Phân lập, tuyển chọn và định danh vi khuẩn tía không lưu huỳnh, thử nghiệm khả năng xử lý sulfide trong nước ao nuôi tôm tại huyện kiên lương, tỉnh kiên giang

TẠP CHÍ CÍING THƯƠNG PHÂN LẬP, TUYẾN CHỌN VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN TÍA KHƠNG LƯU HUỲNH, THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG xử LÝ SULFIDE TRONG NƯỚC AO NUÔI TÔM TẠI HUYỆN KIÊN LƯƠNG, TỈNH KIÊN GIANG • TRẦN VIỆT QUYỀN - TRẦN HỒNG KHANG - TRẦN VĂN BÉ TĨM TẮT: Nghiên cứu tiến hành phân lập vi khuẩn tía không lưu huỳnh từ mẫu nước bùn ao nuôi tôm huyện Kiên Lương, tỉnh Kiên Giang Khảo sát khả xử lý sulfide khả chịu mặn chủng vi khuẩn phân lập điều kiện khơng sục khí ánh sáng tự nhiên, định danh dịng vi khuẩn có khả xử lý tốt sulfide nước Kết cho thấy phân lập chủng vi khuẩn xã Ba Hịn, Bình An, Kiên Sơn thuộc huyện Kiên Lương, tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả xử lý sulfide tốt BH2 (31.7%), BH3 (39.5%), BAI (30.8%) KS2 (45.47%), tuyển chọn chủng có khả chịu mặn xử lý tốt sulfide KS2, chủng định danh hình thái sinh học phân tử lồi Rhodovulum suựidophiỉum Từ khóa: vi khuẩn tía khơng lưu huỳnh, Rhodovulum sulfidophilum, phân lập, tuyển chọn, huyện Kiên Lương, tỉnh Kiên Giang l Đặt vân đề Ni trồng thủy sản nước ta có bước phát triển đáng kể diện tích sản lượng ni năm vừa qua, đóng góp phần khơng nhỏ việc phát triển kinh tế đất nước Tại tỉnh Kiên Giang, theo số liệu thơng kê năm 2016, tồn tỉnh có 142 nghìn ni trồng thủy sản diện tích nuôi trồng thủy sản nước mặn nước lợ 129 nghìn chiếm 90% tổng diện tích (Niên giám thống kê tỉnh Kiên Giang, 2016), điều cho thấy ngành Thủy sản Kiên Giang có lợi lớn thủy sản nước mặn Bên cạnh thành đạt được, ngành 380 SỐ 10 - Tháng 5/2022 Ni trồng thủy sản đốì mặt với nhiều khó khăn, sơ vấn đề ô nhiễm môi trường nước, ô nhiễm dạng hữu đặc biệt sulfide, tác nhân gây chết đốì với động vật nuôi trồng thủy sản chất gây mùi hôi thối (Mỵ Trần Hương Trà, 2015) Sulfide tạo từ thức ăn dư thừa chất thải sinh vật, chúng tích tụ đáy ao hồ chuyển hóa thành dạng khí vi sinh vật Tính độc sulfide chủ yếu ức chế enzyme cytochrome c oxidase, với tạo điều kiện thuận lợi cho phát triển vi khuẩn lây nhiễm môi trường sống thủy sinh vật (Bourgeois and Felder, 2001) HÓA HỌC - CƠNG NGHỆ THựC PHẨM Trong sơ' vi sinh vật có liên quan đến chu trình carbon, nitơ sulphur hồ ni thủy sản, vi khuẩn tía khơng lưu huỳnh đóng vai trị quan trọng việc cải thiện chất lượng nước Vi khuẩn tía khơng lưu huỳnh sinh trưởng phương thức quang tự dưỡng, quang dị dưỡng dị dưỡng tùy thuộc vào có mặt ánh sáng, oxy nguồn carbon thích hợp Điều có nghĩa chúng sử dụng chất hữu điều kiện có khơng có mặt ánh sáng mặt trời sơ' lồi loại bỏ H2S (Kornochalert et al, 2014) Hiện nay, thị trường Việt Nam có sản phẩm sinh học để loại bỏ sulfide hồ ni thủy sản sản phẩm có hiệu đóng vai trị quan trọng có giá thành cao sản phẩm khác lại không cho thấy hiệu (Đỗ Thị Liên ctv, 2014) Từ lý trên, đề tài: “Phân lập, tuyển chọn, định danh vi khuẩn tía khơng lưu huỳnh thử nghiệm khả xử lý sulfide nước ao nuôi tồm huyện Kiên Lương, tỉnh Kiên Giang” thực Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu nghiên cứu Mẫu bùn nước thu ao nuôi tôm xã thuộc huyện Kiên Lương, tỉnh Kiên Giang 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn Mẫu thu tăng sinh cách ni tích lũy chai nhựa hình trụ có kích thước = cm, h = 20 cm Các mẫu nước thải bùn đưa vào chai với tỷ lệ 1:1 đô'i với mẫu nước 9: với mẫu bùn Sau đó, bình làm đầy mơi trường DSMZ27 Các bình đậy kín ủ ánh sáng tự nhiên (Đỗ Thị Liên, 2016) Sau khoảng tuần, vạch màu từ nâu vàng đến đỏ tía xuất thành bình Dùng que cấy lấy mẫu từ vạch màu tiến hành phân lập đĩa petri chứa môi trường thạch DSMZ 27, ủ điều kiện kỵ khí với ánh sáng tự nhiên, sau khoảng 3-5 ngày xuất khuẩn lạc trịn có màu nâu, hồng đến đỏ tía Các khuẩn lạc tách rịng theo phương pháp cấy ria tiến hành ủ mẫu điều kiện kỵ khí, sáng 2.2.2 Xác định hàm lượng sulfide Thí nghiệm tiến hành dựa theo phương pháp Đỗ Thị Liên, 2016 Thí nghiệm bố trí hồn toàn ngẫu nhiên, lần lặp lại Mỗi chủng vi khuẩn nuôi cấy môi trường DSMZ 27 dịch thể có bổ sung 10 mgS‘2/l bình ni cấy 100ml Thí nghiệm tiến hành điều kiện kỵ khí với ánh sáng tự nhiên Nghiệm thức đơi chứng mơi trường DSMZ 27 có bổ sung 10 mgS'2/l khơng có vi khuẩn Hoạt tính khử sulfide xác định cách theo dõi hàm lượng sulfide lại mơi trường ni để tính hàm lượng sulfide tiêu thụ Xác định hiệu suất loại bỏ sulfide ngày thứ Xác định hàm lượng sulfide phương pháp iodine (Andrrew, 1994) sau: + Xác định sulfide dựa nguyên tắc xác định H2S muối tạo thành kết tủa CdS, PbS Hịa tan kết tủa dung dịch iot Sau chuẩn độ lượng iot dư thiosunfat + Lấy lượng nước có chứa từ 4- 20 mg sunfua Thêm vào lượng đủ cadmi axetat Để tĩnh kết tủa lắng xuống Lọc kết tủa rửa tủa cẩn thận nước nóng Kết tủa sau lọc rửa chuyển vào bình nón, dung tích 250 ml Thêm vào 25 4- 50 ml dung dịch iot 0,01 N axit hóa dung dịch ml axit clohidric Chuẩn độ lượng iot dư natri thiosunfat 0,01 N (ghi sô' ml) Hàm lượng H2S (x) tính mg/1 theo cơng thức: (a-b) 0,17.1000 X = V Trong đó: a-Lượng dung dịch iotO.Ol N, ml; b - Lượng dung dịch natri thiosunfat, ml; V - thể tích nước lấy để phân tích, ml; 0,17 - số mg H2S tương đương với ml dung dịch Íot0,01 N 2.2.2 Xác định khả chịu mặn Mỗi chủng vi khuẩn nuôi cấy 100ml môi trường DSMZ 27 dịch thể có bổ sung 10 mgS’2/l, điều kiện kỵ khí với ánh sáng tự nhiên với độ mặn bổ sung vào môi trường 10, 20, 30, 35%O Theo dõi mật số sinh trưởng SỐ 10 - Tháng 5/2022 381 TẠP CHÍ CƠNG THƯƠNG chủng vi khuẩn cách đếm buồng 2.2.4.2 Phương pháp xử lý sô' liệu đếm so sánh hiệu suất khử sulfide Xử lý thống kê sô' liệu phần mềm nghiệm thức ngày Excel SPSS 16 2.2.3 Định danh vi khuẩn quang hợp tía khơng Kết thảo luận 3.1 Phân lập tuyển chọn vi khuẩn tía khơng lưu huỳnh có khả xử lý tốt sulfide nước 2.23.1 Khảo sát hình thái tế bào lưu huỳnh Tổng cộng mẫu bùn nước thu Tế bào VKQH tía ni mơi trường dịch thể DSMZ 27 điều kiện yếm khí ống xã Kiên Sơn, Ba Hịn Bình An Qua q trình nghiệm, chiếu sáng từ - ngày Quan sát phân lập, thu chủng vi khuẩn có hình dạng hình thái tế bào kính hiển vi quang học với vật màu sắc khác trình bày Hình kính 100X Hình ĩ: Hình dạng chủng vi khuẩn phân lập 2.2.3.2 Xác định thành phần sắc tố Nuôi vi khuẩn quang hợp tía mơi trường dịch thể ngày, thu sinh khối, rửa tế bào nước cất huyền phù lại tế bào dịch dịch succrose 60% Dung dịch nồng độ cao chông lại tán xạ ánh sáng Phổ hấp thu ánh sáng cực đại sắc tô' tế bào xác định quét huyền phù tê' bào dãy bước sóng từ 190 - 1100 nm máy đo quang phổ 2.2.4 Nhuộm Gram Nhuộm Gram để xác định Gram vi khuẩn theo phương pháp Nguồn: Nhóm tác giả thực Hucker cải tiến 2.2.4.1 Giải trình tự gen 16S rRNA vi khuẩn Các chủng vi khuẩn thử nghiệm khả xử lý sulfide mơi trường nước giả định có bổ tía quang hợp Cặp mồi 01V 02R (Đỗ Thị Liên, 2016) sung 10mgS271 lấy số liệu ngày Kết sử dụng để khuếch đại đoạn gen 16S rRNA có trình hàm lượng sulfide cịn lại sau ngày trình bày tự sau: Bảng Mồi xuôi: 01V Kết cho thấy có chủng vi khuẩn có khả ’ - AG AGTTTGATC ATGGCTC AG-3 ’ làm giảm hàm lượng sulfide khác biệt có ý Mồi ngược: 02R nghĩa thống kê so với đối chứng ngày ’ - AAGGAGGTGATCCAGCC-3 ’ khảo sát chủng KS2 BH3 Chủng BH2 Các sản phẩm PCR sau khuếch đại KS1 có hiệu làm giảm hàm lượng sulfide giải trình tự máy giải trình tự tự động khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng kể Sau giải trình tự gen 16S rRNA, so sánh trình tự từ ngày khảo sát thứ Chủng BH1 BAI có với GenBank công bô' ngân hàng liệu hiệu làm giảm hàm lượng sulfide khác biệt so NCBI công cụ BLAST để định danh vi khuẩn với đối chứng kể từ ngày khảo sát thứ Riêng tía quang hợp mức độ tương đồng trình tự ngày khảo sátthứ7, chủng BH1, BAI KS1 có gen 16S rRNA với chuỗi trình tự có sẵn khả khử sulfide khác biệt khơng có ý nghĩa sở liệu thống kê với hiệu suất xử lý 382 SỐ 10-Tháng 5/2022 HĨA HỌC-CƠNG NGHỆ THựC PHẨM Bảng Kết khử sulfide chủng vi khuẩn phân lập Chủng Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày ĐC 10.00b 9.87d 9.80° 9.76c 9.52d 9.46« 9.34« BH1 9.87b 9.63^ 9.40«« 9.07b 8.84° 8.73« BH2 9.87» 9.04ab 8.33a 7.93a 7.54a 7.31a 6.83b BH3 9.58a 9.23abc 8.84ab 8.74b 7.46a 7.23a 6.05a BA1 9.89b 9.87« 9.60 9.40c 8.84c 8.16b 6.92« KS1 9.82b 9.18abc 9.3600 9.01b 8.40» 7.76b 7.53« KS2 9.42a 8.84a 8.16a 7.76a 7.37a 7.20a 5.45a 7.55c Nguồn: Nhóm tác giả thực Bảng Hiệu suất loại bỏ sulfide ó chủng phân lập Chủng BH1 BH2 BH3 BA1 KS1 KS2 ĐC Hiệu suất loại bỏ sulfide (%) 24.5 31.7 39.54 30.8 24.67 45.47 6.6 Nguồn: Nhóm tác giả thực chủng BAI cao chủng lại Hiệu suất xử lý sulfide trình bày Bảng Kết cho thấy hiệu suất xử lý sulfide chủng BH2, BH3, BAI KS2 cao so với chủng cịn lại, chủng có hiệu st cao 13 35 chủng nghiên cứu Đỗ Thị Liên, 2016 3.2 Xác định khả chịu mặn chủng vi khuẩn tía khơng hiu huỳnh Kết khảo sát cho thấy chủng BH2, BH3, BAI KS1 có khả sinh trưởng tốt độ mặn khảo sát khác biệt lớn sinh khối tạo thành độ mặn khác (Hình 2), đó, khả chịu mặn chủng đánh giá cao, khả chịu mặn cao vi khuẩn quang hợp tía khơng lưu huỳnh có ý nghĩa quan trọng việc ứng dụng chúng để xử lý nước thải nuôi ưồng thủy sản hay nhiều mục đích khác hiệu suất khử sulfide chủng vi khuẩn độ mặn khác thể Bảng Bảng Hiệu suất khử sulfide chủng vi khuẩn tuyển chọn độ mặn khảo sát Độmặn(%o) BH2 BH3 BA1 KS2 10 27.33 48.51 41.93 49.61 20 44.04 45.97 43.33 45.65 30 47.79 47.68 41.92 50.42 35 38.38 45.63 44.25 47.90 Nguồn: Nhóm tác giả thực Kết cho thây khả khử sulfide chủng KS2 độ mặn khác ổn định cao nhát Đối với chủng BH3, có hiệu suất khử sulfide độ mặn khác cao chủng BH2 BAI độ mặn 10, 20 35%O tháp chủng BH2 độ mặn 30%o Từ kết trên, chủng KS2 lựa chọn để tiến hành định danh SỐ 10 - Tháng 5/2022 383 TẠP CHÍ CƠNG THƯƠNG Hình 2: Khả sinh trưởng chủng tuyển chọn mơi trường có độ mặn khác Khả nâng sinh trương rũa chùng BH3 độ mạn 10, 20,30,35%» Khã nang sính triróug cũa chúng BAI độ mạn 10, 20,30,35%» Khả nâng sỉnh trường cùa chùng BH2 độ mận 10, 20,30,35%« Khá nang sinh trường cùa cbímg KS2 độ mạn 10, 20, 30,35%«