Nghiên cứu phát triển phương pháp trắc quang xác định kháng sinh fluoroquinolone trong tôm và nước ao nuôi tôm

SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH TP HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ * BÁO CÁO NGHIỆM THU NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP TRẮC QUANG XÁC ĐỊNH KHÁNG SINH HỌ FLUOROQUINOLONE TRONG TÔM VÀ NƯỚC AO NUÔI TÔM CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: TRƯƠNG LÂM SƠN HẢI CƠ QUAN CHỦ TRÌ: TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH TP HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ TRẺ * BÁO CÁO NGHIỆM THU NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP TRẮC QUANG XÁC ĐỊNH KHÁNG SINH HỌ FLUOROQUINOLONE TRONG TÔM VÀ NƯỚC AO NUÔI TÔM Thủ trưởng Chủ nhiệm đề tài Cơ quan chủ trì đề tài (Họ tên chữ ký) (Họ tên, chữ ký, đóng dấu) Trương Lâm Sơn Hải Giám đốc Sở Khoa học Công nghệ Chủ tịch Hội đồng xét duyệt MỤC LỤC Trang TÓM TẮT ABSTRACT DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ PHẦN MỞ ĐẦU CHƯƠNG I TỔNG QUAN - - 1.1 Tổng quan vấn đề nghiên cứu nước _ - - 1.2 Tính chất hố lý FQs - - 1.2.1 Tính chất vật lý _ - 1.2.2 Tính chất acid-base - 1.3 Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài - - 1.3.1 Các cơng trình nghiên cứu giới _ - 1.3.2 Các cơng trình nghiên cứu nước - 1.4 Cơ sở phương pháp _ - - 1.4.1 Thực phản ứng lên màu _ - 1.4.2 Xử lý mẫu _ - 1.5 Ứng dụng triển khai phân tích mẫu thật - - CHƯƠNG II 2.1 THỰC NGHIỆM - - Hóa chất dụng cụ thiết bị - - 2.1.1 Thiết bị - 2.1.2 Hóa chất _ - 2.2 Khảo sát phương pháp trắc quang _ - 10 - 2.2.1 Khảo sát bước sóng hấp thu cực đại - 10 2.2.2 Khảo sát nồng độ Ce (IV) - 10 2.2.3 Khảo sát nồng độ IC - 10 2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng acid sulfuric - 11 - 2.2.5 Khảo sát thời gian phản ứng chuẩn Ce4+ - 11 2.2.6 Khảo sát thời gian phản ứng Ce4+ thuốc thử IC - 11 2.2.7 Xây dựng đường chuẩn xác định LOD & LOQ phương pháp _ - 11 2.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu tơm _ - 12 - 2.3.1 Khảo sát thể tích chiết _ - 13 2.3.2 Khảo sát khối lượng bột C18 - 13 2.3.3 Khảo sát thể tích rửa giải _ - 14 2.3.4 Khảo sát ổn định phương pháp _ - 14 2.3.5 Đánh giá ảnh hưởng mẫu lên hiệu suất thu hồi _ - 14 2.4 Khảo sát quy trình xử lý mẫu nước _ - 14 - 2.4.1 Khảo sát hệ số làm giàu mẫu - 15 2.4.2 Khảo sát khối lượng bột chiết _ - 15 2.5 Triển khai phân tích mẫu nước ao ni tơm tơm khu vực Cần Giờ - 16 - CHƯƠNG III KẾT QUẢ & BIỆN LUẬN _ - 17 3.1 Phương pháp trắc quang _ - 17 - 3.1.1 Khảo sát bước sóng _ - 17 3.1.2 Khảo sát nồng độ cerium (IV) sulfate _ - 18 3.1.3 Khảo sát nồng độ indigo carmine - 19 3.1.4 Khảo sát nồng độ acid _ - 20 3.1.5 Khảo sát thời gian phản ứng FQs thuốc thử Ce (IV). - 21 3.1.6 Khảo sát thời gian phản ứng Ce (IV) thuốc thử IC _ - 22 3.1.7 Xây dựng đường chuẩn xác định LOD & LOQ _ - 23 3.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu tôm - 24 - 3.2.1 Khảo sát thể tích dung mơi chiết mẫu _ - 24 3.2.2 Khảo sát lượng bột C18 - 25 3.2.3 Khảo sát thể tích rửa giải _ - 26 3.2.4 Khảo sát ổn định phương pháp _ - 27 3.2.5 Đánh giá ảnh hưởng mẫu lên hiệu suất thu hồi _ - 27 3.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu nước ao ni tơm - 28 - 3.3.1 Khảo sát thể tích nạp mẫu - 28 3.3.2 Khảo sát khối lượng bột C18 - 28 3.4 Kết triển khai thực nghiệm - 29 - CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ _ - 31 4.1 Kết luận _ - 31 - 4.2 Đề nghị - 31 - TÓM TẮT Mục tiêu nghiên cứu phát triển phương pháp trắc quang xác định kháng sinh họ fluoroquinolone (FQs) tôm nước ao nuôi tôm Nguyên tắc phương pháp dựa phản ứng tạo màu chất oxi hóa Cerium (IV) sulphate với thuốc thử indigo carmine (IC) FQs phản ứng với lượng dư Cerium (IV) sulphate, lượng lại phản ứng tiếp tục với lượng cố định IC, đo độ hấp thu quang 610 nm Hàm lượng Cerium (IV) sunfat phản ứng tương ứng với nồng độ FQs dung dịch mẫu, yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng nghiên cứu Độ hấp thu tuân theo định luật Beer khoảng 0.5 – 5.0 µg mL-1 với hệ số tương quan tốt 0.996 Phương pháp đánh giá độ xác độ Giá trị độ lặp lại không vượt 2.3% Phương pháp ứng dụng để phát mẫu dương tính âm tính dễ dàng Tuy nhiên, khơng thể phát nồng độ thấp 100 µg L-1 Trong trường hợp xác nhận lại phương pháp sắc ký lỏng ghép nối đầu dò khối phổ (HPLC – MS) UV (HPLC – UV) ABSTRACT The objective of this study is to develop a method for determination of fluoroquinolone antibiotic (FQs) in shrimp and water pond The method is described for the determination of FQs in shrimp and in formulations using cerium (IV) sulphate as the oxidimetric agent and indigo carmine (IC) as chromogenic agents FQs is treated with a known excess of cerium (IV) sulphate and the residual oxidant is determined by treating with a fixed amount of either IC and measuring the absorbance at 610 nm The amount of cerium (IV) sulphate reacted corresponds to the CIP concentration in the sample solution Differenct variables affecting the reaction were carefully studied Beer’s law correlating the absorbance with concentration was obeyed in the range of 0.5 – µg mL-1, with good correlation coefficient 0.996 The method was validated in terms of accuracy, precision and ruggedness Reproducibility values did not exceed 2.3 % (coefficient of variation) for the shrimp and water pond The results obtained by the proposed method was detect negative and positive reaction easily, however, it could not detect at lower than 100 µg L-1, therefore, it has to be confirmed by certain instruments such as HPLC and liquid chromatography mass spectrometry (HPLC – MS) or UV detector (HPLC – UV ) DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACN: acetonitrile MeOH: methanol NH3: amoniac HPLC: High performance liquid chromatography – sắc ký lỏng hiệu cao CIP: ciprofloxacin ENR: enrofloxacin DANO: danofloxacin IC: indigo carmine MO: methyl orange FQ: Flourquinolone LOD: Limit of detection DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Công thức cấu tạo giá trị pKa FQs nghiên cứu đề tài - Bảng 2: Dư lượng tối đa (MRL) FQs số quốc gia - Bảng 3: Danh mục kháng sinh hạn chế sử dụng sản xuất kinh doanh thủy sản- Bảng 4: Cách pha dung dịch FQs để xây dựng đường chuẩn - 11 Bảng 5: Kết khảo sát nồng độ Ce4+ - 18 Bảng 6: Kết khảo sát nồng độ IC - 19 Bảng 7: Số liệu khảo sát acid phương pháp IC - 21 Bảng 8: Kết khảo sát thời gian phản ứng chuẩn Ce4+ - 22 Bảng 9: Kết khảo sát thời gian phản ứng Ce4+ IC - 22 Bảng 10: Kết đường chuẩn hỗn hợp chuẩn riêng lẽ - 24 Bảng 11: Số liệu khảo sát chiết mẫu qua ngày - 27 Bảng 12: Số liệu khảo sát chiết mẫu qua ngày mẫu giả - 27 Bảng 13: Kết kiểm tra đối chứng mẫu nước ao nuôi tôm - 29 Bảng 14: Kết kiểm tra đối chứng mẫu tôm - 30 - DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1: Cân acid-base acid quinolone - Hình 2: Cân acid base FQs - Hình 3: Sơ đồ quy trình xử lý mẫu tôm phương pháp trắc quang - 13 Hình 4: Sơ đồ quy trình xử lý mẫu nước ao nuôi tôm - 15 Hình 5: Đồ thị khảo sát bước sóng - 17 Hình 6: Phương trình phản ứng cerium (IV) sulfate CIP - 18 Hình 7: Đồ thị khảo sát nồng độ Ce (IV) - 19 Hình 8: Đồ thị khảo sát nồng độ IC - 20 Hình 9: Đồ thị khảo sát nồng độ H2SO4 - 21 Hình 10: Đồ thị thể suy giảm tín hiệu thay đổi thời gian phản ứng FQs Ce4+ - 22 Hình 11: Đồ thị Khảo sát thời gian phản ứng Ce (IV) IC - 23 Hình 12: Đồ thị khảo sát khoảng tuyến tính đường chuẩn - 23 Hình 13: Đồ thị chuẩn hỗn hợp chuẩn riêng lẽ - 24 Hình 14: Đồ thị khảo sát thể tích chiết mẫu - 25 Hình 15: Đồ thị khảo sát khối lượng bột C18 - 26 Hình 16: Đồ thị khảo sát thể tích rửa giải - 27 Hình 17: Đồ thị biễu diễn thay đổi thể tích nạp mẫu khác - 28 Hình 18: Đồ thị khảo sát khối lượng bột C18 - 29 - Hình PL8: Sắc ký đồ mẫu ao trước thả tơm vị trí Hình PL9: Sắc ký đồ mẫu ao sau thả tôm ngày vị trí Hình PL10: Sắc ký đồ mẫu ao thả tơm sau 20 ngày vị trí Hình PL11: Sắc ký đồ mẫu ao thả tôm sau 30 ngày vị trí Hình PL12: Sắc ký đồ mẫu ao thả tơm sau 60 ngày vị trí Hình PL13: Sắc ký đồ mẫu ao thả tơm sau 90 ngày vị trí Hình PL14: Sắc ký đồ mẫu ao thả tôm sau 120 ngày vị trí Hình PL15: Sắc ký đồ mẫu sau thun hoạch ngày vị trí 10 Hình PL16: Sắc ký đồ mẫu tơm Chợ Bình Khánh Hình PL17: Sắc ký đồ mẫu tơm Chợ Nhà Bè Hình PL18: Sắc ký đồ mẫu tôm sau thả 120 ngày Hình PL19: Sắc ký đồ mẫu tơm sau thả 130 ngày Hình PL20: Sắc ký đồ mẫu tơm lúc thu hoạch PHỤ LỤC SẢN PHẨM PHỤ LỤC SẢN PHẨM (Báo cáo treo Hội nghị Khoa học trường Đại học Khoa học Tự nhiên IX – 2014 ) PHỤ LỤC SẢN PHẨM Bằng tốt nghiệp sinh viên Phạm Hồng Quang PHỤ LỤC SẢN PHẨM Trang bìa tên đề tài tốt nghiệp sinh viên Phạm Hồng Quang PHỤ LỤC SẢN PHẨM 4: QUY TRÌNH PHÂN TÍCH MẪU TƠM Cân gram mẫu tơm nghiền mịn trích ly mL dung dịch % acid formic dung mơi acetonitrile Dịch trích làm kỹ thuật chiết pha rắn C18 (200 mg bột) Tuy nhiên trước nạp dịch chiết lên cột chiết pha rắn pha loãng dịch chiết nước để hạn chế q trình chất phân tích nạp lên cột SPE Rửa giải với mL hỗn hợp MeOH: NH3đđ (85:15) Dung dịch rửa giải tiến hành thêm Ce (IV), IC, H2SO4 để thực phản ứng lên màu đo quang bước sóng 610 nm PHỤ LỤC SẢN PHẨM 5: QUY TRÌNH PHÂN TÍCH MẪU NƯỚC AO NI TƠM 100 mL mẫu nước ao nuôi tôm, lọc sơ qua màng lọc cellulose ϕ 11, tiếp tục lọc qua màng lọc GF/F 0.7 µm 100 mL mẫu sau lọc nạp qua cột chiết pha rắn (200 mg bột pha rắn với pha tĩnh C18) Lưu ý trước nạp mẫu qua cột chiết cột cần hoạt hóa với mL MeOH mL H2O Rửa giải với mL hỗn hợp MeOH : NH3đđ (85:15) Thổi khơ với khí trơ đến thể tích 1mL Dung dịch rửa giải tiến hành thêm Ce(IV), IC, H2SO4 để thực phản ứng lên màu đo quang bước sóng 610 nm PHỤ LỤC QUẢN LÝ