Phân lập tuyển chọn chủng nẫm men để lên men vang từ quả bần chua (Sonneratia caseolaris)

Đề tài “Phân lập tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang từ quả bần chua (Sonneratia caseolaris)” được thực hiện nhằm mục đích tận dụng nguồn nguyên liệu dồi dào có sẵn là quả bần chua, đồng thời giúp người dân vùng ven biển nhận thức đúng đắn về giá trị của cây bần chua, tránh hiện tượng chặt phá rừng ngập mặn.

KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014 PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN CHỦNG NẪM MEN ĐỂ LÊN MEN VANG TỪ QUẢ BẦN CHUA (SONNERATIA CASEOLARIS) Phạm Thị Thanh Hường, Lớp K60A, Khoa Sinh học GVHD: TS Đồn Văn Thược Tóm tắt: Từ mẫu dịch bần chua lên men tự nhiên phân lập 80 chủng nấm men Chủng nấm men (kí hiệu NM2*) có khả lên men rượu mạnh (tạo lượng rượu lên đến 17%) tuyển chọn từ 80 chủng nấm men Chúng tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố đến khả sinh trưởng lên men chủng nhiệt độ, pH ban đầu, hàm lượng đường, hàm lượng men giống Khả lên men NM2* cao môi trường dịch có hàm lượng đường 220g/l, hàm lượng giống 10%, mơi trường có pH = 3,5 trì nhiệt độ 30oC Chúng xây dựng quy trình lên men tiến hành sản xuất rượu vang từ dịch bần chua quy mơ phịng thí nghiệm, sản phẩm rượu vang thu có giá trị cảm quan giá trị dinh dưỡng cao Từ khóa: Bần chua, Sonneratia caseolaris, lên men, rượu vang I MỞ ĐẦU Rừng ngập mặn hệ sinh thái quan trọng mơi trƣờng có ý nghĩa lớn cơng tác phịng hộ So với diện tích rừng ngập mặn trƣớc năm 1945 diện tích bị suy giảm nghiêm trọng, nguyên nhân trƣớc chiến tranh tàn phá, xã hội phát triển, sức ép dân số kinh tế khiến diện tích rừng ngập mặn bị suy giảm Cây bần chua (Sonneratia caseolaris) đƣợc trồng mọc tự nhiên rừng ngâp măn trải dài từ Bắc vào Nam nƣớc ta Cùng với việc diện tích rừng ngập mặn bị suy giảm diện tích đất trồng lồi bị thu hẹp Nguyên nhân phía ngƣời ngƣời dân chƣa nhận thức đƣợc giá trị kinh tế mà bần chua mang lại, lồi tiếp tục bị đe dọa nghiêm trọng Hàng năm, bần chua cho sản lƣợng lớn nhƣng chƣa đƣợc tận dụng vào mục đích kinh tế Nhiều nghiên cứu trái bần có nhiều cơng dụng hữu ích Hiện nay, số nƣớc giới sử dụng loại để tạo số sản phẩm đồ uống nhƣng dừng lại phƣơng pháp thủ công truyền thống, quy mô hộ gia đình nhỏ hẹp [6, 7, 13] Xuất phát từ mục đích tận dụng nguồn ngun liệu dồi có sẵn bần chua, đồng thời giúp ngƣời dân vùng ven biển nhận thức đắn giá trị bần chua, tránh tƣợng chặt phá rừng ngập mặn Căn vào điều kiện nghiên cứu tiến hành thực đề tài: “Phân lập tuyển chọn chủng nấm men có khả lên men vang từ bần chua (Sonneratia caseolaris)” II NỘI DUNG Mục tiêu đề tài Phân lập tuyển chọn đƣợc chủng nấm men có khả chuyển hóa dịch bần chua thành rƣợu vang Nội dung nghiên cứu - Phân lập tuyển chọn đƣợc chủng nấm men có khả lên men cồn cao - Khảo sát ảnh hƣởng số yếu tố (nhiệt độ, pH, hàm lƣợng đƣờng hàm lƣợng giống) tới khả lên men chủng nấm men đƣợc chọn 108 KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014 - Xây dựng quy trình lên men, tiến hành lên men rƣợu vang quy mơ phịng thí nghiệm nhằm tạo sản phẩm rƣợu vang có giá trị dinh dƣỡng giá trị cảm quan cao Phƣơng pháp nghiên cứu 2.1 Phương pháp phân lập [1, 4, 6] Nghiền nhỏ bần chua, để dịch nghiên lên men tự nhiên ngày sau tiến hành pha loãng với nồng độ từ 10-6- 10-2, hút 10 µl cho vào đĩa petri có chứa mơi trƣờng Hansen đặc, dùng que trang dàn bề mặt đĩa petri Gói lại giấy báo giữ nhiệt độ 300C ngày Lấy quan sát khuẩn lạc, dựa vào đặc điểm hình dạng, màu sắc, trạng thái khuẩn lạc để chọn khuẩn lạc nấm men to, riêng rẽ để cấy ria giữ giống vào đĩa petri ống nghiệm chứa môi trƣờng Hansen đặc 2.2 Phương pháp tuyển chọn chủng [5, 6] Tiến hành tuyển chọn chủng có khả lên men tốt việc xác định thông qua khối lƣợng CO2 thoát hàm lƣợng rƣợu tao tiến hành lên bình Smith 2.3 Phương pháp xác định độ rượu Chƣng cất lƣợng dịch lên men (V1), thu đƣợc V2 (mL) rƣợu Tiến hành đo độ rƣợu tạo V2 cồn kế thu đƣợc giá trị a Từ tính đƣợc độ rƣợu tạo (b) theo tỉ lệ % (v/v) theo công thức: b = (a x V2):V1 2.4 Xác định đường tổng Xác định hàm lƣợng đƣờng tổng khúc xạ kế 2.5 Định lượng tannin theo phương pháp Leventhal 2.6 Phương pháp khuếch đại gen để giải trình tự đoạn ITS Nuôi cấy chủng tuyển chọn môi trƣờng Hansen lỏng, tốc độ lắc 180 vòng/phút nhiệt độ 300C sau li tâm, thu sinh khối tế bào Tiến hành tascg chiết AND tổng số Khuếch đại đoạn AND phản ứng PCR chuẩn, sử dụng cặp mồi gồm mồi xuôi: ITS4 (5‟-CCTCCGCTTATTGATATGC-3‟) mồi ngƣợc: ITS5 (5‟-GGAAGTAAAAGTCGT AACAAGG-3‟) Đặt chu trình nhiệt cho phản ứng: biến tính 950C phút; giai đoạn khuếch đại trình tự ADN với 30 chu kỳ, chu kỳ xảy điều kiện: 950C 30s, 550C 30s, 720C 60s; giai đoạn kéo dài 720C 10 phút 40C - ∞ Sản phẩm PCR đƣợc gửi sang Hàn Quốc để giải trình tự Trình tự gen sau đƣợc so sánh với ngân hàng gen để xác định chủng loại phát sinh chủng nấm men đƣợc tuyển chọn 2.7 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng số nhân tố tới khả lên men chủng nấm men Khảo sát ảnh hƣởng nhân tố: nhiệt độ; pH ban đầu; hàm lƣợng đƣờng; hàm lƣợng men giống tới khả lên men chủng nấm men giống dựa vào khối lƣợng CO2 thoát khỏi bình lên men lƣợng rƣợu tạo thành theo số phƣơng pháp đƣợc mô tả trƣớc [3, 11, 12] 109 KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014 Kết nghiên cứu 3.1 Xác định hàm lượng số chất dịch Sau thu quả, tiến hành nghiền nhỏ, sau phân tích hàm lƣợng đƣờng hàm lƣợng tannin dịch [3] Kết thu đƣợc: hàm lƣợng đƣờng tổng 3% hàm lƣợng tanin 7,215% 3.2 Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men có khả lên men tốt từ dịch lên men bần chua 3.2.1 Phân lập, tuyển chọn Hình Khả lên men số chủng nấm men phân lập Chúng tiến hành phân lập vi sinh vật từ dịch bần chua lên men, kết thu đƣợc 80 chủng Dựa vào hình thái khuẩn lạc chúng tơi chọn 20 chủng Sau tiến hành kiểm tra khả lên men 20 chủng này, dựa vào khối lƣợng CO2 khỏi bình lên men, chúng tơi chọn đƣợc chủng có khả lên men tốt: NM2*; NM3*; NM15* 3.2.2 Kết tuyển chọn Chúng tiến hành q trình lên men chủng mơi trƣờng dịch nghiền có bổ sung 220g/l đƣờng saccharose Sau 14 ngày, lấy dịch lên men đem chƣng cất thu đƣợc kết đƣợc trình bày bảng Bảng Khả lên men chủng NM2*, NM3*, NM15* mơi trường dịch Kí hiệu chủng V dịch lên men (mL) Thể tích rƣợu thu đƣợc (mL) NM2* 100 17.3 NM3* 100 16 NM15* 100 16.01 Kết cho thấy chủng NM2* chủng có khả lên men tốt, so sánh với nghiên cứu Việt Nam giới NM2* chủng nấm men q, có ý nghĩa lớn khoa học ứng dụng [4, 5, 10, 11] 3.3 Nghiên cứu định tên chủng NM2* Chúng tiến hành nuôi cấy chủng NM2* môi trƣờng Hansen đặc, sau 24 48h nuôi cấy quan sát đƣợc khuẩn lạc có hình trịn, màu trắng đục, bề mặt bóng, viền xung quanh nhẵn (Hình 2) 110 KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014 Hình Hình thái khuẩn lạc NM2* Hình Hình thái tế bào NM2* kính hiển vi quang học Dƣới kính hiển vi quang học kính hiển vi điện tử, tế bào chủng NM2* có hình ovan (hoặc hình trứng), kích thƣớc trung bình: 1.5-4 x 4-7 µm, sinh sản theo hình thức nảy chồi Bên cạnh cịn có tế bào dị hình có dạng dài Chúng tơi cho rằng, tế bào có ảnh hƣởng tích cực tới khả lên men Hình Hình thái tế bào NM2* kính hiển vi điện tử Chúng tơi tiến hành tách ADN tổng số chủng NM2* sau kiểm tra kết chạy điện di (Hình 5) ADN tổng số sau đƣợc sử dụng làm khn để tiến hành phản ứng PCR với tình tự mồi ITS4, ITS5 Sau kiểm tra kết PCR điện di Kết cho thấy, tách đƣợc đoạn ADN có kích thƣớc khoảng 500 bp Đoạn gen đạt đƣợc gửi sang Hàn Quốc để giải trình tự Kết giải trình tự cho thấy chủng NM2* thuộc lồi nấm men Candida tropicalis (1) (2) (1) (2) Chú thích: (1):Marker (2): NM2* Hình Kết điện di sản phẩm genome Hình Kết điện di sản phẩm PCR 111 KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014 3.4 Ảnh hƣởng nhiệt độ tới khả sinh trƣởng lên men chủng NM2* Khảo sát khả sinh trƣởng lên men NM2* khoảng nhiệt từ 250C 450C, nhận thấy môi trƣờng nuôi cấy 30 -350C, NM2* sinh trƣởng tốt Trong môi trƣờng lên men, ảnh hƣởng nhiệt độ tới trình lên men NM2* đƣợc thể Hình Hình Ảnh hưởng nhiệt độ tới khả lên men NM2* Từ chúng tơi đƣa kết luận: 30 - 350C nhiệt độ tối ƣu cho trình sinh trƣởng lên men chủng NM2* 3.5 Ảnh hưởng pH tới khả sinh trưởng lên men chủng NM2* Bằng phƣơng pháp xác định mật độ quang học dịch nuôi cấy NM2* mơi trƣờng có pH khác nhau, chúng tơi thu đƣợc kết trình bày Hình Hình Ảnh hưởng pH tới khả sinh trưởng NM2* Có thể thấy rằng, pH = 4, mật độ quang học đo đƣợc lớn Chứng tỏ bình mơi trƣờng có ban đầu pH = có số lƣợng tế bào lớn Vì kết luận: chủng NM2* sinh trƣởng tốt pH Bên cạnh đó, chúng tơi khảo sát ảnh hƣởng pH tới khả lên men chủng này, kết nhƣ sau đƣợc trình bày Hình Hình Ảnh hưởng pH tới khả lên men NM2* 112 KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014 Chúng nhận thấy pH = 3.5, khả lên men NM2* lớn 3.6 Khả lên men chủng NM2* môi trường khác Chúng tiến hành thử nghiệm khả lên men NM2* môi trƣờng khác Sau thời gian lên men 14 ngày tiến hành chƣng cất thu đƣợc lƣợng rƣợu nhƣ sau: Bảng Khả lên men NM2* môi trường khác Môi trƣờng Hansen Môi trƣờng khảo sát lên men Dịch ngâm Dịch ngâm + dịch đun Độ rƣợu (%, v/v) 8,36 4,55 14,95 10,7 Dựa vào quan sát lƣợng bọt khí xuất bình kết trên, chúng tơi thấy mơi trƣờng có chứa dịch ngâm chủng NM2* có khả lên men tốt với độ rƣợu thu đƣợc 14,95% v/v 3.7 Ảnh hưởng hàm lượng đường dịch lên men tới khả lên men chủng NM2* Để xác định nồng độ đƣờng tối ƣu cho lên men NM2*, chúng tơi tiến hành lên men bình chứa 300 mL dịch với hàm lƣợng đƣờng saccharose bổ sung khác Sau lên men nhiệt độ 300C 14 ngày, tiến hành chƣng cất, thu rƣợu Kết đƣợc trình bày dƣới đây: Hình 10 Ảnh hưởng hàm lượng đường tới khả lên men NM2* Kết cho thấy môi trƣờng dịch đƣợc bổ sung 220g/l đƣờng saccharose nồng độ rƣợu thu đƣợc lớn (16,2 %v/v) Vì định sử dụng hàm lƣợng đƣờng bổ sung 220g/l cho thí nghiệm 3.8 Ảnh hưởng hàm lượng men giống tới khả lên men chủng NM2* Hình 11 trình bày kết lƣợng rƣợu thu đƣợc sau chƣng cất dịch bình lên men có hàm lƣợng giống khác 113 KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014 Hình 11 Ảnh hưởng hàm lượng men giống tới khả lên men NM2* Từ kết kết luận rằng: hàm lƣợng giống bổ sung 7,5 – 10% (v/v) hàm lƣợng giống thích hợp cho q trình sản xuất rƣợu vang NM2* 3.9 Xây dựng quy trình sản xuất vang bần chua Chúng tiến hành sản xuất thử nghiệm bƣớc đầu đề xuất quy trình sản xuất gồm bƣớc sau: Lên men 114 KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014 3.10 Đánh giá cảm quan sản phẩm Sau kết thúc quy trình lên men thu đƣợc sản phẩm rƣợu vang bần chua (Hình 12), chúng tơi tiến hành đánh giá chất lƣợng cảm quan sản phẩm dựa vào tiêu nhƣ TCVN 7045 : 2002 quy định [8] Hình 12 Rượu vang bần chua thành phẩm Tên tiêu Yêu cầu Điểm Màu sắc Đặc trƣng cho loại vang 4,5 Mùi Thơm đặc trƣng nguyên liệu sản phẩm lên men, khơng có mùi lạ 5,0 Vị Chua chát, có khơng có vị ngọt, khơng có vị lạ 4,5 Trạng thái Trong, không vẩn đục 3,5 Đánh giá cảm quan theo hình thức cho điểm tiêu với mức tổng điểm tối đa 20 điểm, đánh giá sản phẩm rƣợu vang bần chua đạt tổng điểm 17,5 điểm III KẾT LUẬN Kết luận Từ dịch bần chua lên men tự nhiên phân lập đƣợc 80 chủng nấm men, số chủng tuyển chọn đƣợc chủng NM2* có khả lên men tạo 17% rƣợu Nhiệt độ pH thích hợp cho sinh trƣởng lên men chủng nấm men NM2* lần lƣợt 30-35 oC pH = 3,5-4 Hàm lƣợng đƣờng bổ sung giống bổ sung thích hợp cho trình lên men lần lƣợt 22% (w/v) 7,5-10% (v/v) Chúng xây dựng thành cơng quy trình lên men rƣợu vang bần chua quy mơ phịng thí nghiệm, sản phẩm rƣợu vang đƣợc đánh giá cảm quan tốt Đề nghị Phát triển sản xuất quy mô lớn đồng thời tiếp tục nghiên cứu hàm lƣợng chất dinh dƣỡng có rƣợu vang thành phẩm 115 KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Hoàng Thị Lệ Thƣơng, Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men sản xuất vang từ giống nho Syrah, Luận văn Thạc sĩ, Trƣờng Đại học Sƣ Phạm Hà Nội, 2010 [2] Hoàng Văn Hải, Nghiên cứu nấm men lên men vang táo mèo, Luận văn Thạc sĩ, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội, 2006 [3] Lê Thanh Mai, Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Thanh Hằng, Lê Thị Lan Chi, Các phương pháp phân tích ngành cơng nghệ lên men, NXB Khoa học - Kĩ thuật, 2006 [4] Lƣờng Thị Hiển, Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men có khả lên men vang tốt, Khóa luận tốt nghiệp, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội, 2012 [5] Nguyễn Văn Thành, Nguyễn Minh Thủy, Trần Thị Quế, Nguyễn Thị Mỷ Tuyền, Phân lập, tuyển chọn định danh nấm men lên men rượu vang khóm, Tạp chí khoa học Trƣờng Đại học Cần Thơ, 2011 [6] Phan Nguyên Hồng, Hoàng Thị Sản, Nguyễn Hồng Trí, Tần Văn Ba, Rừng ngập mặn chúng ta, Trung tâm Nghiên cứu hệ sinh thái rừng ngập mặn (MERC), NXB Giáo dục, 1995 [7] Phan Nguyên Hồng, Rừng ngập mặn Việt Nam, Trung tâm Nghiên cứu Tài nguyên Môi trƣờng Đại học Quốc gia Hà Nội, NXB Nông nghiệp, 1999 [8] TCVN 7045 – 2002, Rượu vang – quy định kĩ thuật [9] Amerine MA, Kunkee RE, Microbiogogy of winemaking, Annual Review of Microbiology, Vol 22, 323-352, 1968 [10] Baba S, Chan HT, Aksornkoae S, Useful products from mangrove and other coastal plants, ISME Mangrove Educational Book Series, No.3, 46- 47, 2013 [11] Gong G-L, Ma L-Y, Chen X-F, Isolation and improvement of Saccharomyces cerevisiae for producing the distilled liquor, Journal of Chemical and Pharmaceutical Research, Vol 6, 283-288, 2014 [12] Mateo J., J Jiménez, M Pastor, A Huerta T, Yeast starter cultures affecting wine fermentation and volatiles Food Research International, Vol.34, 307-314, 2001 [13] Yansong G, Min Q, Quan Z, Zhengmao Z, Guoqiang C, Hyperproduction of Alcohol Using Yeast Fermentation in Highly Concentrated Molasses Medium, Tsinghua Science and Technology, Vol 6, 225-230, 2001 116 ... lên men tốt từ dịch lên men bần chua 3.2.1 Phân lập, tuyển chọn Hình Khả lên men số chủng nấm men phân lập Chúng tiến hành phân lập vi sinh vật từ dịch bần chua lên men, kết thu đƣợc 80 chủng. .. phẩm rƣợu vang bần chua đạt tổng điểm 17,5 điểm III KẾT LUẬN Kết luận Từ dịch bần chua lên men tự nhiên phân lập đƣợc 80 chủng nấm men, số chủng tuyển chọn đƣợc chủng NM2* có khả lên men tạo 17%... tơi chọn 20 chủng Sau tiến hành kiểm tra khả lên men 20 chủng này, dựa vào khối lƣợng CO2 khỏi bình lên men, chúng tơi chọn đƣợc chủng có khả lên men tốt: NM2*; NM3*; NM15* 3.2.2 Kết tuyển chọn