAACTTCATAGTTATCAAATAAATAACTTTTACGAGCATTGTTAGGGTTAAATTCCGTCAAA GATGACATTGTTACAACGTATTCGTTAGTCATGTGAGCACCTTCTTAGTGGTAATAGATTGTACAGA AACCACGACTAGCGCCATTGTTAATTACAACAATACGCTGATGATAGAATGCATATCCAGGGGCGA (537bp) CATTTGGTAATTCTATTACTTGATTGGACTTGAAGAGAACTTTAAGCGCGAGCTAGACGGTGATGAA TGGCTTGGTTATGCGATATTGCCTCTATTAGCAACAACTGTAAGTCTTCAAATTACTTACATGGCTTG TGGTCTGGATTATAAGGATGAATTCGGTTTCACCGATTCTGATGTGCATAAGCTAACACGTAATATT GATAAGCTTTATGATGATGTATCGTCTTACATTACAGAACTCGCTGCGTGGGCTGATAACGACTCTT ACAATAATGCAAACCAAGATAACGTGTATGATGAAGTGATGGGTGCTCGTAGTTGGTGTACGGTTC ACGGCTTTGAACATATGCTTATTTGGCAAAAAATCAAAGAGTTGAAAAAAGTTGATGTGTTTGTTCA CAGTAATTTAATTTCATATTCACCTGCTGTTGGTTTTCCTAGTGGTAATTTCAACTATATTGCTACAG GTACGGAAGATGAAATACCTCAACCATTAAAACCAAATATGTTTGGGGAAGTTCCAAAATCAA (533 91 bp) AATTTTTTGGTTGAGTATTTCTCTTCCGTACCTGTAGCAATATAGTTGAAATTACCACTAGGAAAACC AACAGCAGGTGAATATGAAATTAAATTACTGTGAACAAACACATCAACTTTTTTCAACTCTTTGATT TTTTGCCAAATAAGCATATGTTCAAAGCCGTGAACCGTACACCAACTACGAGCACCCATCACTTCAT CATACACGTTATCTTGGTTTGCATTATTGTAAGAGTCGTTATCAGCCCACGCAGCGAGTTCTGTAATG TAAGACGATACATCATCATAAAGCTTATCAATATTACGTGTTAGCTTATGCACATCAGAATCGGTGA AACCGAATTCATCCTTATAATCCAGACCACAAGCCATGTAAGTAATTTGAAGACTTACAGTTGTTGC TAATAGAGGCAATATCGCATAACCAAGCCATTCATCACCGTCTAGCTCGCGCTTAAAGTTCTCTTCA AGTCCAATCAAGTAATGAGTAACTAAACCAATGTAATCATCTTTTGCCGAAGCATAACAAA(532 bp) b Chủng V parahaemolyticus BL01.15-2 (PirA/B-) Trình tự Gen ToxR GTCTTCTGACGCAATCGTTGAACCAAAAGCGCCAGTAGTACCTGAAAAAGCACCTGTGGCTTCTGCT GTGAATCCTTGGATTCCACGCGTTATTTTATTTTTGGCACTATTACTACCGATTTGCGTACTGCTGTTT ACAAACCCAGCGGAATCTCAGTTCCGTCAGATTGGTGAGTATCAGAACGTACCAGTGATGACACCT GTAAATCACCCGCAAATCAACAACTGGTTGCCTTCTATTGAGCAGTGCATTGAACGCTACGTTAAGC ACCATGCAGAAGACTCGTTACCAGTGGAAGTAATTGCCACTGGCGGACAAAATAACCAGCTGATTT TGAACTACATTCATGACAGCAACCACTCGTAA 92 (c) Kết so sánh ngân hàng NCBI 93 2.Kết theo dõi tỷ lệ chết thử nghiệm tôm – Nội dung 1(b) Ngày thử nghiệm Chủng Nghiệm thức V parahae NT4.2 – 105 molyticus NT3.2 – 104 (TP01.15-3) NT2.2 – 103 V parahae NT4.1 – 105 molyticus NT3.1 – 104 (BL01.15-2) NT2.1 – 103 NT1 ĐC âm 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Tổng số tôm chết Tỷ lệ chết 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 18 (18/30) 24 (24/30) 30 (30/30) 0 0 60% 83% 100% 0% 0% 0% 0% 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Bảng 8: Theo dõi số lượng tôm chết thử nghiệm đánh giá độc lực vi khuẩn 3.Kết kiểm tra mô học – Nội dung 1(b) Giấy tư vấn – chuẩn đoán 94 0 0 2 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 95 PHỤ LỤC TÌNH HÌNH SỬ DỤNG KINH PHÍ STT Nội dung khoản chi (1) (2) Công lao động Nguyên, vật liệu, lượng Thiết bị, máy móc (nêu có) Chi khác Tổng cộng Kinh phí năm Năm 2016 Năm 2017 Tổng kinh phí Được giao Đã sử dụng (3) = (5) + (7) 180.103.990 279.311.010 Đơn vị: đồng Tỷ lệ giải ngân (%) (4) = (6) + (8) 199.584.990 265.812.750 Được giao (5) Đã sử dụng (6) Được giao (7) Đã sử dụng (8) 80.352.800 147.417.200 99.833.800 122.982.750 99.751.190 131.893.810 99.751.190 142.830.000 (9) = (4) / (3) 110,8 95,2 0 0 0 40.585.000 500.000.000 30.223.062 495.620.802 22.230.000 250.000.000 23.598.312 246.414.862 18.355.000 250.000.000 6.624.750 249.205.940 74,5 99,1 96