Hiện nay, các hợp chất kháng oxy hóa được khai thác từ nhiều nguồn tài nguyên khác nhau, trong đó nấm nội sinh được biết đến là nguồn sản xuất giàu tiềm năng. Tuy nhiên, ở Việt Nam nói chung và rừng ngập mặn Cần Giờ nói riêng có rất ít công trình nghiên cứu về hoạt tính kháng oxy hóa của nấm nội sinh. Đề tài này được thực hiện với hi vọng tìm được những chủng nấm có hoạt tính kháng oxy hóa cao làm tiền đề cho việc sản xuất ra các sản phẩm có tác dụng trong việc phòng ngừa và điều trị một số bệnh về gan.
Kỉ yếu Hội nghị sinh viên NCKH PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM NỘI SINH TỪ CÂY ĐƯỚC BỘP (RHIZOPHORA MUCRONATA) CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA Nguyễn Hà Như Mai, Cao Thị Mộng Cẩm, Trần Trúc Quỳnh, Văn Tiến Dũng (Sinh viên năm 3, Khoa Sinh học) GVHD: ThS Trần Thị Minh Định TÓM TẮT Trên sở phân lập, tuyển chọn chủng nấm nội sinh có hoạt tính kháng oxy hóa Đước bộp, chúng tơi phân lập 20 chủng nấm nội sinh Trong đó, chủng thể hoạt tính kháng oxy hóa chủng Daldinia eschscholzii có hoạt tính kháng oxy hóa cao Cao ethyl acetate chiết xuất từ chủng thể hoạt tính kháng oxy hóa phương pháp bẫy gốc tự DPPH xác định hàm lượng MDA Mở đầu Trong thể người, tồn nhiều gốc tự Ở nồng độ thấp, chúng đóng vai trị quan trọng truyền tín hiệu, chống lại virus vi khuẩn gây bệnh Tuy nhiên, nồng độ cao gốc tự phản ứng với protein, lipid, DNA gây tổn thương đến số quan gan, thận, não, phổi… Theo nhà khoa học, chế gây tổn thương phận bên thể thường gia tăng q trình peroxide hóa lipid màng tế bào gây gốc oxy hóa tự superoxide (O2 *), hidroxyl (OH*), hidroperoxide (HOO*), peroxide (ROO*), oxide nitric (NO*), ion peroxidenitrite (NO3*),…[3] Bình thường, thể người có khả tạo chất chống oxy hóa nội sinh góp phần ngăn chặn q trình peroxide hóa lipid màng tế bào Tuy nhiên, người phải chịu nhiều tác động xấu từ mơi trường bên ngồi, đặc biệt điều kiện mơi trường nhiễm thực phẩm thiếu an tồn chất kháng oxy hóa nội sinh không tổng hợp kịp thời để bảo vệ thể Tỉ lệ mắc bệnh gan nước ta ngày cao Vì vậy, việc bổ sung chất kháng oxy hóa có nguồn gốc tự nhiên vào thể để bảo vệ gan vấn đề cần thiết cấp bách Hiện nay, hợp chất kháng oxy hóa khai thác từ nhiều nguồn tài nguyên khác nhau, nấm nội sinh biết đến nguồn sản xuất giàu tiềm [8] Tuy nhiên, Việt Nam nói chung rừng ngập mặn (RNM) Cần Giờ nói riêng có cơng trình nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa (HTKOH) nấm nội sinh Với lí chúng tơi tiến hành thực đề tài Phân lập, tuyển chọn chủng nấm nội sinh từ Đước bộp (Rhizophora mucronata) có khả kháng oxy hóa với hi vọng tìm chủng nấm có hoạt tính kháng oxy hóa cao làm tiền đề cho 28 Năm học 2016 - 2017 việc sản xuất sản phẩm có tác dụng việc phòng ngừa điều trị số bệnh gan Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu Các chủng nấm sợi nội sinh phân lập từ Đước bộp (R mucronata) RNM Cần Giờ 2.2 Phương pháp phân lập chủng nấm nội sinh [7] Các mẫu rễ, thân, Đước bộp (R mucronata) sau thu rửa đất, cát bụi bẩn bám mẫu nước cất, sau để khơ nước tự nhiên Tiếp tục, mẫu rễ, thân, sau khô nước khử trùng bề mặt điều kiện vô trùng Dùng dao vô trùng cắt nhỏ mẫu thân, rễ với kích thước 0,5 – cm mẫu với kích thước 0,5 – 0,5 cm Sau chuyển vào đĩa petri chứa môi trường malt extract agar (MEA) có bổ sung 10.000 đơn vị natri benzyl penicillin 0,05 g streptomycin sulfat 100 ml dung dịch đem ủ vòng - ngày để chủng nấm phát triển 2.3 Phương pháp quan sát đại thể nấm sợi [2] Dùng que cấy lấy bào tử từ ống giống thạch nghiêng cấy chấm điểm vào mặt thạch Để bào tử nấm phát triển thành khuẩn lạc nhiệt độ phòng ngày lấy quan sát mô tả đặc điểm: kích thước khuẩn lạc để biết tốc độ phát triển nó, hình dạng khuẩn lạc, màu sắc khuẩn lạc mặt phải, mặt trái thay đổi màu sắc, sắc tố nấm tạo ra, dạng sợi nấm mọc mặt môi trường, đặc điểm mép khuẩn lạc, giọt tiết (nếu có) 2.4 Phương pháp tạo cao ethyl acetate [7] Sau ngày nuôi máy lắc, dịch nuôi sinh khối đem chiết xuất với lượng dung môi ethyl acetate tương đương, sau lọc thu lấy dịch lọc Phần dịch lọc thu cho vào bình lóng, lúc dịch lọc bình lóng tách thành hai lớp, loại bỏ phần dịch ni phía dưới, thu phần ethyl acetate có chứa hoạt chất phía Tiếp tục sử dụng máy cô quay chân không để loại bỏ dung môi ethyl acetate kiện nhiệt độ 50 oC áp suất 300 mbar ta thu cao ethyl acetate từ nấm nội sinh 2.5 Phương pháp khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa in vitro phương pháp bẫy gốc tự DPPH [7] Nguyên tắc: Các chất có khả kháng oxy hóa trung hịa gốc DPPH cách cho H+, làm giảm độ hấp thu cực đại bước sóng 517 nm Màu dung dịch phản ứng nhạt dần, từ màu tím chuyển thành màu vàng cam Cường độ màu xác định cách đo mật độ quang OD bước sóng λ = 517 nm Giá trị đo mật độ quang OD thấp chứng tỏ khả bẫy gốc tự mẫu thử cao Thí nghiệm tiến hành sau 29 Kỉ yếu Hội nghị sinh viên NCKH - Hòa tan 0,01 g cao ethyl acetate hòa tan vào 10 ml dung dịch ethanol, thu dung dịch có nồng độ 1000 µg/ml Sau tiến hành pha loãng dung dịch thành nồng độ từ 100 đến 1000 μg/ml - Sau pha mẫu thử thành nồng độ khác nhau, lấy 100 µl mẫu thử cho vào ống nghiệm - Bổ sung thêm 1,9 ml dung dịch DPPH nồng độ 300 µM - Ủ 30 phút điều kiện khơng có ánh sáng nhiệt độ phòng - Tiến hành mật độ quang OD bước sóng λ= 517nm 2.6 Phương pháp khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa in vitro phương pháp thử nghiệm MDA [1] Nguyên tắc: Xác định khả ức chế q trình peroxy hóa lipid thơng qua việc xác định hàm lượng MDA MDA sản phẩm cuối q trình peroxy hóa lipid, thường chọn số để đánh giá mức độ tổn thương tế bào stress oxy hóa Khi cho MDA phản ứng với acid thiobabituric tạo phức hợp màu hồng hấp thu cực đại bước sóng 532 nm Hoạt tính chống oxy hóa thể thơng qua việc làm giảm màu phức hợp làm giảm hàm lượng MDA mẫu Cường độ màu xác định cách đo mật độ quang OD bước sóng λ = 532 nm Giá trị đo mật độ quang OD thấp chứng tỏ hoạt tính kháng oxy hóa mẫu thử cao Thí nghiệm tiến hành sau - Hòa tan 0,01 g cao ethyl acetate hòa tan vào 10 ml dung dịch methanol, thu dung dịch có nồng độ 1000 µg/ml Sau tiến hành pha loãng dung dịch thành nồng độ từ 100 đến 1000 μg/ml - Tách gan chuột nghiền dung dịch đệm phosphate 50 mM theo tỉ lệ : 10 (gan : dung dịch đệm) - Sau lấy 0,5 ml dịch đồng thể thêm vào 0,1 ml nồng độ thử thêm 1,4 ml dung dịch đệm phosphate, ủ 37oC 15 phút - Kết thúc phản ứng 1ml dung dịch acid tricloacetic Sau li tâm lạnh C, 10 phút, tốc độ 10000 vòng/phút o - Lấy ml dịch phản ứng với ml acid thiobarbituric 0,8% 100 oC 15 phút đo OD bước sóng 532 nm 2.7 Phương pháp xử lí số liệu Số liệu xử lí phần mềm Microsoft Office Ecxel 2010 phần mềm Statgraphics plus 3.0 Kết bàn luận 3.1 Kết phân lập chủng nấm nội sinh từ Đước bộp R mucronata Sau phân lập chủng nấm nội sinh từ các phận khác (rễ, thân, lá) Đước bộp R mucronata từ RNM Cần Giờ Dựa vào quan sát đặc 30 Năm học 2016 - 2017 điểm hình thái khuẩn lạc màu sắc, hình dạng, mép khuẩn lạc, cách mọc môi trường nuôi cấy Chúng thu 20 kiểu khuẩn lạc khác (kí hiệu từ R1-R7, T1-T12, L1) Kết thể qua bảng 3.1 STT 10 11 12 Bảng Đặc điểm hình thái đại thể chủng nấm sợi nội sinh phân lập từ Đước bộp Kí hiệu Đặc điểm hình thái chủng nấm chủng Khuẩn lạc mọc chậm, màu trắng, mép không Mặt màu R1 vàng cam Hệ sợi nấm không giọt tiết, không tiết sắc tố Khuẩn lạc mọc nhanh, màu xám, mép Mặt khuẩn lạc có R2 màu đen Hệ sợi nấm khơng giọt tiết, khơng tiết sắc tố Khuẩn lạc màu trắng, trịn, khuẩn ti khí sinh phát triển mạnh, mọc dày phía ngồi Mặt có màu xanh đen Hệ sợi nấm phát R3 triển nhanh môi trường không tiết sắc tố Khuẩn lạc tròn, màu trắng, sợi nấm dài mảnh, mọc gần hết đĩa, mọc dày phía ngồi Mặt có màu xanh rêu sậm, R4 màu vàng đen Hệ sợi nấm không giọt tiết, không tiết sắc tố Khuẩn lạc màu trắng, mịn, mép gần tròn, sợi nấm ngắn, mọc dày lên Mặt vàng Hệ sợi nấm không R5 giọt tiết, không tiết sắc tố Khuẩn lạc màu trắng, lớn, sợi nấm mịn, mọc tạo thành lỗ Gần mép sợi nấm mọc dày lên tạo thành vịng Mặt R6 vàng, có tia ngắn Hệ sợi nấm không giọt tiết, không tiết sắc tố Khuẩn lạc màu trắng, mọc dày, mép không Mặt R7 vàng Nấm không tiết sắc tố giọt tiết Khuẩn lạc màu trắng đục, sợi ngắn, mép không Ở sợi nấm mọc dày lên tạo thành vịng Mặt có màu rêu vàng T1 Hệ sợi nấm phát triển chậm môi trường không tiết sắc tố Khuẩn lạc màu trắng ngà, mép gần đều, sợi nấm ngắn, mọc thưa có màu sậm Mặt có màu nâu rêu Hệ T2 sợi nấm không giọt tiết, không tiết sắc tố Khuẩn lạc màu trắng sữa, mép khơng đều, mép dày lên có hình dạng bơng hoa Mặt có màu rêu vàng Hệ sợi T3 nấm phát triển chậm môi trường không tiết sắc tố Khuẩn lạc lớn, màu trắng đục, sợi dày, dày sậm màu Mặt hình thành vịng màu vàng đậm Hệ sợi T4 nấm phát triển nhanh môi trường không tiết sắc tố Khuẩn lạc màu trắng ngà, trắng đục hơn, mép mọc T5 không Khó phân biệt vịng ngồi Hệ sợi nấm 31 Kỉ yếu Hội nghị sinh viên NCKH STT Kí hiệu chủng 13 T6 14 T7 15 T8 16 T9 17 T10 18 T11 19 T12 20 L1 Đặc điểm hình thái chủng nấm khơng giọt tiết, không tiết sắc tố Khuẩn lạc lớn, màu trắng ngà, trắng đục hơn, mép khơng đều, có hình hoa Sợi nấm ngắn mỏng, không giọt tiết, không tiết sắc tố Khuẩn lạc màu trắng, mép không đều, mọc thành vòng rõ ràng, vòng sợi nấm mọc dày Mặt có màu vàng Hệ sợi nấm phát triển chậm môi trường không tiết sắc tố Khuẩn lạc màu trắng, có màu đen, có sợi bơng ngắn li ti Mặt khuẩn lạc màu đen Hệ sợi nấm phát triển nhanh môi trường không tiết sắc tố Khuẩn lạc màu xanh rêu đen, sợi mảnh Mép khuẩn lạc trịn có màu trắng Hệ sợi nấm không giọt tiết, không tiết sắc tố Khuẩn lạc màu trắng, sợi bơng dày, mép trịn Khuẩn lạc tạo thành vòng tròn đồng tâm, vòng sợi nấm mọc dày Hệ sợi nấm không giọt tiết, không tiết sắc tố Khuẩn lạc màu trắng đục, sợi nấm mọc dày Mặt có màu rêu đen Hệ sợi nấm phát triển chậm môi trường không tiết sắc tố Khuẩn lạc trắng, sợi nấm ngắn, mép màu vàng Khuẩn lạc tròn đều, khơng có giọt tiết, khơng tiết sắc tố Khuẩn lạc màu trắng, sợi ngắn, mọc dày, khuẩn lạc ăn sâu vào môi trường thạch tạo thành rãnh Mặt màu vàng cam Hệ sợi nấm không giọt tiết, không tiết sắc tố Từ kết thu bảng nhận thấy, phân bố nấm nội sinh phận rễ, thân, Đước bộp (R mucronata Lam.) khác Tổng số lượng nấm nội sinh phân lập thân nhiều so với rễ Trong chủng nấm nội sinh phân bố nhiều mẫu thân chiếm 60%, mẫu rễ chiếm 35% mẫu chiếm 5% tổng số nấm nội sinh phân lập Như vậy, thấy nấm nội sinh tìm thấy tất phận thực vật phận khác phân bố nấm nội sinh khác Sau chủng nấm nội sinh khiết, tiến hành sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa chủng nấm 3.2 Kết sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa số chủng nấm nội sinh phân lập từ Đước bộp R mucronata Các chủng nấm nội sinh phân lập từ mẫu rễ, thân, Đước bộp (R mucronata) nuôi cấy môi trường khoai tây thời gian ngày Sau dùng khoan đục lát thạch kích thước (0,5 x 0,5 cm) cho vào bình tam giác 250 32 Năm học 2016 - 2017 ml chứa 150 ml môi trường khoai tây lỏng để tạo dịch lên men Sau ngày, chúng tơi tiến hành thử hoạt tính kháng oxy hóa dịch lên men chủng nấm cách rút 100 μl dịch lên men sau xác định hoạt tính kháng oxy hóa dịch lên men phương pháp bẫy gốc tự DPPH Chứng âm sử dụng ethanol Kết thể qua bảng Bảng Kết sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa chủng nấm nội sinh phân lập từ Đước bộp STT Chủng HTKOH (%) R1 b R2 29,913 ± 9,206 R3 a R4 15,652 ± 7,609 R5 R6 R7 a T1 10,261 ± 11,405 T2 10 T3 b 11 T4 39,652 ± 2,270 12 T5 13 T6 14 T7 c 15 T8 66,957 ± 3,832 16 T9 b 17 T10 32,174 ± 3,170 18 T11 6,453a ± 1,546 19 T12 20 L1 Chú thích: a