Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn lactic để ứng dụng trong sản xuất đồ uống probiotic từ gừng

Vi khuẩn lactic đóng vai trò quan trọng trong sản xuất thực phẩm lên men. Mục đích của nghiên cứu là phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic từ sản phẩm lên men để ứng dụng trong sản xuất đồ uống probiotic từ gừng.

Vietnam J Agri Sci 2022, Vol 20, No 12: 1581-1590 Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2022, 20(12): 1581-1590 www.vnua.edu.vn PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT ĐỒ UỐNG PROBIOTIC TỪ GỪNG Vũ Quỳnh Hương, Vũ Thị Yến, Nguyễn Thị Thanh Thủy* Khoa Công nghệ thực phẩm, Học viện Nông nghiệp Việt Nam * Tác giả liên hệ: nttthuycntp@vnua.edu.vn Ngày nhận bài: 28.09.2022 Ngày chấp nhận đăng: 20.12.2022 TÓM TẮT Vi khuẩn lactic đóng vai trị quan trọng sản xuất thực phẩm lên men Mục đích nghiên cứu phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic từ sản phẩm lên men để ứng dụng sản xuất đồ uống probiotic từ gừng Kết phân lập môi trường MRS 46 chủng vi khuẩn với kích thước 1-1,5mm, khuẩn lạc trịn, bóng, màu trắng đục trắng sữa, mô Sáu chủng sơ tuyển dựa đặc điểm Gram dương, catalase âm đặc điểm hình thái tế bào hình que hình cầu Định danh phương pháp khối phổ MALDI-TOF xác định chủng thuộc loài Enterococcus faecium, Enterococcus casseliflavus, Lactobacillus fermentum Lactobacillus plantarum Thử nghiệm hoạt tính probiotic, tuyển chọn chủng L plantarum SM1.3 có khả chịu pH 1,0-3,0, chịu muối mật 0,3% tốt, có khả sinh enzyme amylase, protease, cellulase kháng hai chủng vi sinh vật kiểm định E coli Salmonella sp Kết giải trình tự gen cho thấy chủng SM1.2 thuộc loài Limosilactobacillus fermentum chủng SM1.3 thuộc loài Lactiplantibacillus plantarum Bước đầu sử dụng chủng vi khuẩn L plantarum SM 1.3 cho sản xuất đồ uống probiotic từ gừng thu sản phẩm có chất lượng cảm quan xếp loại tốt, mật độ vi khuẩn L plantarum SM1.3 đạt yêu cầu sản phẩm lên men sau ngày bảo quản điều kiện 4C Từ khoá: Củ gừng, đồ uống probiotic, vi khuẩn lactic, L plantarum SM1.3 Isolation and Selection of Lactic Acid Bacteria for Probiotic Beverage Production from Ginger ABSTRACT Lactic acid bacteria play an important role in the production of fermented foods This study aimed to isolate and select lactic acid bacteria strains from fermented products for application in the production of ginger-based probiotic drinks Fourty six strains of bacteria were isolated The isolates produced colonies with 1.0 to 1.5mm in diameter, mainly round, glossy, milky white, and floating pellicle in liquid culture Six gram-positive, catalase-negative strains with rod or spherical shaped cells were pre-selected Identification by MALDI-TOF revealed that they belong to species of Enterococcus faecium, Enterococcus casseliflavus, Lactobacillus fermentum and Lactobacillus plantarum Further study was conducted for the strain L plantarum SM1.3 It was tolerant to acid (pH 1.0-3.0) and 0.3% bile salts, and able to produce amylase, protease, and cellulase This strain inhibited two tested bacteria, E coli and Salmonella sp Gene alignment results indicated that the strain SM1.2 belonged to Limosilactobacillus fermentum species and strain SM1.3 named Lactiplantibacillus plantarum Ginger-based probiotic drink using L plantarum SM1.3 has good sensory quality and bacterial density and can be stored up to days at 4C Keywords: Ginger, probiotic drink, lactic acid bacteria, L plantarum SM1.3 ĐẶT VẤN ĐỀ Gÿng (Zingiber officinale Rosc) ỵc trng v s dýng ph bin tọi Vit Nam Trong thc phốm, cỷ gng ỵc s dýng nhỵ mt lội gia vð cị mùi thĄm, vð cay (Mahomoodally & cs., 2019) Trong y học, cû gÿng có tác dýng kháng khuèn, chống ký sinh trùng, chống oxy hóa, chng viờm, giõm au, chng ung thỵ, bõo v gan, hỗ trĉ tiêu hóa, kích thích miễn dðch (Bag, 1581 Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn lactic để ứng dụng sản xuất đồ uống probiotic từ gừng 2018) Thành phổn dinh dỵng chớnh cỷa cỷ gng bao gm carbohydrat, lipid, nỵc, chỗt x, protein v khoỏng chỗt Ngoi ra, gng cũn cha nhiu hp chỗt phenol khỏc bao gồm gingerols, paradols, shogoals zingerones (Srinivasan, 2017) Ngoài s dýng gng tỵi, khụ, gng củn ỵc ch bin thnh cỏc sõn phốm tin dýng khỏc nhỵ sauce, paste, sân phèm đồ uống lên men Quá trình lên men lactic ỵc thc hin bi vi khuốn lactic, cú thể bći vi khuèn lên men tă nhiên chûng vi khuốn lactic thuổn Phỵng phỏp lờn men bi chỷng thuổn thỵng ỵc ỏp dýng cụng ngh thc phốm nhą khâ nëng lên men nhanh, kiểm soát tốt Sân phèm lên men truyền thống cûa Việt Nam chû yếu dăa hệ vi sinh vêt tă nhiên Vi khuèn lactic nhỵ L plantarum, Pediococcus pentosaceus, L fermentum, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus brevis ó ỵc tỡm thỗy nhiu loọi sõn phốm lờn men nhỵ nem chua, dỵa mui, c mui, tôm chua (Cao & cs., 2013; Nguyen, 2015; Rhee & cs., 2011) Probiotic nhĂng vi sinh vêt sống ỵa vo c th mt lỵng ổy ỷ s có lĉi cho sĀc khóe cûa vêt chû Chúng địng vai trò quan trọng việc bâo vệ vêt chû chống läi vi sinh vêt có häi đồng thi giỳp tởng cỵng h thng dch Sõn phốm chĀa probiotic chû yếu thuộc nhóm vi khuèn lactic Mýc tiêu cûa nghiên cĀu phân lêp, tuyển chọn chûng vi khuèn lactic có tiềm nëng probiotic cao tÿ nguồn thăc phèm lên men tă nhiên có cha gng v th nghim sõn xuỗt ung lờn men, góp phỉn đa däng hóa sân phèm, tên dýng ỵc ngun nguyờn liu di v nồng cao ỵc giá trð cho cû gÿng PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vt liu Gng mui nguyờn cỷ, nỵc ộp gng muối lên men sung muối tă làm thu mua tọi cỏc ch tọi Gia Lõm, H Ni ỵc sā dýng làm nguồn phân lêp vi sinh vêt Chûng vi khuốn kim nh ỵc s dýng nghiờn cu bao gm Salmonella sp., Escherichia coli cung cỗp 1582 bi Bộ môn Vi sinh vêt, Khoa Tài nguyên Môi trỵng, Hc vin Nụng nghip Vit Nam Mụi trỵng MRS ỵc dựng nuụi cỗy v phõn lờp vi khuốn lactic vĆi thành phæn (g/l) glucose (20), pepton (10), cao tht (10), cao nỗm men (5), CaCO3 (5), Tween (1), Diamoniumcitrat (2), MgSO4 7H2O (0,58), MnSO2.4H2O (0,28), K2HPO4 (2), thọch (15), nỵc cỗt Bờn cọnh ũ, mụi trỵng PCA ỵc dựng xỏc nh vi sinh vờt hiu khớ tổng số có thành phỉn (g/l) gồm pepton tÿ casein (5), cao nỗm men (2,5), glucose dọng khan (1,0), agar 15-20, nỵc cỗt Gng trõu (Zingiber officinale Rosc.) ỵc thu hộch täi huyện Hà Qng, Cao Bìng làm ngun liệu cho sân phèm đồ uống lên men lactic tÿ gÿng Gÿng nguyên liệu sā dýng cho lên men loäi gÿng non thu hoäch sau trồng tÿ 6-7 tháng, ó ỵc gt vú, lm sọch v cỗp ụng, cung cỗp bi Cụng Ty TNHH Phỏt trin Nụng nghip v Tỵ vỗn Mụi trỵng (Dace) 2.2 Phng phỏp nghiờn cu 2.2.1 Phân lập chủng vi khuẩn lactic từ mẫu thực phẩm chứa gừng Dðch méu lên men (ml) ỵc b sung nỵc cỗt vụ trựng theo tợ lệ 10:90 pha loãng theo dãy tĆi hän Dung dch ó pha loóng (0,1ml) ỵc nhú vo ùa thọch cha mụi trỵng MRS v trang u b mt n khụ Nhit nuụi cỗy gi 37C 24-48 gi Vi khuốn ỵc cỗy chuyn tip nhiu lổn cho n thu ỵc mi ùa petri l dủng khuốn lọc ng nhỗt (Bựi Xuồn ng, 2018) 2.2.2 Xỏc định đặc điểm hình thái, sinh lý sinh húa Khuốn lọc vi khuốn ỵc quan sỏt bỡng mớt thỵng v t bo vi khuốn ỵc xỏc nh bỡng cỏch quan sỏt dỵi kớnh hin vi vờt kớnh 100X Đặc điểm sinh lý sinh hóa bìng nhuộm Gram, thā nghiệm catalase 2.2.3 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính probiotic Khâ nëng chðu axit dä dày ỵc thc hin theo nghiờn cu cỷa Nguyn Th Hng Nhung & cs (2019) Cý thể, bổ sung dðch giống vi khuèn Vũ Quỳnh Hương, Vũ Thị Yến, Nguyễn Thị Thanh Thy ó nuụi cỗy qua 24 gi vo mụi trỵng MRS lúng cú pH khỏc (1, 2, 3), nuôi vi khuèn ć 30C gią đo giá trð OD täi thąi điểm gią gi bỵc súng 620nm Khõ nởng chu mui mờt ỵc thc hin bỡng cỏch chuốn b cỏc ng nghim cha mụi trỵng MRS b sung 0,3% mui mờt, nhú 10% dch ging vi khuốn ó nuụi cỗy dch thể qua 24 gią vào ống nghiệm trên, sau đị mang ni ć 30C Mêt độ tế bào mộu ỵc xỏc nh bỡng cỏch xỏc nh mờt quang bỵc súng 620nm Mc chu mui mờt ỵc xỏc nh bỡng thi gian tởng OD620nm sau ni gią so vĆi ban đỉu (Gilliland & Walker, 1990) Khõ nởng sinh enzyme ngoọi bo ỵc thc hin bỡng phỵng phỏp ýc l thọch trờn mụi trỵng cú b sung c chỗt tinh bt, casein v CMC Nguyễn Lån Düng & cs (1976) Chûng vi khuèn lactic ỵc hoọt húa mụi trỵng MRS lúng Sau 48 gi nuụi 37C, dch nuụi vi khuốn lactic ỵc ly tâm vĆi tốc độ 6.000 vòng/phút 30 phút ć 4C, thu dðch ly tâm Dùng nút khoan cò ỵng kớnh 5mm, ýc l thọch trờn ùa petri cỷa mụi trỵng cú cha 1% c chỗt tinh bt, casein CMC VĆi chûng vi khuèn lactic tiến hành nhó 0,1 ml dðch ly tåm thu vào lỗ thäch đặt đïa thäch tû länh ć 4C không gią nhìm để dðch ly tâm khuếch tán u vo thọch v tip týc ỵc ỷ 37C 48 gi lỵng dch l thọch thỷy phồn c chỗt Hoọt tớnh cỷa enzyme ỵc o bỡng ỵng kớnh vũng phõn giõi c chỗt xung quanh lỗ thäch, tĀc D – d Trong đò: D ỵng kớnh vũng phõn giõi (mm), d l ỵng kớnh lỗ thäch (5mm) Khâ nëng đối kháng vĆi vi khuèn gõy bnh kim nh ỵc thc hin bỡng phỵng phỏp khuếch tán thäch cûa Herreros & cs (2005) Chûng nghiên cu ỵc nuụi mụi trỵng MRS lúng 30C, t 18-20 gi, dch ni thu ỵc nh ly tõm chỵnh pH trung tính (6,7-6,8) Chûng kiểm đðnh ỵc nuụi qua ờm mụi trỵng LB (Luria - Bertani) lóng ć 30C Nhó 30l dðch vi khuèn gây bnh mờt 108 CFU/ml (tỵng ng vi McFarland 0,5) (CLSI, 2012) lờn ùa thọch ri cỗy chang v khoan l thọch Nhú dch ly tồm ỵc chợnh pH vo lỗ thäch giĂ ć nhiệt độ 4C/4 gią, sau đò û ć 30C/24 gią Cën cĀ vào vòng Āc chế vi sinh vêt kiểm đðnh để xác đðnh chûng có khâ nëng kháng vi sinh vêt (Schillinger & Lucke, 1989) Hột tính kháng khn cûa vi sinh vờt tuyn chn ỵc tớnh bỡng ỵng kớnh vũng khỏng khuèn ∆D: ∆D = D – d (mm), đò: D l ỵng kớnh vũng khỏng khuốn (mm); d l ỵng kớnh l thọch (mm) 2.2.4 nh danh chng vi khuẩn lactic phương pháp khối phổ MALDI-TOF xác định trình tự gen 16S rRNA a Định danh chủng vi khuẩn lactic phương pháp khối phổ MALDI-TOF (Matrix assisted laser desorption ionization - time of flight) Phỵng phỏp đðnh danh vi khuèn sā dýng hệ thống MALDI Biotyper - Bruker Khuốn lọc ỵc pht lờn ùa target, tọo lp pht múng v ng nhỗt, ri lm khụ nhiệt độ phòng Dung dðch HCCA matrix (-Cyano-4-hydroxycinnamic acid) (1ml) ỵc t lờn trờn mộu, khụ nhit phòng sā dýng hệ thống MALDI Biotyper - Bruker để đo Phân tích phân tā ion hóa nhą matrix tia lazer, sau đò đo thąi gian bay dăa trờn lỵng nh danh vi sinh vờt bỡng dỗu ỗn phõn t, so sỏnh s tỵng ng cỷa ph protein tÿ méu vi sinh vêt mýc tiêu vĆi cĄ sć dĂ liệu chûng vi sinh vêt khác (Doan & cs., 2012) Bảng Độ tin cậy kết định danh theo phương pháp khối phổ MALDI-TOF Khoảng Diễn giải 2.000-3.000 Xác định độ tin cậy cao 1.700-1.999 0.000-1.699 Ký hiệu Màu sắc (+++) Xanh Xác định mức độ tin cậy thấp (+) Vàng Không xác định vi sinh vật (-) Đỏ 1583 Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn lactic để ứng dụng sản xuất đồ uống probiotic từ gừng Báo cáo bao gm danh sỏch cỏc loi phự hp nhỗt ỵc phõn loọi theo tỵng ng cỷa dỗu võn protein, kốm theo giá trð cho biết mĀc độ xác đðnh loài chi vi sinh vêt MĀc độ tin cêy cûa kt quõ ỵc trỡnh by bõng b nh danh phương pháp xác định trình tự gen 16S rRNA Các gen 16S rRNA cûa chûng vi khuèn lactic ỵc khuch ọi bỡng cỏch s dýng cp mi ph quát 27F 5’-AGAGTTTGATCCTGGCT CAG-3’ 1492R 5’-GGCTACCTTGTTACGAC TT-3’ (Barman & cs., 2018) Sõn phốm PCR ỵc tinh sọch bỡng b dýng cý làm säch PCR GenElute (Sigma, Hoa KĊ) ỵc giõi trỡnh t theo cõ hỵng thuờn v nghch Cỏc trỡnh t sau ũ ỵc x lý v so sánh sā dýng cơng cý tìm kiếm BLASTn tÿ cĄ sć dĂ liệu GenBank theo mô tâ cûa Chen & cs (2008) 2.2.4 Thử nghiệm sân xuất đồ uống probiotic t gng Chỷng vi khuốn lactic ó tuyn chn ỵc nhõn ging qua hai cỗp giai oọn nhõn ging cỗp 1, vi khuốn lactic ỵc nhõn ging 10ml mụi trỵng MRS thi gian 24 gi 37C giai oọn nhõn ging cỗp 2, 10ml dch nhõn ging cỗp vo 100ml mụi trỵng MRS, nuụi 37C 24 gi Trỵc b sung vi khuốn vo sõn phốm, dch ging ỵc ly tõm länh ć 4C vĆi 6.000 vịng 10 phút Phỉn dch bờn trờn ỵc gọn thu phổn cn vi khuốn phớa dỵi Gng nguyờn liu ỵc ộp thu dch Thụng s k thuờt chuốn b dch trỵc lờn men l: tợ l dch ộp gng - nỵc l 1/20, tợ l mui l 0,7%, ỵng l 2,8% Hn hp dch ỵc trựng 80C/5 phỳt v lm ngui nhanh xung 30C Vi khuốn ó nuụi cỗy ỵc tip ging l 2% (ọt ỵc mờt vi khuốn ỵa lờn men l 105 CFU/ml, ờy nớp v tiến hành lên men ć 30C cho tĆi pH ọt 4,2 0,2, cỏc tớnh chỗt cõm quan ọt t khỏ tr lờn Sõn phốm ỵc xỏc nh mt số chỵ tiêu vi sinh vêt đánh giá câm quan theo TCVN 3215-79 Phỵng phỏp ỏnh giỏ cõm quan cho im chỗt lỵng tng hp v cỏc tiờu mu sớc, mựi, v, trọng thỏi Cỏc chợ tiờu ỵc đánh giá theo thang điểm tÿ 0-5 để đánh giá chỗt lỵng sõn phốm (H Duyờn Tỵ, 2010) 2.3 X lý s liu Cỏc s liu thu thờp ỵc x lý thống kê bìng phỉn mềm Minitab 16 Excel 2013 Kt quõ ỵc phõn tớch bỡng phỵng phỏp ANOVA chiều Să khác biệt cûa giá trð trung bình ỵc ỏnh giỏ nh phộp so sỏnh Tukey vi mc tin cêy 95% KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập chủng vi khuẩn lactic Tổng số 46 khuèn lọc ó ỵc phõn lờp trờn mụi trỵng MRS t méu gÿng muối méu sung muối Các khuèn läc có däng hình trịn, bóng, lồi, màu síc khn lọc trớng ýc, hoc trớng sa Kớch thỵc khuốn lọc tỵng i nhú thỵng dao ng 1,0-1,5mm Chỷng vi khuốn mang c im sinh húa (Gram dỵng v catalase ồm) đặc điểm hình thái tế bào (hình que hỡnh cổu) ỵc la chn cũ c im cỷa vi khuèn lactic theo mô tâ cûa Salminen & cs (2004) Đặc điểm hình thái tế bào đặc điểm sinh húa cỷa chỷng la chn ỵc trỡnh by bâng Bảng Đặc điểm hình thái sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn phân lập 1584 Kí hiệu chủng Hình thái tế bào Gram Catalase GM2.10 Cầu khuẩn, đứng riêng lẻ/ chuỗi ngắn + - GM2.11 Cầu khuẩn, đứng riêng lẻ/ chuỗi ngắn + - GM2.17 Cầu khuẩn, đứng riêng lẻ/ chuỗi ngắn + - SM1.2 Trực khuẩn, đứng riêng lẻ/ chuỗi ngắn + - SM1.3 Trực khuẩn, đứng riêng lẻ/ chuỗi ngắn + - SM1.5 Trực khuẩn, đứng riêng lẻ/ chuỗi ngắn + - Vũ Quỳnh Hương, Vũ Thị Yến, Nguyễn Thị Thanh Thủy Bảng Kết định danh hệ thống khối phổ MALDI - TOF Kí hiệu chủng Lồi phát Điểm GM2.10 Enterococcus faecium 2,27 Cao GM2.11 Enterococcus faecium 2,28 Cao GM2.17 Enterocuccus casseliflavus 2,21 Cao SM1.2 Lactobacillus fermentum 1,75 Thấp SM1.3 Lactobacillus plantarum 2,05 Cao SM1.5 Lactobacillus plantarum 2,04 Cao Chûng vi khuèn GM2.10, GM2.11 GM2.17 có hình thái tế bào hình cỉu, đĀng riêng rẽ thành chuỗi ngín Chûng SM1.2, SM1.3 SM1.5 tế bào däng hình que (trăc khuèn), đĀng riêng lẻ xếp thành chuỗi q trình phân cít tế bào Kết quâ đðnh danh bìng khối phổ MALDI-TOF cho chỷng vi khuốn la chn ỵc trỡnh by bâng Kết quâ so sánh khối phổ cho thỗy hai vi khuốn GM2.11 (GM2.10) v GM2.17 ỵc xỏc nh lổn lỵt l Enterococcus faecium v Enterococcus casseliflavus vĆi độ tin cêy cao (2,28 2,71) thuộc chi Enterococcus Thành viên cûa chi Enterococcus đĀng thĀ ba sau Lactobacilli v Streptococcus danh sỏch cỏc nhúm ln nhỗt cûa LAB Chúng có khâ nëng chðu độ mặn cao, thêm chí 6,5% NaCl, muối mêt lên đến 40%, vĆi điều kiện axit khác tồn täi 30 phút ć 60C (Ogier, 2008) Một số Enterococcus cho thỗy cỏc c tớnh tim nởng cỷa probiotic v khõ nởng tởng cỵng sc khúe (Tachibana & cs., 2020) Do ũ cỏc chỷng vi khuốn Enterococcus ỵc s dýng nhỵ ch phốm sinh hc v ng dýng cho cỏc ngnh bao gm dỵc phốm, thuc cha bnh cho ngỵi v thỳ y, ngnh cụng nghip thc phốm nhỵ sõn phốm sa hoc thc phốm lờn men, chỗt b sung thĀc ën chën nuôi Chûng SM1.2 SM1.3 (SM1.5) lổn lỵt ỵc xỏc nh l Lactobacillus fermentum v Lactobacillus plantarum Cỏc vi khuốn ny thuc chi Lactobacillus Chỳng ỵc Āng dýng lên men sĂa, thðt nhiều loäi rau cû khác (Behera & cs., 2018) VĆi tiềm nëng probiotic cao, câ lội vi khn khơng chỵ ỵc ng dýng ngnh cụng nghip thc tin cy phốm m củn ỵc ng dýng vic ngởn nga v iu tr vỗn sc khúe khỏc (Mikelsaar & cs., 2009) VĆi chûng trên, dăa mc tỵng ng cỷa chỷng GM2.10, GM2.11 v chỷng SM1.3, SM1.5, chûng cò độ tin cêy cao hĄn ỵc la chn chỷng s ỵc tip týc nghiờn cĀu GM2.11, GM2.17, SM1.2, SM1.3 3.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính probiotic Bốn chûng vi khuốn ỵc tin hnh khõo sỏt cỏc c tớnh probiotic bao gồm khâ nëng chðu axit dä dày, khâ nëng chðu muối mêt, khâ nëng sinh enzyme ngoäi bào khõ nởng khỏng khuốn Kt quõ ỵc th hin hình 1, 2, bâng 3, Hình cho thỗy tỗt cõ cỏc chỷng vi khuốn u cú khõ nởng chu ỵc nng pH thỗp c biệt chûng E casseliflavus GM2.17 L plantarum SM1.3 cú khõ nởng chu ỵc pH rỗt thỗp (pH 1) Kt quõ ny tỵng ng vi cỏc kt quõ nghiờn cu cỷa Chevalier & cs (2022) v Hunh Phỵng Trang (2018) cỹng cho thỗy khõ nởng chu axit dọ dy cûa E casseliflavus L plantarum Đối vĆi khâ nëng chðu muối mêt, chûng vi khuèn có khâ nëng chðu muối mêt ć nhĂng mĀc độ khác Trong đị cị chûng sau gią có OD o bỵc súng 620nm trờn 0,3 ũ l chûng GM2.17, SM1.2 SM1.3 Kết quâ nghiên cĀu cỷa Mohamed & cs (2022) hoc cỷa Hunh Phỵng Trang (2018) cỹng cho thỗy khõ nởng chu axit dọ dy cûa E casseliflavus GM2.17, L fementum SM1.2 L plantarum SM1.5 Chûng GM2.11 ∆OD sau gią chỵ đät 1585 Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn lactic để ứng dụng sn xut ung probiotic t gng 0,105 thỗp hn so vi cỏc chỷng cũn lọi nhỵng vộn cú khõ nởng phỏt trin mụi trỵng cú nng muối mêt cao nëng kháng läi chûng vi khuèn gõy bnh, ngỵc lọi l khõ nởng khỏng vi khuốn kim nh rỗt mọnh n t chỷng cỷa chi Lactobacillus Nghiên cĀu cûa Nguyễn Thð Hồng Nhung & cs (2019) vĆi chûng vi khuèn Lactobacillus có khâ nëng khỏng cỏc vi khuốn gõy bnh rỗt tt, cỏc vũng kháng khuèn dao động tÿ 16-22mm Kết quâ bâng v hỡnh cho thỗy khõ nởng sinh enzyme cûa chûng vi khuèn có să khác Chûng vi khuèn L fermentum SM1.2, SM1.3 E casseliflavus GM3.17 có khâ nëng phån giâi câ ba enzyme mänh Kết quâ phù hĉp vĆi kết quâ nghiên cĀu cûa Nguyễn Thð Hồng Nhung & cs (2019) nghiên cĀu phân lêp vi khuèn lactic tÿ méu thăc phèm lờn men cỹng thu ỵc kt quõ ỵng kớnh vũng phõn giõi c chỗt cỷa cellulase v protease ln hn amylase Trong đị, vi khn E faecium chỵ phân giõi ỵc c chỗt sinh enzyme cellulase v protease Hai chûng có hột tính probiotic cao SM1.2 SM1.3 ỵc tip týc nh danh bỡng phỵng phỏp xỏc nh trình tă gen 16S rRNA để khỵng đðnh lồi, kiểm tra mĀc độ an toàn cho Āng dýng đồ uống lên men tÿ gÿng, đồng thąi so sánh să tỵng ng gia hai phỵng phỏp ph v xỏc nh trỡnh t gen Phõn ng PCR ó ỵc thc sā dýng cặp mồi 27F 1492R để nhân tồn vùng gen mã hố tiểu phỉn 16S rRNA Kt quõ PCR ỵc th hin hỡnh i vĆi khâ nëng kháng hai chûng vi sinh vêt kiểm nh (Bõng 5, Hỡnh 3), nhờn thỗy rỡng cõ chûng thuộc chi Enterococcus khơng có khâ Khả chịu pH dày 0,5 0,3 Khả chịu muối mật 0,4 0,2 pH pH pH3 0,4 0,3 ∆OD620nm ∆OD620nm 0,2 0,1 0,3 0,2 0,2 0,1 0,1 0,1 0,0 GM2.11 GM2.17 0,0 SM1.2 SM1.3 Kí hiệu chủng GM2.11 GM2.17 SM1.2 SM1.3 Kí hiệu chủng Ghi chú: GM2.11 (Enterococcus faecium GM2.11), GM3.17 (Enterococcus casseliflavus GM3.17), SM1.2 (Lactobacillus fementum SM1.2), SM1.3 (Lactobacillus plantarum SM1.3) Hình Khả chịu pH dày muối mật bốn chủng vi khuẩn Bảng Khả sinh enzyme ngoại bào bốn chủng vi khuẩn Kí hiệu chủng Đường kính vịng phân giải chất D – d (mm) Amylase Protease d Celllulase GM2.11 3,3 ± 0,6 4,4b ± 0,4 GM2.17 5,5b ± 0,1 5, 5a ± 0,5 2,5d ± 0,5 SM1.2 7,2a ± 0,3 5,0c ± 0,0 5,0a ± 0,5 SM1.3 5,2c ± 0,3 5,3b ± 0,6 3,5c ± 0,5 Ghi chú: Trong cột chữ khác thể khác có ý nghĩa mức  = 0,05 1586 Vũ Quỳnh Hương, Vũ Thị Yến, Nguyễn Thị Thanh Thủy Amylase Protease Celllulase Ghi chú: GM2.11 (Enterococcus faecium GM2.11), GM3.17 (Enterococcus casseliflavus GM3.17), SM1.2 (Lactobacillus fementum SM1.2), SM1.3 (Lactobacillus plantarum SM1.3) Hình Hình ảnh vòng phân giải enzyme bốn chủng vi khuẩn Bảng Khả kháng chủng vi khuẩn kiểm đinh Kí hiệu chủng Đường kính vịng kháng khuẩn ∆D (mm) E coli Salmonella sp GM2.11 c 0c GM2.17 0c 0c b SM1.2 12,50 ± 0,50 14,57b ± 0,29 SM1.3 16,00a ± 0,00 17,33a ± 0,29 Ghi chú: Trong cột chữ khác thể khác có ý nghĩa mức  = 0,05 Hình Hình ảnh vịng kháng khuẩn hai chủng vi khuẩn SM1.2 SM1.3 Sau giâi mã gen, trỡnh t thu ỵc t vựng gen mó hoỏ 16S rRNA cũ kớch thỵc 1500bp cú tớn hiu rừ, sau so sánh ngân hàng gen sā dýng BLAST, kt quõ cho thỗy chỷng SM1.2 thuc loi Limosilactobacillus fermentum ( tỵng ng 99,78% vi chỷng Limosilactobacillus fermentum SCB0035) v chỷng SM1.3 thuc loi Lactiplantibacillus plantarum ( tỵng ng 100% vĆi chûng Lactiplantibacillus plantarum KUMS-C39, LpYC41, HBUAS51526, HBUAS51458, HBUAS51444) Limosilactobacillus fermentum Lactiplantibacillus plantarum tên latin cờp nhờt cỷa Lactobacillus fermentum v Lactobacillus plantarum Nhỵ vờy, kt quõ cỷa hai phỵng phỏp nh danh bỡng phổ MALDI-TOF giâi trình tă gen cị độ xác cao Kết quâ cüng phù hĉp vĆi kết luên cûa Doan & cs (2012), sā dýng MALDI‐TOF MS để phân loäi xác đðnh nhanh vi khuèn lactic 1587 Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn lactic để ứng dụng sản xuất đồ uống probiotic từ gừng ĐC SM1.2 SM1.3 ∼1.500bp Ghi chú: Giếng số 1: Đối chứng dương 1500bp, Giếng số 2: Sân phẩm PCR chủng SM1.2, Giếng số 3: Sân phẩm PCR chủng SM1.3 Hình Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen 16S rRNA chủng SM1.2 SM1.3 Rỗt nhiu nghiờn cu ó cụng b nhiu chỷng L plantarum cị đặc tính probiotic cao HĄn nĂa, L plantarum ỵc cụng nhờn l vi khuốn an ton cho sc khúe ngỵi, ỵc ng dýng nhiu thc phốm (Da Silva Sabo & cs., 2014) Nhỵ vờy, chỷng vi khuốn L plantarum SM1.3 s ỵc chn l vi khuốn cho q trình lên men đồ uống lactic tÿ gÿng 3.3 Thử nghiệm sản xuất đồ uống probiotic từ gng s dng chng vi khun L plantarum Dch nỵc gng ó b sung nỵc ỵng, mui nhỵ ó mụ tâ phæn 2.2.5, tiếp giống 2% vĆi chûng L plantarum SM1.3 Sau lên men ć 30C 48 gi, sõn phốm ỵc bõo quõn nhit 4C v ỵc phõn tớch chợ tiờu v pH, acid tng s, chỗt lỵng vi sinh v ỏnh giỏ chỗt lỵng cõm quan khoâng thąi gian tÿ ngày trć đi, cách ngày phån tích lỉn Kết q ỵc trỡnh by bõng T kt quõ trờn bâng 6, giá trð pH axit tổng số cûa sân phèm có să thay đổi tÿ ngày sau kết thúc lên men đến ngày thĀ bâo quân Mc dự iu kin nhit thỗp nhỵng hoọt ng lên men vén diễn Tÿ ngày đến ngày 1588 bõo quõn pH cỷa sõn phốm giõm nhỵng tốc độ chêm và nồng độ acid tëng nh Xột v chỗt lỵng cõm quan nhờn thỗy rỡng cõ hai sõn phốm vộn gi ỵc chỗt lỵng cõm quan tt n ngy bõo quõn th 5, chỗt lỵng sân phèm đät loäi Ngày thĀ bâo quân, sân phèm bít đỉu có nhĂng biến đổi màu síc (sém màu hĄn), phỉn líng cặn nhiều sêm màu hĄn, mùi chua hĄn, khơng đâm bâo u cỉu chỗt lỵng Nhỵ vờy, sõn phốm n ngy th vén đät yêu cæu pH giá trð câm quan Mêt độ chûng vi khuèn L plantarum SM1.3 đät yờu cổu n trỵc ngy th 7, bớt ổu t ngày bâo quân thĀ 7, mêt độ vi khuèn bít đỉu giâm khơng đät theo giĆi hän tiêu chn Điều giâi thích vi khn lactic cú th lờn men ỵc trờn cỏc c chỗt cú cha gng, nhiờn lỵng hoọt chỗt sinh hc gÿng axit sinh cüng phæn Āc chế să hoät động cûa chúng so vĆi cĄ chỗt lờn men khỏc Sõn phốm ung lờn men lactic t gng nờn s dýng trỵc ngy cú th õm bõo ỵc chỗt lỵng tt nhỗt cỷa sõn phốm Vic xỏc nh cỏc iu kin ti ỵu chỷng SM1.3 phỏt trin tt hn, kộo di ỵc thi gian bõo quõn cổn ỵc thc hin sõu thờm ć nhĂng nghiên cĀu Vũ Quỳnh Hương, Vũ Thị Yến, Nguyễn Thị Thanh Thủy Bảng Chất lượng đồ uống probitic từ gừng trình bảo quản Chất lượng cảm quan Chỉ tiêu vi sinh vật Thời gian bảo quản (ngày) pH Axit Điểm cảm quan Xếp loại Mật độ L plantarum SM1.3 (CFU/g) Giới hạn tiêu chuẩn 4,36 0,54 18,84 Tốt 1,01 × 106 ≥ 106 Khá Đạt Đạt 3,52 3,37 3,28 0,72 0,86 0,99 17,60 15,76 7,72 1,12 × 10 Khá 1,62 × 10 Kém 4 KẾT LUẬN Tÿ 46 chûng phân lêp tÿ méu gÿng sung muối, chûng L plantarum SM1.3 có hột tính probiotic cao ó ỵc tuyn chn s dýng cho trình lên men đồ uống lactic tÿ gÿng ung probiotic t gng thnh phốm cú chỗt lỵng câm quan đät lội tốt đät u cỉu mêt độ vi khuèn L plantarum SM1.3 ngày bâo quân Kết quâ cûa nghiên cĀu täo tiền đề cho việc phát triển loäi đồ uống lên men nịi chung đồ uống probiotic tÿ gÿng nói riêng ỏp ng nhu cổu cỷa ngỵi tiờu dựng TI LIỆU THAM KHẢO Bag B.B (2018) Ginger processing in India (Zingiber officinale): A review International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences 7(04): 1639-1651 Barman S Ghosh R & Mandal N.C (2018) Production optimization of broad spectrum bacteriocin of three strains of Lactococcus lactis isolated from homemade buttermilk Annals of Agrarian Science 16(3): 286-296 https://doi.org/10.1016/j.aasci.2018.05.004 Behera S.S., Ray R.C & Zdolec N (2018) Lactobacillus plantarum with functional properties: an approach to increase safety and shelf-life of fermented foods BioMed Research International Bùi Xuân Đồng (2018) Công nghệ enzyme Trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng Cao H.L., Son C.K., Ha H.P., Florence H., Binh L.T., Mai L.T., Tram N.T.H., Khanh T.T.M Viet P.T., Dominique V & Yves W (2013) Tropical traditional fermented food, a field full of promise Examples from the tropical bioresources and biotechnology programme and other related French–Vietnamese programmes on fermented 5,0 × 10 Đánh giá Đạt Khơng đạt food International journal of food science & technology 48(6): 1115-1126 Chen W., Chen H., Xia Y., Zhao J., Tian F & Zhang H (2008) Production, purification, and characterization of potential thermostable galactosidase for milk lactose hydrolysis from Bacillus stearothermophilus Journal of Dairy Science 91(5): 1751-58 CLSI (2012) Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests, Approved Standard, 7th ed., CLSI document M02-A11 Clinical and Laboratory Standards Institute, 950 West Valley Road, Suite 2500, Wayne, Pennsylvania 19087, USA Doan N.T.L., Van Hoorde K., Cnockaert M., De Brandt E., Aerts M., Le Thanh B & Vandamme P (2012) Validation of MALDI‐TOF MS for rapid classification and identification of lactic acid bacteria, with a focus on isolates from traditional fermented foods in Northern Vietnam Letters in applied microbiology 55(4): 265-273 Da Silva Sabo S., Vitolo M., González J.M.D & de Souza Oliveira R.P (2014) Overview of Lactobacillus plantarum as a promising bacteriocin producer among lactic acid bacteria Food Research International 64: 527-536 Gilliland S.E & Walker D.K (1990) Factors to consider when selecting a culture of Lactobacillus acidophilus as a dietary adjunct to produce a hypercholesterolemic effect in humans Journal of Dairy Science 73(4): 905-909 Herreros M.A., Sandoval H., Gonzalez L., Castro J.M., Fresno J.M & Tornadijo M.E (2005) Antimicrobial activity and antibiotic resistance of lactic acid bacteria isolated from Armada cheese (a Spanish goats’ milk cheese) Food Microbiol 22 (5): 455-459 Huỳnh Phan Phương Trang (2018) Thử nghiệm nước chanh dây độ cồn thấp bổ sung vi khuẩn Lactobacillus plantarum LY-78 Tạp chí khoa học Cơng nghệ Thực phẩm 16(1): 56-66 Hà Duyên Tư (2010) Kỹ thuật phân tích cảm quan thực phẩm Nhà xuất Khoa học kỹ thuật 1589 Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn lactic để ứng dụng sản xuất đồ uống probiotic từ gừng Mahomoodally M.F., Aumeeruddy M.Z., Rengasamy K.R.R., Roshan S., Hammad S., Pandohee J., Hu X & Zengin G (2019) Ginger and its active compounds in cancer therapy: From folk uses to nano therapeutic applications Seminars in Cancer Biology 69: 140-149 Mohamed Z., Sylvie C., Marc G.J.F & Nathalie C (2022) Special Issue “Enterococci for Probiotic Use: Safety and Risk”: Editorial Microorganisms 10: 604 Mikelsaar M & Zilmer M (2009) Lactobacillus fermentum ME-3 - an antimicrobial and antioxidative probiotic Microbial Ecology in Health and Disease 21(1): 1-27 Nguyen L.A (2015) Health-promoting microbes in traditional Vietnamese fermented foods: A review Food Science and Human Wellness 4(4): 147-161 https://doi.org/10.1016/j.fshw.2015.08.004 Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượn, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch & Phạm Văn Ty (1976) Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học (Tập 2) Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Thị Hồng Nhung, Lê Thị Thương, Nguyễn Thị Thu Hằng & Nguyễn Thị Huyền (2019) Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có tiềm ứng dụng tạo chế phẩm sinh học probiotic bổ sung vào thức ăn chăn ni Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Lâm nghiệp 2: 18-27 Ogier J.C & Serror P (2008) Safety assessment of dairy microorganisms: The Enterococcus genus 1590 International Journal of Food Microbiol 126: 291-301 Rhee S.J., Lee J.E & Lee C.H (2011, December) Importance of lactic acid bacteria in Asian fermented foods In Microbial Cell Factories 10(1): 1-13 BioMed Central Salminen S., Wright A.V & Ouwehand A (2004) Lactic acid bacteria Microbiologycal and Functional Aspect Third edition, Revised and Expanded by Marcel Dekker, In Schillinger U & Lücke F.K (1989) Antibacterial activity of Lactobacillus sakei isolated from meat Applied and Environmental Microbiology 55(8): 1901-1906 Srinivasan K (2017) Ginger rhizomes (Zingiber officinale): A spice with multiple health beneficial potentials PharmaNutrition 5: 18-28 Tachibana L., Telli G.S., de Carla Dias D., Gonỗalves G.S., Ishikawa C.M., Cavalcante R.B., Natori M M., BenHamed S & Ranzani-Paiva M.J.T (2020) Effect of feeding strategy of probiotic Enterococcus faecium on growth performance, hematologic, biochemical parameters and nonspecific immune response of Nile tilapia Aquaculture Reports 16: 100277 Zielinska D & Kolozyn-Krajewska D (2018) Foodorigin lactic acid bacteria may exhibit probiotic properties Bio Med rRes Int pp 1-15  ... MS để phân loäi xác đðnh nhanh vi khuèn lactic 1587 Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn lactic để ứng dụng sản xuất đồ uống probiotic từ gừng ĐC SM1.2 SM1.3 ∼1.500bp Ghi chú: Giếng số 1: Đối chứng... mức độ tin cậy thấp (+) Vàng Không xác định vi sinh vật (-) Đỏ 1583 Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn lactic để ứng dụng sản xuất đồ uống probiotic từ gừng Báo cáo bao gm danh sỏch cỏc loi phự hp.. .Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn lactic để ứng dụng sản xuất đồ uống probiotic từ gừng 2018) Thành phổn dinh dỵng chớnh cỷa cỷ gng bao gm