Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích đa dạng và định danh loài ở tập đoàn cây dó bầu

Viết thuê đề tài giá rẻ trọn gói - KB Zalo/Tele : 0973.287.149 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, xin chân thành cảm ơn PGS TS Chu Hồng Hà, Trưởng Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Cơng nghệ Việt Nam tận tình hướng dẫn giúp đỡ Tôi xin cảm ơn GS TS Lê Trần Bình, TS Phạm Bích Ngọc, TS Vũ Huyền Trang, NCS Đỗ Tiến Phát tập thể Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật giúp đỡ suốt q trình thực tập Tơi xin gửi lời cảm ơn đến thầy, cô Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình học tập Cuối tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn tới gia đình bạn bè ln ln động viên tinh thần để tơi hồn thành luận văn Hà Nội, tháng 01 năm 2012 Học viên Hoàng Đăng Hiếu Luanvanmaster.com – Cần Kham Thảo - Kết bạn Zalo/Tele : 0973.287.149 i Viết thuê đề tài giá rẻ trọn gói - KB Zalo/Tele : 0973.287.149 MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan dó bầu 1.1.1 Đặc điểm phân loại vị trí phân bố dó bầu .2 1.1.2 Đặc điểm sinh trưởng phát triển dó bầu .3 1.1.3 Giá trị kinh tế sinh thái dó bầu .5 1.1.4 Thực trạng trồng khai thác dó bầu nước giới 1.1.5 Các nhân tố ảnh hưởng tới khả tạo trầm nhân tạo 1.2 Một số phương pháp sử dụng việc định danh loài xác định quan hệ di truyền 10 1.3 DNA barcode - quan điểm phân loại 12 1.3.1 Giới thiệu DNA barcode 12 1.3.2 Các đặc điểm trình tự barcode 13 1.4 Một số locus sử dụng phương pháp DNA barcode thực vật 14 1.4.1 Trình tự gen nhân 14 1.4.2 Vùng gen mã hóa ribosome 15 1.4.3 Trình tự gen luc lạp .15 1.4.4 Trình tự gen rbcL 17 1.4.5 Trình tự gen matK 17 1.4.6 Trình tự gen rpoB rpoC1 18 1.4.7 Trình tự gen ycf5 18 1.4.8 Trình tự hai gen trnH - psbA 18 1.4.9 Trình tự hai gen trnL(UAA) - trnF(GAA) 19 1.5 Tình hình nghiên cứu DNA barcode thực vật 19 1.6 Một số kết nghiên cứu dó bầu Việt Nam giới 21 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .22 2.1.Vật liệu 22 2.1.1 Thực vật .22 2.1.2 Chủng vi khuẩn 23 Luanvanmaster.com – Cần Kham Thảo - Kết bạn Zalo/Tele : 0973.287.149 ii Viết thuê đề tài giá rẻ trọn gói - KB Zalo/Tele : 0973.287.149 2.1.3 Hóa chất .23 2.1.4 Máy móc thiết bị 23 2.1.5 Các cặp mồi sử dụng nghiên cứu 24 2.2 Phương pháp nghiên cứu 24 2.2.1 Các bước nghiên cứu 24 2.2.2 Các phương pháp nghiên cứu 24 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .33 3.1 Kết tách chiết tinh DNA tổng số 33 3.2 Tìm nhiệt độ gắn mồi đăc hiệu phản ứng PCR 34 3.3 Kết nhân gen với cặp mồi nghiên cứu 36 3.3.1 Kết nhân gen rbcL 36 3.3.2 Kết nhân gen rpoB 36 3.3.3 Kết nhân gen psbA-trnH 37 3.3.4 Kết nhân gen ITS 38 3.4 Kết tách dòng gen 38 3.4.1 Kết tinh sản phẩm PCR (thôi gel) 38 3.4.2 Kết chuyển gen vào vector tách dòng 39 3.4.3 Kết biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến E.coli 39 3.4.4 Kết chọn lọc dòng tế bào mang gen tái tổ hợp .40 3.4.5 Kết tách chiết plasmid tái tổ hợp 41 3.4.6 Kết cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp .42 3.5 Xác định phân tích trình tự nucleotide đoạn DNA thị .43 3.5.1 Kết xác định phân tích trình tự gen trn-psbA 44 3.5.2 Kết xác định phân tích trình tự gen rpoB 46 3.5.3 Kết xác định phân tích trình tự vùng gen lục lạp rbcL 48 3.5.4 Kết xác định phân tích trình tự gen ITS 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .58 TÀI LIỆU THAM KHẢO .59 Luanvanmaster.com – Cần Kham Thảo - Kết bạn Zalo/Tele : 0973.287.149 iii Viết thuê đề tài giá rẻ trọn gói - KB Zalo/Tele : 0973.287.149 DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Thông tin số mồi DNA Barcode thiết kế cho hệ gen lục lạp 16 Bảng 2.1 Thơng tin mẫu dó bầu dùng nghiên cứu 22 Bảng 2.2 Trình tự cặp mồi nhân gen barcode 24 Bảng 2.3 Thành phần dung dịch đệm rửa .25 Bảng 2.4 Thành phần dung dịch đệm tách 25 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR 26 Bảng 2.6 Chu kỳ phản ứng PCR 26 Bảng 2.7 Thành phần phản ứng ligase 28 Bảng 2.8 Thành phần môi trường chọn lọc tế bào vi khuẩn mang DNA tái tổ hợp 29 Bảng 2.9 Thành phần phản ứng PCR kiểm tra khuẩn lạc .30 Bảng 2.10 Chu kỳ phản ứng PCR- clony 30 Bảng 2.11 Thành phần hóa chất tách plasmid 30 Bảng 2.12 Thành phần hóa chất dùng phản ứng cắt enzyme .31 Bảng 3.1 Nhiệt độ bắt mồi kích thước gen cặp mồi nghiên cứu 34 Bảng 3.2 So sánh trình tự vùng trnH-psbA intergenic lục lạp .45 Bảng 3.3 So sánh trình tự vùng gen lục lạp rpoB 47 Bảng 3.4 So sánh trình tự vùng gen lục lạp rbcL 50 Bảng 3.5 Vị trí sai khác dùng để phân loại đoạn gen vùng rbcL 51 Bảng 3.6 So sánh trình tự vùng gen ribosom ITS 54 Bảng 3.7 Các vị trí sai khác dùng để phân loại đoạn gen vùng ITS 55 Luanvanmaster.com – Cần Kham Thảo - Kết bạn Zalo/Tele : 0973.287.149 iv Viết thuê đề tài giá rẻ trọn gói - KB Zalo/Tele : 0973.287.149 DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Lá dó bầu Hình 1.2 Hoa dó bầu .5 Hình 2.1 Sơ đồ vector pBT 27 Hình 3.1 Kết điện di DNA tổng số số mẫu dó bầu nghiên cứu 33 Hình 3.2 Kết chạy PCR - gradient thị rpoB ngưỡng nhiệt độ từ 49oC tới 58oC 35 Hình 3.3 Kết điện di sản phẩm PCR gen rbcLcủa mẫu dó bầu nghiên cứu .36 Hình 3.4 Kết điện di sản phẩm PCR gen rpoB mẫu dó bầu nghiên cứu .37 Hình 3.5.Kết điện di sản phẩm PCR gen psbA-trnH mẫu dó bầu nghiên cứu 37 Hình 3.6 Kết điện di sản phẩm PCR gen ITS mẫu dó bầu nghiên cứu .38 Hình 3.7 Kết tinh sản phẩm PCR gen rpoB 39 Hình 3.8 Kết biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến 40 Hình 3.9 Kết điện di sản phẩm PCR - clony khuẩn lạc mồi rbcL 41 Hình 3.10 Kết điện di plasmid tách chiết .42 Hình 3.11 Kết điện di sản phẩm cắt enzyme BamHI mồi rbcL .43 Hình 3.12 Cây phân loại kết mồi ITS 56 Luanvanmaster.com – Cần Kham Thảo - Kết bạn Zalo/Tele : 0973.287.149 v Viết thuê đề tài giá rẻ trọn gói - KB Zalo/Tele : 0973.287.149 BẢNG CHỮ VIẾT TẮT bp CBOL CTAB DNA dNTP E coli EDTA IPTG ITS-rDNA Kb LB PCR RNA rDNA RAPD RFLP Rnase SDS Sol STS TAE Taq polymerase TE X-gal Base pair Consortium for the Barcode of Life Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide Deoxyribonucleic acid Deoxyribonucleotide triphosphate Escherichia coli Ethylenediaminetetraacetic acid Isopropylthio-beta-D-galactoside Internal Transcribed Spacer-rDNA Kilobase Luria Bertani Polymerase Chain Reaction Ribonucleic acid Ribosome deoxyribonucleic acid Random Amplyfied Polymorphism DNA Restriction Fragment Length Polymorphism Ribonuclease Sodium dodecyl sulphate Solution Sequence-Tagged Site Tris - Acetic acid - EDTA Thermus aquaticus polymerase Tris - Ethylenediaminetetraacetic acid X - - brom - - chloro3 - indolyl - β - D - galactosidase Luanvanmaster.com – Cần Kham Thảo - Kết bạn Zalo/Tele : 0973.287.149 vi Viết thuê đề tài giá rẻ trọn gói - KB Zalo/Tele : 0973.287.149 MỞ ĐẦU Cây dó bầu (Aquilaria sp) lồi thực vật đặc hữu nước ta, phân bố rải rác từ Bắc tới Nam, tập trung nhiều tỉnh miền Trung đặc biệt Hà Tĩnh Quảng Nam Cây dó bầu mang lại giá trị kinh tế lớn với mục đích chủ yếu khai thác trầm hương, mặt hàng có giá trị kinh tế cao sử dụng công nghiệp mỹ phẩm, dược liệu, tôn giáo, chế tác đồ thủ công mỹ nghệ Ở nước ta phát loài dó bầu phân bố rải rác rừng rậm nhiệt đới thường xanh, ẩm nguyên sinh: A crassna (Dó bầu, Dó tía, Dó trắng), A baillonii (Dó Gạch), A rugosa (Dó Quả Nhăn), A malaccensis (Dó Mã Lai), A sinensis (Dó Trung Quốc), A banaensis (Dó Bà Nà) Trong A crassna loài trồng phổ biến có khả tạo loại trầm Kỳ tốt giới Tuy nhiên, lồi dó bầu Việt Nam bị lai tạp nhiều, công tác lựa chọn giống đưa vào trồng dựa chủ yếu vào quan sát hình thái, theo kinh nghiệm cá nhân, dẫn đến suất chất lượng trầm thu không ổn định Do vậy, việc chọn lọc giống ban đầu để đưa vào triển khai quan trọng nhiệm vụ cấp thiết công tác bảo tồn, khai thác phát triển nguồn gen quý Hiện phương pháp DNA barcode cơng cụ phục vụ định danh lồi xác, nhanh chóng, tự động hóa cách sử dụng vùng DNA chuẩn hay gọi thị DNA hay mã vạch DNA (DNA barcode) Việc xác định lồi DNA thị có hiệu cao việc phân biệt lồi thực vật [16] có dó bầu Việt Nam [18] quan sát hình thái, sinh trưởng phát triển chưa đủ sở để định danh phân biệt loài Xuất phát từ yêu cầu đặt định thực đề tài “Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử phân tích đa dạng định danh lồi tập đồn dó bầu (Aquilaria sp.) Hà Tĩnh.” Luanvanmaster.com – Cần Kham Thảo - Kết bạn Zalo/Tele : 0973.287.149 Viết thuê đề tài giá rẻ trọn gói - KB Zalo/Tele : 0973.287.149 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan dó bầu 1.1.1 Đặc điểm phân loại vị trí phân bố dó bầu Cây dó bầu (Aquilaria sp.) loài thực vật có giá trị kinh tế cao Ở Việt Nam, dó bầu phân bố rải rác từ Bắc tới Nam, có nhiều tỉnh miền Trung Cây dó bầu có nhiều tên gọi tùy theo địa phương như: Trầm Hương, Dó Trầm, Dó Bầu Hương, Tóc [43] Cây dó bầu thuộc chi trầm Aquilaria, họ Thymeleaceae, Thymelaeales, lớp gỗ lớn Magnoliopsida, ngành Mộc Lan Magnoliophyta [41], [42] Hình 1.1 Lá dó bầu Chi Trầm Aquilaria gồm 24 loài khác nhau, nhiên có 15 lồi có khả cho trầm hương gồm: Aquilaria crassna; A baillonii; A sinensis A chinesis; A borneensis; A Malaccensi; A gollocha; A hirta; A rostrata; A beccariana; A cummingiana; A filaria; A khasiana; A microcarpa; A grandiflora; A bancana; A Rugosa Trong lồi A rugosa TS Lê Công Kiệt TS Paul Kessler người Hà Lan phát năm 2005 [18] Trên giới, chi trầm phân bố chủ yếu khu vực nhiệt đới từ Ấn Độ đến Đông Nam Á miền Nam Trung Quốc Ở nước ta, dó bầu phân bố rải rác rừng rậm nhiệt đới thường xanh, rừng ẩm nguyên sinh thuộc tỉnh Tuyên Quang, Luanvanmaster.com – Cần Kham Thảo - Kết bạn Zalo/Tele : 0973.287.149 Viết thuê đề tài giá rẻ trọn gói - KB Zalo/Tele : 0973.287.149 Thanh Hố, Nghệ An, Hà Tĩnh, đặc biệt từ Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng, Quãng Ngãi, Bình Định, Ninh Thuận, Bình Thuận đến Tây Nguyên, An Giang, Kiên Giang đảo Phú Quốc [42] Trong số lồi có khả tạo trầm Aquilaria crassna lồi tiếng có khả tạo loại trầm kỳ tốt giới [5] 1.1.2 Đặc điểm sinh trưởng dó bầu Dó bầu loại gỗ thường xanh, cao 20 - 30 m, đường kính thân đạt 60 - 80 cm, thân thường thẳng, đơi có rãnh dạng lịng máng, vỏ ngồi nhẵn, màu nâu xám, thịt vỏ màu trắng có nhiều chất xơ (cellulose), nứt dọc lăn tăn, dễ bóc tước ngược từ gốc lên, cành mảnh, cong queo, màu nâu nhạt, có lơng nhẵn, tán thưa Lá đơn, mọc cách (so le), cuống dài - mm, phiến hình trứng, bầu dục thn đến mác thn, kích thước - 15 x 2,5 - cm, mặt màu lục bóng, mặt nhạt có lơng mịn, gốc thon nhọn dần hay tù; chóp nhọn, thn nhọn, tận có mũi, gân bên 15 - 18 đôi, thay đổi thất thường, rõ mặt Cụm hoa hình tán chùm tán, mọc nách đầu cành, cuống cụm hoa mảnh, dài - cm Hoa nhỏ, mẫu 5, đài hợp phần dưới, hình chng, màu vàng lục, trắng nhạt vàng xám, phía ngồi có lơng thưa; mặt gần nhẵn, có 10 đường gân rõ, tồn quả, thùy dài hình trứng thn, dài 12 - 15 mm Phần phụ dạng cánh hoa, gốc bầu có tuyến mật Quả nang gần hình trứng ngược hình lê, dài cm, đường kính 2,5 - cm, có lơng mềm, ngắn, có mang dài tồn tại, khơ nứt làm mảnh, thường có hạt Mùa hoa vào tháng 8, chín vào tháng - 10 [3], [43] Dó bầu sinh trưởng rải rác rừng thường xanh ẩm nhiệt đới, nguyên sinh thứ sinh, sườn núi đất độ cao 50 - 1.000 m có lên tới 1.200 m so với mặt biển Ở nước ta, dó bầu thường phân bố rải rác sườn núi có độ dốc nhỏ, nước Trong quần xã dó bầu thường gặp gỗ lớn: Táu, Huỳnh , Gụ mật … Đơi gặp dó bầu mọc rừng thứ sinh loài Thánh thất, Mị lưng bạc, Bưởi bung, Mít nài Ràng ràng Luanvanmaster.com – Cần Kham Thảo - Kết bạn Zalo/Tele : 0973.287.149 Viết thuê đề tài giá rẻ trọn gói - KB Zalo/Tele : 0973.287.149 Dó bầu (A crassna) ưa đất feralit điển hình, feralit núi phong hóa từ đá kết, đá phiến hay đá granit Lớp đất mặt trung bình hay mỏng, ẩm, chua gần trung tính (pH vào khoảng từ - 6) Tại Malaysia vùng Đơng Bắc Ấn Độ, dó bầu (A malaccensis) phân bố rải rác, độ gặp khoảng 2,5 cá thể hecta Ở Đơng Bắc Ấn Độ, lồi dó bầu thường mọc rải rác độ cao từ 200 - 700 m, lên tới 1.000 m Dó bầu sinh trưởng khu vực có lượng mưa hàng năm thay đổi từ 1.500 6.500 mm, nhiệt độ trung bình tối đa năm 22 - 28oC Những kết quan sát vùng Đông Bắc Ấn Độ cịn cho biết, lồi phân bố chủ yếu rừng ẩm thường xanh rừng thường xanh, gặp rừng nửa rụng Tuy nhiên, thực tế, dó bầu trước sau tái tạo trầm sinh trưởng tốt nơi có độ cao 40 m so với mực nước biển A malaccensis thích ứng với loại đất phong hóa nham thạch, loại đá biến tính, sinh trưởng tốt đất phong hóa từ sa thạch [42] Tại Malaysia, từ lâu đưa dó bầu vào trồng trọt, quần thể rừng trầm A malaccensis 67 năm tuổi có chiều cao trung bình 27 m, đường kính thân trung bình 38 cm Những dó bầu có độ trưởng thành 80 năm tuổi miền Đơng Bắc Ấn Độ, có chiều cao 25 - 30 m, thân to có đường kính 55 - 70 cm Ở miền Tây Bắc Ấn Độ (Arunachal Pradesh), quần thể trầm năm tuổi có chiều cao gần m, đường kính thân gần 30 cm Cũng Tây Bắc Ấn Độ, chúng thường bắt đầu hoa, kết thời kỳ đạt - năm tuổi Những cá thể có kích thước trung bình cho suất hạt tốt, 1,5 kg hạt [42] Các khối trầm thường tạo thành thân cành lớn, chúng kết q trình chuyển hố hoạt động bệnh lý nơi bị bệnh, bị thương… Nấm thành phần có tác dụng hoạt động đó, ngồi trùng đục thân có mối liên hệ Có giả thuyết cho rằng, trước tiên bị nấm gây bệnh chỗ bị thương làm cho bị suy yếu, tiếp nấm thâm nhập vào tạo thành khối trầm Nhựa trầm sản phẩm từ hay nấm tạo ra? Lý giải diễn biến trình Luanvanmaster.com – Cần Kham Thảo - Kết bạn Zalo/Tele : 0973.287.149 ... sinh trưởng phát triển chưa đủ sở để định danh phân biệt loài Xuất phát từ yêu cầu đặt định thực đề tài ? ?Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử phân tích đa dạng định danh lồi tập đồn dó bầu (Aquilaria... dựa quan sát hình thái kinh nghiệm dân gian hỗ trợ xác sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử đại Các phương pháp phân loại học phân tử xác định loài hướng nghiên cứu phát triển mạnh giới nay, xây dựng... học, gần thuật ngữ sử dụng lại nhiều nghiên cứu Về bản, kỹ thuật dựa vào việc sử dụng khu vực DNA (400-800 bp) tiêu chuẩn để nhận dạng lồi cách nhanh chóng xác Kỹ thuật DNA mã vạch giúp nhà phân