Phân lập, tuyển chọn và định danh một số chủng vi sinh vật có lợi và bước đầu ứng dụng trong xử lý chất thải rắn hữu cơ làm phân bón hữu cơ sinh học

Bài viết Phân lập, tuyển chọn và định danh một số chủng vi sinh vật có lợi và bước đầu ứng dụng trong xử lý chất thải rắn hữu cơ làm phân bón hữu cơ sinh học được nghiên cứu nhằm phân lập, tuyển chọn và định danh các chủng vi sinh vật có lợi và bước đầu ứng dụng để xử lý chất thải rắn hữu cơ làm phân bón hữu cơ sinh học.

Đặng Quang Hải, Trần Thị Thanh Thủy 56 PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT CÓ LỢI VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ CHẤT THẢI RẮN HỮU CƠ LÀM PHÂN BÓN HỮU CƠ SINH HỌC ISOLATION, SCREENING AND IDENTIFICATION OF EFFECTIVE MICROBIAL STRAINS TO MAKE BIO-ORGANIC FERTILIZER FROM ORGANIC SOLID WASTE Đặng Quang Hải1*, Trần Thị Thanh Thủy2 Trường Đại học Bách khoa - Đại học Đà Nẵng Trung tâm Công nghệ Sinh học Đà Nẵng *Tác giả liên hệ: dqhai@dut.udn.vn (Nhận bài: 12/2/2022; Chấp nhận đăng: 14/4/2022) Tóm tắt - Nghiên cứu nhằm phân lập, tuyển chọn định danh chủng vi sinh vật có lợi bước đầu ứng dụng để xử lý chất thải rắn hữu làm phân bón hữu sinh học Kết tuyển chọn ba chủng vi khuẩn CT1, CT10 R35 có hoạt tính amylase, cellulase protease cao từ mẫu rơm rạ hoai mục tự nhiên chất thải rắn sinh hoạt hữu phân hủy Định danh phương pháp giải trình tự Sanger xác định chủng CT1, CT10 R35 thuộc loài Bacillus velezensis, Bacillus amyloliquefaciens Bacillus subtilis Kết thử nghiệm dùng chủng để xử lý chất thải rắn hữu cho thấy nâng cao đáng kể hiệu phân hủy chất hữu sau 30 ngày ủ sản phẩm phân bón hữu sinh học hoai mục bảo đảm độ chín Hàm lượng nitơ tổng phốt tổng thí nghiệm có sử dụng chủng vi khuẩn tuyển chọn (tương ứng 0,13 0,08%) cao so với thí nghiệm đối chứng (tương ứng 0,09 0,06%) Abstract - This study aims to isolate, select and identify effective microbial strains and initially apply these selected microorganisms to treat organic solid waste for making bio-organic fertilizer Through screenings, three bacterial strains, namely CT1, CT10 and R35 with high amylase, cellulase and protease activities have been isolated and selected from samples of natural straw and organic domestic solid waste compost The strains CT1, CT10 and R35 were identified as members of the species Bacillus velezensis, Bacillus amyloliquefaciens and Bacillus subtilis, respectively by Sanger sequencing The result showed that the use of these strains in treating organic solid waste has significantly improved the efficiency of organic matter decomposition after 30 days of composting and the bio-organic fertilizer product has fallen into decayed and matured The contents of total nitrogen and total phosphorus of the experiment using selected strains (0.13 and 0.08%, respectively) were higher than the control experiment (0.09 and 0.06%, respectively) Từ khóa - Chất thải rắn hữu cơ; Phân lập ; Vi sinh vật; Hoạt tính enzyme; Phân hữu sinh học Key words - Organic solid waste; Isolation; Microorganism; Enzyme activity; Bio-organic fertilizer Đặt vấn đề Cùng với phát triển kinh tế, xã hội, gia tăng dân số lãng phí tài nguyên, lượng chất thải rắn hữu ngày gia tăng, thành phần ngày phức tạp tiềm ẩn nhiều nguy độc hại với môi trường sức khỏe người Lượng chất thải rắn hữu tăng nhanh chóng, tái sử dụng khơng đáng kể quay vòng chất thải gặp nhiều khó khăn [1] Vì vậy, việc quản lý xử lý chất thải cách hợp lý yêu cầu cấp thiết Xử lý chất thải hữu phương pháp sinh học bao gồm công việc phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả phân hủy mạnh hợp chất hữu chất thải thành phân bón hữu sinh học giải pháp nhà khoa học quan tâm Đây giải pháp xử lý chất thải thân thiện với môi trường, nhân tố góp phần đảm bảo tính bền vững cho môi trường sinh thái Trong năm qua, nhiều nhà khoa học nghiên cứu phân lập, tuyển chọn số chủng vi sinh vật có lợi để xử lý loại chất thải Nguyễn Xuân Thành cộng [2] phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật có hoạt tính sinh học cao để ứng dụng vào sản xuất phân hữu vi sinh vật bón cho trồng Từ mẫu nước rỉ bãi rác, Hà Thanh Toàn cộng [3] phân lập 17 dòng vi khuẩn phân giải protein, 24 dòng vi khuẩn phân giải cellulose 21 dòng vi khuẩn phân giải tinh bột nghiên cứu ứng dụng dòng vi khuẩn hữu hiệu việc xử lý chất thải hữu Trong nghiên cứu khác, trình phân lập, tuyển chọn số chủng vi khuẩn từ mẫu phụ phẩm sau thu hoạch vải hoai mục tự nhiên, mẫu đất trồng mẫu mùn đất thực Trong đó, xác định hai chủng vi khuẩn Bacillus cereus Bacillus toyonensis có hoạt tính cellulase, amylase, protease cao, có khả sinh trưởng thể hoạt tính enzyme ngoại bào tốt môi trường nuôi cấy, điều kiện pH, nhiệt độ khác Do đó, hữu hiệu dùng chủng để xử lý chất thải hữu thành phân bón hữu sinh học [4] Một số nghiên cứu khác cho thấy, chủng vi khuẩn Bacillus, Clostridium thường diện nhiều phân hữu (compost) ủ gia đình hay thương mại [5, 6] Theo nghiên cứu Lu cộng [7], số chủng vi khuẩn ưa nhiệt có hoạt tính enzyme cellulase cao phân lập tinh từ hệ thống ủ phân compost hỗn hợp chất thải hoa rau Nghiên cứu đặc điểm hình thái sinh lý chủng phân lập cho thấy, chúng có tác động tích cực đến phân hủy cellulose hai The University of Danang - University of Science and Technology (Dang Quang Hai) Danang Biotechnology Center (Tran Thi Thanh Thuy) ISSN 1859-1531 - TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG, VOL 20, NO 5, 2022 số chủng có quan hệ mật thiết với Bacillus pasteurii Bacillus cereus Ngoài ra, vi khuẩn thuộc chi Clostridium, Cellulomonas, Cellulosimicrobium, Thermomonospora, Bacillus, Ruminococcus, Erwinia, Bacteriodes, Acetovibrio, Streptomyces, Microbispora, Fibrobacter Paenibacillus nghiên cứu để tạo loại enzyme khác ủ chất thải hữu thành phân bón hữu sinh học [8] Một số chủng vi sinh vật phân giải cellulose để sản xuất chế phẩm sinh học nhằm phân hủy chất thải nông nghiệp thành phân hữu vi sinh phân lập, tuyển chọn [9] Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả tiến hành phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính enzyme cao từ hệ vi sinh vật thích nghi tự nhiên với mơi trường chất thải để góp phần làm giàu thêm giống vi sinh vật phân giải mạnh hợp chất cellulose, tinh bột protein, phối hợp chủng tuyển chọn để ứng dụng vào xử lý chất thải rắn hữu nhằm tạo nguồn phân bón hữu sinh học giá trị cao cho ngành nông nghiệp Đối tượng phương pháp nghiên cứu 2.1 Đối tượng nghiên cứu Các chủng vi sinh vật có khả phân hủy chất hữu cao phân lập tuyển chọn từ rơm rạ hoai mục tự nhiên chất thải rắn sinh hoạt hữu phân hủy tự nhiên địa bàn thành phố Đà Nẵng 2.2 Phương pháp nghiên cứu - Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật có lợi chất thải phương pháp pha lỗng thập phân Mơi trường sử dụng q trình phân lập mơi trường thạch cao thịt - pepton Mẫu chất thải sau pha lỗng đến độ pha lỗng thích hợp cấy lên bề mặt môi trường chứa đĩa petri, sau ni điều kiện nhiệt độ 30 - 35C thời gian 24 - 48 Khi khuẩn lạc xuất hiện, tiến hành tuyển chọn khuẩn lạc mọc tách biệt, hình dạng to, khỏe,… để cấy chuyền vào ống nghiệm thạch nghiêng, hay đĩa petri nhằm nghiên cứu [10] Quan sát đặc điểm hình thái vi sinh vật phương pháp làm tiêu giọt ép nhuộm Gram [10] Khảo sát động thái sinh trưởng vi sinh vật phương pháp xác định thay đổi mật độ tế bào vi sinh vật theo thời gian Để khảo sát động thái sinh trưởng chủng vi sinh vật tuyển chọn, sử dụng môi trường cao thịt - pepton Vi khuẩn nuôi mơi trường dịch thể bình tam giác 250 ml, bình chứa 150 ml mơi trường (1 ống giống gốc/bình tam giác) Mỗi chủng tiến hành khảo sát điều kiện hiếu khí (ni máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút) Sau 24 lấy mẫu xác định mật độ tế bào vi sinh vật Mật độ tế bào vi sinh vật xác định theo phương pháp đếm số khuẩn lạc phát triển môi trường thạch nuôi cấy đĩa thạch [11] Xác định hoạt tính enzyme chủng vi sinh vật tuyển chọn phương pháp khuếch tán phóng xạ mơi trường thạch đĩa [10, 12] Dùng đĩa petri chứa mơi trường thạch - cao thịt - pepton có bổ sung riêng biệt 1% tinh bột tan, 1% carboxymethyl cellulose (CMC) 1% casein để thử hoạt tính enzyme amylase, cellulase, hay protease 57 tương ứng Dịch nuôi cấy chủng vi sinh vật nhỏ vào lỗ bề mặt đĩa thạch Ủ nhiệt độ - 6C 24 để dịch enzyme khuếch tán vào bề mặt thạch Sau đó, ủ nhiệt độ 30 - 35C 24 để dịch enzyme phân giải chất Lấy nhuộm màu Sử dụng thuốc thử Lugol để kiểm tra hoạt tính enzyme phân hủy tinh bột, thuốc thử Congo red để kiểm tra hoạt tính enzyme phân hủy cellulose, thuốc thử Fraziae để kiểm tra hoạt tính enzyme phân hủy protein Thời gian nhuộm - phút, sau loại bỏ phần thuốc nhuộm dư khỏi đĩa thạch để quan sát vòng phân giải Đối với nhuộm thuốc thử Congo red để 15 phút, sau rửa lại dung dịch muối NaCl 1M 15 phút Đo kích thước vịng phân giải chất D (mm), kích thước lỗ thạch d (mm) Tính hiệu số V (mm) = D - d để chọn chủng vi sinh vật có hoạt tính enzyme mạnh Chỉ số V lớn cho thấy hoạt lực enzyme mạnh - Kiểm tra tính đối kháng chủng vi sinh vật Sử dụng phương pháp cấy vạch thẳng vng góc đĩa thạch chứa môi trường thạch - cao thịt - pepton để đánh giá tính đối kháng chủng vi sinh vật nghiên cứu Cấy chủng dọc theo đường thẳng riêng rẽ đĩa thạch vuông góc với nhau, ni 30 - 35°C 48 Tiến hành quan sát sinh trưởng chủng đường giao nhau, khả không ức chế xuất đường giao mọc đan chéo [13] - Định danh chủng vi sinh vật Các chủng vi sinh vật định danh phương pháp giải trình tự gen theo phương pháp Sanger hệ thống thiết bị giải trình tự gen tự động ABI 3130/3500 dựa nguyên tắc điện di mao quản Thiết bị gồm mao quản chứa gel polyacrylamide cho phép phân tích nhiều mẫu lần điện di Hệ thống detector gồm camera có chùm tia laser qua để ghi nhận tín hiệu huỳnh quang cách xác Trong suốt q trình điện di, có vạch điện di qua chùm tia laser vạch điện di phát sáng camera ghi nhận lưu lại thành cường độ đỉnh sáng (peak) biểu đồ Từ biểu đồ đỉnh cường độ sáng này, máy so dòng đỉnh tương ứng với phân tích thành trình tự đoạn DNA Trình tự DNA gen so sánh với sở liệu di truyền chủng vi sinh vật có “Genebank” để định danh loài - Nhân sinh khối vi sinh vật Giống gốc chủng vi sinh vật tuyển chọn từ ống nghiệm thạch nghiêng cấy vào môi trường cao thịt - pepton, nuôi máy lắc 150 vòng/phút nhiệt độ phòng thời gian 24 Sau thời gian nuôi cấy, phối trộn chủng theo tỷ lệ để thu hỗn hợp dịch giống Sau chuyển hỗn dịch giống vào mơi trường cao thịt - pepton với tỷ lệ 10%, nuôi máy lắc 150 vòng/phút nhiệt độ phòng thời gian 24 để thu dịch sinh khối vi sinh vật Dịch sinh khối thu sử dụng cho thí nghiệm ủ phân - Thử nghiệm khả phân giải chất thải hữu chủng vi sinh vật tuyển chọn Chất thải hữu sử dụng để ủ phân bao gồm hỗn hợp chất thải nông nghiệp (75%), bao gồm loại phế thải rau màu, thực vật chết, cỏ dại Làng rau La Hường (Phường Hịa Thọ Đơng, Quận Cẩm Lệ, Tp Đà Nẵng) chất thải Đặng Quang Hải, Trần Thị Thanh Thủy 58 rắn sinh hoạt hữu dễ phân hủy (25%), bao gồm loại thức ăn thừa, rau, củ hỏng hộ gia đình địa bàn thành phố Đà Nẵng Nguyên liệu ủ thùng xốp có kích thước chiều dài x chiều rộng x chiều cao = 38 x 35 x 25 cm Các cơng thức thí nghiệm ủ phân trình bày Bảng Bảng Các cơng thức thí nghiệm Khối lượng Phân lân Vôi bột Tỷ lệ cấy Công thức chất thải (kg) (g) (g) giống (%) I (Đối chứng) 150 100 II 150 100 Chất thải có kích thước lớn băm nhỏ thành đoạn - cm, bổ sung thêm lượng phân lân, vôi bột nhằm để giảm mát nitơ trình ủ phân cân độ pH khối ủ, trộn điều chỉnh độ ẩm khối nguyên liệu ủ khoảng 50 - 60% Sau cho vào thùng ủ Đối với mẫu thí nghiệm I (đối chứng) không bổ sung dịch sinh khối giống vi sinh vật Đối với mẫu thí nghiệm II, bổ sung dịch sinh khối giống vi sinh vật với tỷ lệ 5% Tiến hành ủ thời gian 30 ngày Xác định thay đổi nhiệt độ giảm chiều cao lớp nguyên liệu ủ thời điểm ngày trình ủ phân Đánh giá độ chín tính chất cảm quan phân ủ Xác định tiêu trước sau ủ phân gồm: Hàm lượng bon hữu (Organic carbon - OC), nitơ tổng phốt tổng - Phương pháp phân tích tiêu chất lượng phân bón Một số tiêu chất lượng phân bón xác định theo tiêu chuẩn Việt Nam Nhiệt độ đo trực tiếp máy đo nhiệt kế Khối lượng chiều cao khối ủ xác định phương pháp cân đo đạc Độ ẩm xác định theo phương pháp sấy khô đến khối lượng không đổi [14] Độ chín (độ hoai mục) xác định theo TCVN 7185:2002 [15] Hàm lượng bon hữu tổng số xác định theo phương pháp Walkley-Black [16] Hàm lượng nitơ tổng số xác định theo phương pháp Kjeldhal [17] Hàm lượng phốt hữu hiệu xác định theo phương pháp so màu [18] - Phương pháp phân tích, tổng hợp xử lý số liệu Các số liệu thu thập, thực nghiệm trình nghiên cứu phân tích, tổng hợp xử lý thống kê phần mềm Microsoft Office 2013 Kết nghiên cứu thảo luận 3.1 Phân lập tuyển chọn vi sinh vật có lợi chất thải Để phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả ứng dụng vào xử lý chất thải hữu u cầu chủng có khả đồng hóa sử dụng đa dạng hợp chất hữu có chất thải tinh bột, cellulose, protein,… [3] Do đó, trước hết tiến hành tuyển chọn chủng vi sinh vật có lực sinh tổng hợp đa enzyme Từ mẫu rơm rạ hoai mục phân lập 54 chủng vi sinh vật (R1 - R54) từ chất thải rắn sinh hoạt hữu phân hủy phân lập 23 chủng vi sinh vật (CT1 CT23) Từ tuyển chọn ba chủng CT1, CT10 R35 có hoạt tính phân hủy chất hữu mạnh Kết trình bày Bảng 2, Hình 1, Hình Hình Bảng Kết thử nghiệm khả sinh tổng hợp enzyme amylase, cellulase protease chủng vi sinh vật Chủng vi sinh vật Đường kính vịng phân giải trung bình ± độ lệch chuẩn (mm) Tinh bột CMC Casein CT1 9,66 ± 0,67 21,59 ± 0,50 21,35 ± 0,45 CT10 16,53 ± 0,46 19,26 ± 0,42 23,79 ± 0,44 R35 13,81 ± 0,49 22,13 ± 0,30 19,29 ± 0,15 Hình Vịng phân giải tinh bột chủng vi sinh vật Hình Vịng phân giải CMC chủng vi sinh vật Hình Vịng phân giải casein chủng vi sinh vật Kết nghiên cứu cho thấy chủng vi sinh vật có hoạt tính amylase, cellulase protease Trong đó, ba chủng CT1, CT10 R35 có hoạt tính cellulase protease mạnh, với đường kính vịng phân giải lớn 19 mm Ngồi ra, chủng CT10 có hoạt tính sinh tổng hợp amylase mạnh với đường kính vịng phân giải lớn 16 mm Theo Nguyễn Thị Thúy Nga cộng [19], vi sinh vật có hoạt tính sinh tổng hợp enzyme có đường kính vịng phân giải từ 15 mm trở lên, có hoạt tính mạnh có đường kính vịng phân giải từ 20 mm trở lên Do đó, sử dụng chủng vào xử lý chất thải hữu cơ, chúng có khả phân giải mạnh hợp chất hữu giàu tinh bột, cellulose protein 3.2 Tính đối kháng chủng vi sinh vật tuyển chọn Để khai thác phối hợp chủng tuyển chọn vào xử lý chất thải, điều kiện tiên chủng không cạnh tranh đối kháng lẫn Các chủng vi sinh vật cấy môi trường thạch - cao thịt - pepton để đánh giá tính đối kháng Kết thể Hình Kết nghiên cứu cho thấy chủng CT1, CT10 R35 phát triển đồng môi trường, không xuất vùng đối kháng, điều khẳng định chủng vi sinh vật tồn mơi trường ISSN 1859-1531 - TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG, VOL 20, NO 5, 2022 xử lý để thực chức chuyển hóa chất xử lý chất thải 59 405 Chủng CT1 Chủng CT10 Chủng R35 Hình Thử nghiệm khả đối kháng chủng vi sinh vật tuyển chọn Mật độ tế bào x108 (CFU/ml) 360 3.3 Định danh chủng vi sinh vật Các chủng vi sinh vật định danh phương pháp giải trình tự Sanger Kết trình bày Bảng Bảng Kết định danh chủng vi sinh vật Chủng vi sinh vật Kết định danh Tên loài CT1 Bacillus velezensis CT10 Bacillus amyloliquefaciens Độ tương đồng Hình ảnh nhuộm Gram 99,93% 100% 315 270 225 180 135 90 45 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 Thời gian (giờ) Hình Động thái sinh trưởng chủng vi khuẩn điều kiện nuôi máy lắc theo thời gian 3.5 Nghiên cứu xử lý chất thải rắn hữu làm phân bón hữu sinh học từ chủng vi khuẩn tuyển chọn - Sự thay đổi nhiệt độ trình ủ phân Nhiệt độ yếu tố có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng, phát triển phân hủy chất hữu vi sinh vật trình ủ phân Quá trình phân hủy chất hữu đống ủ giải phóng nhiệt làm cho đống ủ nóng lên Q trình phân hủy chất hữu mạnh nhiệt độ tăng cao [22] Sự thay đổi nhiệt độ trình ủ phân biểu diễn đồ thị Hình 60 Thí nghiệm I Thí nghiệm II 57 54 51 Bacillus subtilis 100% Như vậy, ba chủng tuyển chọn vi khuẩn, thuộc giống Bacillus Theo nghiên cứu trước chủng khơng gây độc tố an tồn [20, 21] Do đó, ba chủng vi khuẩn Bacillus tuyển chọn đáp ứng u cầu an tồn hồn tồn ứng dụng xử lý chất thải rắn hữu để làm phân bón hữu sinh học 3.4 Khảo sát động thái sinh trưởng chủng vi khuẩn chọn Khảo sát động thái sinh trưởng nhằm xác định thời điểm sinh trưởng phát triển cực đại chủng vi khuẩn điều kiện thích hợp Từ xác định thời gian nhân giống thích hợp để thu nhận sinh khối đưa vào xử lý chất thải nhằm đảm bảo tế bào vi khuẩn độ tuổi sinh lý thời gian sinh trưởng tốt nhất, có hoạt tính cao giúp phân hủy nhanh hợp chất hữu chất thải Động thái sinh trưởng chủng vi khuẩn biểu diễn Hình Kết nghiên cứu cho thấy, mật độ tế bào chủng CT10 đạt cao sau 24 nuôi cấy (317x108 CFU/ml) sau giảm dần Mật độ tế bào chủng CT1 R35 đạt cao sau 48 nuôi cấy (lần lượt 193x10 CFU/ml 350x108 CFU/ml) sau giảm dần Do vậy, nhân giống chủng để đưa vào xử lý chất thải nên kết thúc thời điểm 24 - 48 48 Nhiệt độ (oC) R35 45 42 39 36 33 30 27 24 21 18 12 15 18 21 24 27 30 Thời gian (ngày) Hình Sự thay đổi nhiệt độ theo thời gian Có thể thấy rằng, thí nghiệm I khơng bổ sung vi khuẩn tuyển chọn, trình phân hủy chất hữu diễn tự nhiên nhờ có vi sinh vật có sẵn chất thải Nhiệt độ tăng chậm đạt cao 37,7°C sau ngày ủ giảm liên tục ngày sau Sau 30 ngày ủ phân, trình phân hủy chất hữu diễn Đối với thí nghiệm II có bổ sung vi khuẩn tuyển chọn, nhiệt độ khối ủ tăng nhanh đạt cực đại vào ngày thứ mức 44,9°C Điều chứng tỏ tác nhân vi sinh vật bổ sung vào khối ủ thúc đẩy trình phân hủy chất hữu diễn nhanh hơn, mạnh từ ngày đầu sau ủ dẫn đến nhiệt độ khối ủ tăng nhanh cao so với thí nghiệm I Sự tăng nhiệt độ khối ủ có tác dụng tăng cường phản ứng hố học xảy q trình ủ phân, kích thích hoạt động chủng vi sinh vật ưa nhiệt Sau đó, nhiệt Đặng Quang Hải, Trần Thị Thanh Thủy 60 độ giảm xuống nhanh hàm lượng dinh dưỡng đơn giản sẵn dàng phân hủy cạn dần, hoạt động chủng vi sinh vật giảm xuống, dẫn đến nhiệt độ khối ủ giảm xuống Từ ngày thứ 27 đến ngày thứ 30 sau ủ, nhiệt độ khối ủ thí nghiệm II ổn định, chứng tỏ nguyên liệu hữu ngừng chuyển hóa nên khơng giải phóng lượng Như vậy, sau 26 ngày trình phân hủy dừng lại - Sự thay đổi chiều cao lớp nguyên liệu ủ Sự thay đổi chiều cao lớp nguyên liệu 30 ngày ủ phân thí nghiệm I, II thể Hình 24 Thí nghiệm I Thí nghiệm II 22 20 độ chín Tuy nhiên, thí nghiệm đối chứng I nhiệt độ chưa ổn định, cịn có chênh lệch lần đo cho thấy sản phẩm chưa hoai mục hoàn toàn - Tính chất cảm quan phân ủ Sau 30 ngày ủ phân, tính chất cảm quan phân ủ đánh giá Kết trình bày Bảng Hình Bảng Tính chất cảm quan phân ủ Chỉ tiêu đánh giá I (Đối chứng) II Màu sắc Nâu vàng Nâu đen Mùi Hôi nhẹ Không mùi Thành phần giới Cứng Mủn Chiều cao (cm) 18 16 14 12 10 0 12 15 18 21 24 27 30 Thời gian (ngày) Hình Sự thay đổi chiều cao lớp nguyên liệu ủ theo thời gian Quan sát thấy chiều cao thí nghiệm giảm mạnh trình ủ phân Mức giảm thí nghiệm II lớn so với thí nghiệm đối chứng I (từ ban đầu 22 cm giảm xuống đến 7,8 cm thí nghiệm I 4,3 cm thí nghiệm II vào ngày ủ thứ 30) Kết nghiên cứu cho thấy, việc ủ chất thải hữu với bổ sung chủng vi khuẩn tuyển chọn làm tăng phân hủy, chuyển hóa mạnh chất thải hữu làm giảm chiều cao lớp nguyên liệu ủ lớn so với mẫu ủ đối chứng Sự giảm chiều cao lớp nguyên liệu ủ kết phân hủy mạnh chất hữu chất thải hoạt động vi sinh vật hữu hiệu trình ủ phân số nhà nghiên cứu trước [23, 24] - Đánh giá độ chín phân ủ Độ chín tiêu quan trọng để xác định sản phẩm phân ủ hoai mục hồn tồn hay chưa Khi đánh giá độ chín, sử dụng nhiệt kế có mức đo nhiệt độ từ 0C đến 100C, cắm sâu vào thùng ủ chứa mẫu thí nghiệm Sau 15 phút, đọc nhiệt độ lần thứ Theo dõi thay đổi nhiệt độ thời gian ngày liên tiếp, ngày đo lần vào thời điểm định Phân hữu sinh học bảo đảm độ chín nhiệt độ không thay đổi suốt thời gian theo dõi Kết tổng hợp Bảng Bảng Kết xác định nhiệt độ ngày ủ phân Thời điểm đo Nhiệt độ (°C) Ngày thứ 28 Ngày thứ 29 Ngày thứ 30 I (Đối chứng) 24,0 23,2 22,5 II 23,2 23,0 23,0 Kết cho thấy, nhiệt độ ngày đánh giá liên tiếp mẫu II ổn định, theo tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN 7185:2002) sản phẩm hoai mục bảo đảm Thí nghiệm I Thí nghiệm II Hình Màu sắc kết cấu sản phẩm phân ủ Nhìn chung, tính chất cảm quan ngun liệu ủ có thay đổi đáng kể so với lúc chưa ủ, chuyển hóa hợp chất hữu nhờ hoạt động sống vi sinh vật phản ứng hóa lý xảy q trình ủ Đối với mẫu I khơng bổ sung giống vi sinh vật cịn mùi nhẹ cịn cứng Đối với mẫu II có bổ sung giống vi khuẩn cho sản phẩm màu nâu đen, không mùi mủn cầm lên - Đánh giá chất lượng sản phẩm phân hữu sinh học sau ủ Sản phẩm phân ủ phân tích số tiêu chất lượng Kết trình bày Bảng Bảng Chất lượng sản phẩm phân hữu sinh học Chỉ tiêu đánh giá Sau ủ 30 ngày Trước ủ I (Đối chứng) II Các bon hữu (%) 39,74 29,49 24,36 Nitơ tổng (%) 0,19 0,09 0,13 Phốt tổng (% P2O5) 0,04 0,06 0,08 Kết Bảng cho thấy, hàm lượng OC hai cơng thức đối chứng I thí nghiệm II giảm so với ban đầu, chứng tỏ hai cơng thức ủ diễn q trình phân giải hợp chất hydratcacbon Tuy nhiên, hàm lượng OC giảm khoảng 25,8% công thức đối chứng lại giảm tới 38,7% cơng thức thí nghiệm Sự khác biệt chứng tỏ xử lý chất thải vi khuẩn tuyển chọn, trình phân giải tinh bột, cellulose diễn mạnh nên dẫn đến hàm lượng OC cơng thức thí nghiệm giảm nhiều so với đối chứng Hơn nữa, OC thấp xem số độ chín độ ổn định sản phẩm phân ủ [25] Hàm lượng nitơ tổng hai công thức ủ giảm so với ban đầu Điều vi sinh vật khối ủ sử dụng chất dinh dưỡng nitơ có sẵn nguyên liệu ủ để sinh trưởng phát triển nên làm giảm hàm lượng chất Ở công thức đối chứng, nitơ giảm từ 0,19% xuống ISSN 1859-1531 - TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ - ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG, VOL 20, NO 5, 2022 0,09% Trong cơng thức thí nghiệm, nitơ giảm từ 0,19% xuống 0,13% Mức giảm nitơ cơng thức thí nghiệm thấp so với đối chứng Như bổ sung vi khuẩn vào ủ chất thải giúp làm tăng q trình chuyển hố chất hữu giảm lượng nitơ thất thoát Kết cho thấy, hàm lượng phốt tổng hai công thức ủ tăng lên so với ban đầu cơng thức thí nghiệm cao so với cơng thức đối chứng không bổ sung vi khuẩn Điều chứng tỏ ủ chất thải có bổ sung vi khuẩn tuyển chọn giúp cho q trình khống hóa diễn thuận lợi Kết luận Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn mẫu rơm rạ hoai mục tự nhiên chất thải rắn sinh hoạt hữu phân hủy có hoạt tính enzyme amylase, cellulase protease cao để ứng dụng vào xử lý chất thải rắn hữu làm phân bón hữu sinh học Các chủng khơng thể đặc tính đối kháng lẫn Kết định danh xác định CT1 Bacillus velezensis, CT10 Bacillus amyloliquefaciens R35 Bacillus subtilis Xử lý chất thải rắn hữu với chủng vi khuẩn tuyển chọn cho thấy, khả phân giải hợp chất hữu chúng tốt Mức giảm chiều cao lớp nguyên liệu ủ thí nghiệm có bổ sung giống vi khuẩn tuyển chọn lớn so với thí nghiệm đối chứng, hàm lượng OC giảm so với ban đầu công thức đối chứng (25,8%) thấp so với cơng thức thí nghiệm (38,7%), hàm lượng chất dinh dưỡng nitơ, phốt công thức thí nghiệm cao so với cơng thức đối chứng Sản phẩm sau 30 ngày ủ với vi khuẩn tuyển chọn đạt độ chín theo tiêu chuẩn quy định, có màu nâu đen, khơng mùi mủn sử dụng loại phân bón hữu sinh học Lời cảm ơn: Bài báo tài trợ Trường Đại học Bách khoa - Đại học Đà Nẵng với đề tài có mã số: T202102-36 [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Bộ Tài nguyên Môi trường, Báo cáo Hiện trạng môi trường quốc gia giai đoạn 2016 - 2020, Nhà xuất Dân Trí, Hà Nội, 2021 [2] Nguyễn Xuân Thành, Vũ Thị Hoàn, Lê Thị Hồng Xuân, Nguyễn Thị Minh, Trần Văn Chiến, Đinh Hồng Duyên, Phân lập tuyển chọn giống vi sinh vật xây dựng quy trình sản xuất phân hữu vi sinh vật bón cho trồng, Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ, B2006-11-23, 2007 [3] Hà Thanh Toàn, Mai Thu Thảo, Nguyễn Thu Phướng, Trần Lê Kim Ngân, Bùi Thế Vinh, Cao Ngọc Điệp, “Phân lập vi khuẩn phân giải cellulose, tinh bột protein nước rỉ từ bãi rác thành phố cần thơ”, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, Tập 10, 2008, 195-202 [4] Đinh Hồng Duyên, Nguyễn Thế Bình, Vũ Thanh Hải, “Tuyển chọn vi khuẩn có khả phân huỷ phế phụ phẩm sau thu hoạch vải”, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, Tập 53, 2017, 61-70 [5] Guo Y., Zhu N., Zhu S., Deng C., “Molecular phylogenetic diversity of bacteria and its spatial distribution in composts”, Journal of Applied Microbiology, 103, 2007, 1344-1354 [6] Vrints M., Bertrand S., Collend J M., “A bacterial population study [21] [22] [23] [24] [25] 61 of commercialized wastewater inoculants”, Journal of Applied Microbiology, 103, 2007, 2006-2015 Lu W.J., Wang H.T., Yang S J., Wang Z.C., Nie Y.F., “Isolation and characterization of mesophilic cellulose-degrading bacteria from flower stalks-vegetable waste co-composting system”, Journal of General and Applied Microbiology, 51(6), 2006, 353-360 Lo Y.C., Saratale G.D., Chen W.M., Bai M.D., Chang J.S., “Isolation of cellulose-hydrolytic bacteria and applications of the cellulolytic enzymes for cellulosic biohydrogen production”, Enzyme and Microbial Technology, 44(6-7), 2009, 417-425 Yang L.L., Zhang Z., Wu M., Feng J.F., “Isolation, screening and identification of cellulolytic bacteria from natural reserves in the subtropical region of china and optimization of cellulose production by Paenibacillus terrae ME27-1”, BioMed Research International, 2014, 2014, 1-14 Nguyễn Lân Dũng (chủ biên), Phạm Thị Trân Châu, Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật tập 1, tập 2, tập 3, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, 1978 Bộ Khoa học Công nghệ, TCVN 4884-1:2015 (ISO 48331:2013), Phương pháp định lượng vi sinh vật - Phần 1: Đếm khuẩn lạc 30C kỹ thuật đổ đĩa, Hà Nội, 2015 Jmeii L., Soufi L., Abid, N., Mahjoubi M., Roussos S., Ouzari H.I., Cherif A., Garna H., “Assessment of biotechnological potentials of strains isolated from repasso olive pomace in Tunisia”, Annals of Microbiology, 69, 2019, 1177-1190 Lê Thị Hải Yến, Nguyễn Đức Hiền, “Khảo sát đặc tính probiotic chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập tỉnh Đồng sơng Cửu Long”, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, Tập 2, 2016, 26-32 Bộ Khoa học Cơng nghệ, TCVN 9297:2012, Phân bón - Phương pháp xác định độ ẩm, Hà Nội, 2012 Bộ Khoa học Công nghệ, TCVN 7185:2002, Phân hữu vi sinh vật, Hà Nội, 2002 Bộ Khoa học Cơng nghệ, TCVN 9294:2012, Phân bón - Xác định cacbon tổng số phương pháp Walkley -Black, Hà Nội, 2012 Bộ Khoa học Công nghệ, TCVN 8557:2010, Phân bón - Phương pháp xác định nitơ tổng số, Hà Nội, 2010 Bộ Khoa học Công nghệ, TCVN 8559:2010, Phân bón - Phương pháp xác định phốt hữu hiệu, Hà Nội, 2010 Nguyễn Thị Thuý Nga, Phạm Quang Nam, Lê Xuân Phúc, Phạm Quang Thu, Nguyễn Minh Chí, “Phân lập tuyển chọn vi khuẩn phân giải xenlulo sản xuất phân hữu sinh học”, Tạp chí Khoa học Lâm nghiệp, 2, 2015, 3841-3850 Algburi A., Volski A., Cugini C., Walsh E., Chistyakov V., Mazanko M., Bren A., Dicks L., Chikindas M., “Safety Properties and Probiotic Potential of Bacillus subtilis KATMIRA1933 and Bacillus amyloliquefaciens B-1895”, Advances in Microbiology, 6(6), 2016, 432-452 Butkhot N., Soodsawaeng P., Vuthiphandchai V., Nimrat S., “Characterisation and biosafety evaluation of a novel bacteriocin produced by Bacillus velezensis BUU004”, International Food Research Journal, 26(5), 2019, 1617-1625 Tognetti C., Mazzarino M.J., Laos, F., “Improving the quality of municipal organic waste compost”, Bioresource Technology, 98(5), 2007, 1067-1076 Yue B., Chen T., Gao D., Zheng G., Liu B., Lee D., “Pile settlement and volume reduction measurement during forced-aeration static composting”, Bioresource Technology, 99(16), 2008, 7450-7457 Petric I., Avdihodžić E., Ibrić N., “Numerical simulation of composting process for mixture of organic fraction of municipal solid waste and poultry manure”, Ecological Engineering, 75(2), 2015, 242-249 Inbar Y., Hadar Y., Chen Y., “Recycling of cattle manure: the composting process and characterization of maturity”, Journal of Environmental Quality, 22(4), 1993, 857-863  ... đó, ba chủng vi khuẩn Bacillus tuyển chọn đáp ứng yêu cầu an tồn hồn tồn ứng dụng xử lý chất thải rắn hữu để làm phân bón hữu sinh học 3.4 Khảo sát động thái sinh trưởng chủng vi khuẩn chọn Khảo... 3.3 Định danh chủng vi sinh vật Các chủng vi sinh vật định danh phương pháp giải trình tự Sanger Kết trình bày Bảng Bảng Kết định danh chủng vi sinh vật Chủng vi sinh vật Kết định danh Tên loài... cứu phân tích, tổng hợp xử lý thống kê phần mềm Microsoft Office 2013 Kết nghiên cứu thảo luận 3.1 Phân lập tuyển chọn vi sinh vật có lợi chất thải Để phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật có