Nghiên cứu phân lập và sàng lọc chủng vi khuẩn chịu mặn sinh ENZYME ngoại bào từ nước ao nuôi tôm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC CÁC CHỦNG VI KHUẨN CHỊU MẶN SINH ENZYME NGOẠI BÀO TỪ NƯỚC AO NUÔI TÔM Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : Th.S PHẠM MINH NHỰT Sinh viên thực : TRẦN HỮU THÀNH MSSV: 1611100045 Lớp: 16DSHA2 TP Hồ Chí Minh, 2020 Đồ án tốt nghiệp CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp công trình nghiên cứu thân tơi hướng dẫn Th.S PHẠM MINH NHỰT viện khoa học ứng dụng Hutech chuyên ngành Công nghệ sinh, Trường Đại học Cơng Nghệ Tp Hồ Chí Minh Những kết có đồ án hồn tồn khơng chép từ đồ án tốt nghiệp người khác hình thức Các số liệu trích dẫn đồ án tốt nghiệp hoàn toàn trung thực Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm đồ án TP HCM, ngày 30 tháng 09 năm 2020 Sinh viên thực TRẦN HỮU THÀNH i Đồ án tốt nghiệp LỜI CÁM ƠN Để hoàn thành báo cáo này, trước tiên em xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Cơng nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, lãnh đạo phòng Đào tạo Đại học Ban Chủ nhiệm Viện Khoa học ứng dụng HUTECH lời cảm ơn sâu sắc, niềm tự hào học tập Trường năm qua Bên cạnh đó, để hoàn thành báo cáo này, em xin chân thành cảm ơn ThS Phạm Minh Nhựt bên cạnh em, cảm ơn thầy tận tình dạy em, cho em thêm động lực niềm tin để phấn đấu hồn thành tốt đề tài Em xin chân thành cảm ơn anh chị, bạn làm cơng tác nghiên cứu Phịng thí nghiệm Viện Khoa học Ứng dụng HUTECH giúp đỡ em nhiệt tình suốt trình thực tập trung tâm Cuối em xin bày tỏ lòng biết ơn gia đình, người thân bạn bè em, quan tâm sâu sắc, chia sẻ khó khăn q trình thực tập hồn thành báo cáo thật tốt Trong q trình hồn thiện báo cáo khơng tránh khỏi thiếu sót định mà em chưa thể khắc phục nên em mong nhận góp ý q thầy để đề tài hoàn chỉnh Em xin chân thành cảm ơn TP HCM, ngày 30 tháng 09 năm 2020 Sinh viên TRẦN HỮU THÀNH ii Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CÁM ƠN ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vii DANH MỤC CÁC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH ix MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu ngành nuôi trồng thủy sản tỉnh Trà Vinh 1.2 Khó khăn ngành ni trồng thủy sản 1.2.1 Ảnh hưởng dịch bệnh 1.2.1.1 Bệnh virus 1.2.1.2 Bệnh vi khuẩn 1.2.2 Ảnh hưởng môi trường nước 12 1.2.2.1 Ô nhiễm từ nguồn Nitơ .12 1.2.2.2 Ô nhiễm từ lớp bùn hình thành 13 1.2.2.3 Ơ nhiễm từ mơi trường tự nhiên 13 1.2.2.4 Một số nguyên nhân khác 13 1.3 Tổng quan vi khuẩn Bacillus velezensis 14 1.3.1 Giới thiệu vi khuẩn Bacillus velezensis 14 1.3.2 Lịch sử phát 15 1.3.3 Phân loại 16 1.3.4 Đặc điểm nuôi cấy 16 1.3.5 Thành tế bào chi Bacillus 17 1.3.6 Sự xuất Bacillus velezensis từ tổ hợp loài Bacillus subtilis 17 1.4 Tổng quan cellulase 18 1.4.1 Giới thiệu cellulase 18 1.4.2 Cơ chế hoạt động enzyme cellulase 19 iii Đồ án tốt nghiệp 1.4.3 Ứng dụng enzyme cellulase 20 1.5 Tổng quan Enzyme Amylase 21 1.5.1 Enzyme -Amylase (-1,4-glucanohydrolase) (EC 3.2.1.1): 21 1.5.2 Enzyme β-Amylase (β-1,4-glucan-maltohydrolase) (EC 3.2.1.2): 23 1.5.3 Enzyme γ-Amylase (glucoamylase) (EC 3.2.1.3): 24 1.5.4 Oligo 1,6-glucosidase (dextrinase tới hạn) (EC 3.2.1.10) 25 1.5.5 Enzyme pullulanase (α-dextrin6-glucosidase) (EC 3.2.1.41) 25 1.5.6 α-glucosidase hay maltase (α-D,glucoside-glucohydrolase)(EC 3.2.1.20) 25 CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊM CỨU 27 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 27 2.1.1 Thời gian 27 2.1.2 Địa điểm thu mẫu 27 2.1.3 Địa điểm tiến hành nghiên cứu 27 2.2 vật liệu 27 2.2.1 Nguồn mẫu 27 2.2.2 Hóa chất mơi trường 28 2.2.2.1 Hóa chất .28 2.2.2.2 Môi trường 28 2.2.3 Dụng cụ thiết bị 29 2.2.3.1 Dụng cụ 29 2.2.3.2 Thiết bị 29 2.3 Phương pháp nghiên cứu 29 2.3.1 Phương pháp thu mẫu xử lý mẫu 29 2.3.2 Phương pháp phân lập 29 2.3.3 Phương pháp nhuộm Gram 29 2.3.4 Phương pháp bảo quản giữ giống vi sinh vật 30 2.3.4.1 Phương pháp cấy chuyển vi sinh vật 30 iv Đồ án tốt nghiệp 2.3.4.2 Phương pháp bảo quản lạnh sâu .31 2.3.5 Phương pháp đánh giá khả sinh enzyme amylase 31 2.3.6 Phương pháp đánh giá khả sinh enzyme caseinase 32 2.3.7 Phương pháp đánh giá khả sinh enzyme lipase 33 2.3.8 Phương pháp đánh giá khả sinh enzyme cellulase 34 2.3.9 Phương pháp đánh giá khả sinh enzyme gelatinase 36 2.3.10 Phương pháp định danh 37 2.3.10.1 Định danh phản ứng sinh hóa 37 2.3.10.2 Định danh sinh học phân tử 46 2.3.11 Phương pháp xử lí số liệu 46 2.4 Bố trí thí nghiệm 47 2.4.1 Thí nghiệm 1: Phân lập đinh danh sơ vi khuẩn 48 2.4.1.1 Quy trình phân lập .48 2.4.1.2 Định danh sơ chủng vi khuẩn 49 2.4.2 Thí nghiệm 2: Sàng lọc khả sinh enzyme ngoại bào chủng sau phân lập 49 2.4.3 Thí nghiệm 3: Định danh chủng vi khuẩn sau sàng lọc 49 2.4.3.1 Định danh phản ứng sinh hóa 49 2.4.3.2 Định danh sinh học phân tử 50 2.4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình tăng trưởng vi khuẩn 50 2.4.4.1 Đánh giá khả chịu măn vi khuẩn 50 2.4.4.2 Đánh giá khả chịu pH vi khuẩn 51 2.4.4.3 Đánh giá khả chịu nhiệt vi khuẩn .51 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52 3.1 Kết phân lập từ nguồn mẫu nước ao nuôi tôm 52 3.2 Kết đánh giá khả sinh enzyme ngoại bào chủng vi khuẩn sau phân lập 59 v Đồ án tốt nghiệp 3.2.1 Kết đánh giá khả sinh enzyme cellulase chủng vi khuẩn sau phân lập 59 3.2.2 Khả sinh enzyme amylase chủng vi khuẩn sau phân lập 60 3.2.3 Kết khả sinh enzyme gelatinase chủng vi khuẩn sau phân lập 62 3.2.4 Kết khả sinh enzyme lipase enzyme caseinase chủng vi khuẩn sau phân lập 63 3.3 Kết định chủng vi khuẩn K5 65 3.3.1 Đinh danh sinh hóa chủng vi khuẩn K5 65 3.3.2 Kết định danh chủng vi khuẩn K5 phương pháp giải trình tự 16S rDNA 66 3.4 Kết khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh trưởng chủng Bacillus velezensis 66 3.4.1 Kết đánh giá khả chịu mặn chủng Bacillus velezensis 66 3.4.2 Kết đánh giá khả chịu pH chủng Bacillus velezensis 68 3.4.3 Kết đánh giá khả nhiệt chủng Bacillus velezensis 69 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 71 4.1 Kết luận 71 4.2 Kiến nghị 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO 72 PHỤ LỤC 74 vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DNA : Deoxyribonucleic acid PCR : Polymerase Chain Reaction NCBI : National Center for Biotechnology Information SAS : Statistical Analysis Systems RNA : Ribonucleic acid VSV : Vi sinh vật NA : Nutrient Agar NB : Nutrient Broth VP : Voges - Prokauer MR : Methyl Red ĐBSCL : Đồng sông Cửu Long vii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Các nguồn mẫu sử dụng nghiên cứu 27 Bảng 2.2: Thử nghiệm phản ứng sinh hóa 50 Bảng 3.1: Kết phân lập vi khuẩn từ ao nuôi tôm 52 Bảng 3.2: Đường kính vịng phân giải CMC chủng vi khuẩn phân (mm) 59 Bảng 3.3: Đường kính vịng phân giải tinh bột chủng vi khuẩn phân lập (mm) 61 Bảng 3.4: Khả sinh enzyme gelatinase chủng vi khuẩn phân lập 61 Bảng 3.5: đường kính vịng phần giải casein lipid chủng vi khuẩn phân lập (mm) 64 Bảng 3.6: Đặc điểm hình thái, sinh hóa chủng vi khuẩn 65 viii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Virus đốm trắng (WSSV) Hình 1.2: Virus Monodon Baculovirus (MBV) Hình 1.3: Yellow Head Virus (YHV) Hình 1.4: Taura Syndrome Virus (TSV) Hình 1.5: Bệnh phát sáng tơm thẻ 10 Hình 1.6: Bệnh hoại tử gan tụy tơm 11 Hình 1.7: Tơm bị bệnh vi khuẩn dạng sợi gây 12 Hình 1.8: Tế bào vi khuẩn Bacillus velezensis quan sát kính hiển vi 16 Hình 1.9: Cấu trúc khơng gian phân tử cellulose 18 Hình 1.10: Cấu trúc phân tử cellulose 18 Hình 1.11: Cơ chế tác động enzyme cellulase 20 Hình 2.1: Nguồn mẫu thu từ ao nuôi tôm huyện Duyên Hải, tỉnh Trà Vinh 28 Hình 2.2: Vịng phân giải tinh bột vi khuẩn mơi trường Starch Agar 32 Hình 2.3 Vịng phân giải casein vi khuẩn mơi trường Skim Milk Agar 33 Hình 2.4 Vịng phân giải Tween vi khuẩn môi trường Tween Peptone Agar 34 Hình 2.5: Vịng phân giải cellulose vi khuẩn môi trường CMC Agart 36 Hình 2.6: Kết âm tính dương tính thử nghiệm gelatinase 37 Hình 2.7: Thử nghiệm Catalase 38 Hình 2.8: Kết âm tính dương tính thử nghiệm di động 39 Hình 2.9 Thử nghiệm Voges Proskauer 40 Hình 2.10 Thử nghiệm TSI 42 Hình 2.11 Thử nghiệm Citrate 43 Hình 2.12: Thử nghiệm Nitrate 45 Hình 2.13: Thử nghiệm Indole 46 Hình 2.14: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 47 ix Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Với loại mẫu nước thu ao nuôi tôm Trà Vinh ta phân lập 28 chủng vi khuẩn có 12 chủng Gram dương 16 chủng Gram âm - Tiến hành sàng lọc khả sinh enzyme ngoại bào 12 chủng vi khuẩn Gram dương có chủng vi khuẩn K5, S2, T1(5), N4, N5, L6 sinh enzyme cellulase, có chủng vi khuẩn K5, S2, T1(5), L6 sinh enzyme amylase có chủng vi khuẩn K5, S2, T1(5), T1(1), L2 sinh enzyme gelatinase - Chủng vi khuẩn K5 có khả sinh enzyme cellulase, amylas, gelatinase mạnh - Sau định danh phương pháp giải trình tự 16S rDNA mẫu K5 phân lập chủng vi khuẩn chủng Bacillus velezensis - Qua thử nghiệm khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình tăng trưởng chủng vi khuẩn Bacillus velezensi Chủng vi khuẩn Bacillus velezensi có khả chịu mặn nồng độ 7%, tăng trưởng nồng độ pH 5,0 - pH 7,0 Có khả chịu nhiệt 50OC Tăng trưởng tốt nồng độ NaCl 2%, Nồng độ pH 5,0 nhiệt độ 30OC 4.2 Kiến nghị - Tiếp tục khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng chủng vi khuẩn S2 chủng vi khuẩn T1(5) - Tiến hành khảo sát đến yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh enzyme chủng Bacillus velezensis Chủng vi khuẩn S2 chủng vi khuẩn T1(5) - Tiến hành định danh củng vi khuẩn S2 chủng vi khuẩn T1(5) phương pháp giải trình tự 16S rDNA - Nghiên cứu điều kiện trình khả hoạt động enzyme môi trường nước nuôi tôm - Tiếp tục phân lập thêm chủng vi sinh vật có khả sinh enzyme ngoại bào từ nguồn nước thải chế biến thủy sản khác 71 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO A Tài liệu tiếng việt [1] Bài tiểu luận Enzyme Amylase - Sinh viên thực (Nguễn Lê Hoàng, Hoàng Ngọc Duy Quang, Nguyễn Thị Kim Vân, Nguyễn Ngọc Trung, Lê Nguyễn Nhân Luân [2] Đồ án Phân lập tuyển chọn số chủng vi sinh vật có khả sinh Enzyme Cellulase từ rong giấy Hòn Chồng - Nha Trang [3] Tài liệu môn Phương pháp khiểm nghiệm vi sinh vật thực phẩm - Th.s Nguyễn Tiến Dũng [4] Đỗ Thị Thanh Dung, Lê Thanh Bình, Hồng Thị Đăng Dương, Tuyển chọn chủng Bacillus spp.sinh enzyme kháng Vibrio parahaemolyticus gây hội chứng chết sớm (EMS) tơm, Tạp chí phát triển khoa hoc & cơng nghệ: chuyên sản khoa học tự nhiên, tập 1, số 6, 2017 [5] Nguyễn Thị Thu Thủy, Nguyễn Tiến Long, Trần Thanh Đức , Phân lập, tuyển chọn định danh vi khuẩn có khả phân giải cellulose để sản xuất phân hữu vi sinh, Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế, 102 Phùng Hưng, Huế, Việt Nam [6] Trần Bảo Trâm, Phạm Hương Sơn, Nguyễn Thị Hiền, Ngơ Thị Hoa, Nguyễn Thu Hiền, Nguyễn Huy Hồng - Phân lập xác định số đặc điểm sinh học vi khuẩn phân giải cellulose từ đất trồng sâm ngọc linh Quảng Nam, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 14: 55-61, 2016 [7] Nguyễn Hữu Hiệp Nguyễn Thị Hải Lý - Phân lập dòng vi khuẩn có khả phân hủy tinh bột, Tạp chí Khoa học 2012:21a 37-44 [8] Nguyễn Hoàng Anh, Nguyễn Thị Thanh Thủy, Nguyễn Vĩnh Hoàng - phân lập, tuyển chọn vi khuẩn bacillus spp Từ cỏ bị có khả sinh enzyme -glucanase bước đầu xác định đặc tính enzyme, Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2017, tập 15, số 1: 85-91 [9] Nguyễn Thị Minh, Đỗ Minh Thu - Nghiên cứu phân lập tuyển chọn vi sinh vật nội sinh từ vùng sinh thái đất mặn huyện giao thủy, tỉnh Nam Định, 72 Đồ án tốt nghiệp Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2017, 15(8): 1022-1032 [10] Nguyễn Văn Phúc, Phan Thị Phượng Trang - Phân lập, định danh xác định đặc tính có lợi chủng Bacillus spp từ ao nuôi tôm tỉnh Bến Tre, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh [11] Nguyễn Văn Quyên, Nguyễn Quang Thảo, Nguyễn Thảo Anh, Nguyễn Thành Đạt - nghiêm cứu ảnh hưởng số yếu tố đến sinh trưởng chủng Saccharomyces cerevisiae MS42, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 14(3): 523-532, 2016 [12] TS Trần Minh Chí, Ông Mà Song Nguyễn - Nghiên cứu ứng dụng công nghệ vi sinh để xử lý nước thải nhiễm mặn, Trung tâm Thông tin Khoa học Công nghệ TP.HCM [13] Trần Ngọc Diễm My, Nguyễn Trọng Nhân - Khảo sát diện vi sinh vật phân giải cellulose dày còng Perisesarma eumolpe khu vực gãy đổ thuộc rừng ngập mặn Cần Giờ B Tài liệu Internet [14] https://thuysan247.com/hoi-chung-dom-trang-do-virus-wssv [15] https://thuysan247.com/benh-coi-mbv-tren-tom-su [16] https://nanotomca.com/benh-mbv-benh-coi [17] https://drtom.vn/benh-phat-sang-o-tom.html [18] https://sinhhoctomvang.vn/tin-tuc/hoi-chung-hoai-tu-gan-tuy-cap- tren-tom-nuoc-lo 73 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC PHỤ LỤC A: THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG VÀ MƠI TRƯỜNG THỬ SINH HĨA TRONG CÁC THÍ NGHIỆM 1.1 Thành phần môi trường tăng sinh NB (Nutrient broth) Thành phần Khối lượng (g/l) Pepton Cao thịt NaCl 15 1.2 Thành phần môi trường Nutrient Agar Thành phần Khối lượng (g/l) Pepton Cao thịt NaCl 15 Agar 20 1.3 Thành phần môi trường Strach Agar Thành phần Khối lượng (g/l) Pepton Cao thịt Tinh bột tan Agar 25 74 Đồ án tốt nghiệp 1.4 Thành phần môi trường CMC Agar Thành phần Khối lượng (g/l) NaNO3 K2HPO4 MgSO4 0,5 KCl 0,5 CMC Peptone 0,2 Agar 25 1.5 Thành phần môi trường Skim Milk Agar Thành phần Khối lượng (g/l) Skim milk 28 Peptone Yeast Extract 2,5 D – Glucose Agar 25 1.6 Thành phần môi trường Nutrient Gelatin Thành phần Khối lượng (g/l) Peptone NaCl Cao Thịt 1,5 Cao nấm men 1,5 Gelatin 120 75 Đồ án tốt nghiệp 1.7 Thành phần môi trường Tween-pepton Agar Thành phần Khối lượng (g/l) Peptone 10 NaCl CaCl2 0,1 Tween 80 Agar 25 1.8 Thành phần môi trường Tryptone Thành phần Khối lượng (g/l) Tryptone 10 NaCl 76 Đồ án tốt nghiệp PHỤC LỤC B: HÌNH ẢNH Hình B.1: Kết thử nghiệm di động Hình B.2: Kết thử nghiệm catalase 77 Đồ án tốt nghiệp Hình B.3: Kết thử nghiệm MR-VP 78 Đồ án tốt nghiệp Hình B.4: Kết thừ nghiệm Indol Hình B.5: Kết thử nghiệm Nitrate 79 Đồ án tốt nghiệp Hình B.6: Kết thừ nghiệm Citrate Hình B.7: Kết thừ nghiệm TSI 80 Đồ án tốt nghiệp PHỤC LỤC C: KẾT QUẢ ĐỊNH DANH 16S 81 Đồ án tốt nghiệp 82 Đồ án tốt nghiệp 83 Đồ án tốt nghiệp 84 Đồ án tốt nghiệp 85 ... tìm kiếm chủng sinh enzyme mạnh có khả chịu mặn, chịu nhiệt tốt Nội dung nghiên cứu − Phân lập chủng vi khuẩn có khả sinh enzyme ngoại bào từ ao nuôi tôm tỉnh Trà Vinh − Sàng lọc chủng vi khuẩn. .. phân lập, sàng lọc chủng vi khuẩn địa có khả sinh enzyme ngoại bào tốt, có khả ứng dụng điều kiện Vi? ??t Nam Mục tiêu Phân lập sàng lọc chủng vi khuẩn có khả sinh enzyme ngoại bào từ số nguồn nước. .. cân sinh học Đồ án tốt nghiệp Chính vậy, đề tài ? ?Nghiên cứu phân lập sàng lọc chủng vi khuẩn chịu mặn sinh enzyme ngoại bào từ ao nuôi tôm tỉnh Trà Vinh” thực để giải vấn đề trên, tìm kiếm, phân