Khảo sát các đặc điểm đặc trưng về di truyền và sinh hóa của tác nhân gây bệnh đuôi tôm đỏ hoại tử ở tôm sú penaeus monodon

ỦY BAN NHÂN DÂN TP HỒ CHÍ MINH SỞ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ ********* BÁO CÁO NGHIỆM THU ðỀ TÀI: KHẢO SÁT MỘT SỐ ðẶC TRƯNG VỀ SINH HÓA VÀ DI TRUYỀN CỦA VIRUS GÂY BỆNH ðUÔI ðỎ HOẠI TỬ Ở TÔM SÚ (Penaeus monodon) Xác nhận quan chủ trì TP HỒ CHÍ MINH, 5/2010 MỤC LỤC Số TT 10 11 13 14 15 16 17 18 19 20 MỤC 34 35 MỞ ðẦU PHẦN I TỔNG QUAN I.1 ðẶC ðIỂM CƠ BẢN CHUNG CỦA VIRUS I.1.1 Virus vật ký sinh nội bào bắt buộc I.1.2 Cấu trúc virus I.1.3 Phiên mã, dịch mã chép genome virus I.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VIRUS I.2.1 Nuôi cấy virus I.2.2 Phân lập virus I.2.3 Tinh virus I.2.4 Khảo sát hình dạng cấu trúc virus I.2.5 Kỹ thuật ñiện di I.2.6 ðịnh lượng virus tế bào nuôi cấy I.2.7 Phương pháp nhân dòng gene I.2.8 Học thuyết Trung tâm I.2.9 ðịnh danh virus I.3 VIRUS GÂY BỆNH Ở TÔM I.3.1 Tác nhân virus gây bệnh tôm I.3.2 Khả lây lan dịch bệnh virus tôm I.3.3 Khả biến ñổi di truyền xuất chủng virus I.4 NGHIÊN CỨU VIRUS TÔM Ở VIỆT NAM PHẦN II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU II.1 Nuôi cấy tế bào côn trùng Sf9 II.2 Thu nhận virus từ tôm bị bệnh II.3 Chuẩn độ virus theo phương pháp pha lỗng nồng ñộ II.4 Phân lập tinh virus theo phương pháp Plaque II.5 Sử dụng tế bào ñể nhân virus II.6 Thu nhận virus từ tế bào Sf9 cảm nhiễm II.7 Làm ñậm ñặc virus PEG 6000 II.8 Siêu ly tâm gradient sucrose CsCl II.9 Tinh virus ly tâm gradient sucrose II.10 Phương pháp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp II.11 Phương pháp hiển vi điện tử xác định kích thước hình dạng virus II.12 Kỹ thuật SDS-PAGE II.13 Western Blotting 36 II.14 Phương pháp điện di hai chiều (2 D) phân tích 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 Trang 2 2 6 7 9 10 11 12 13 16 16 17 18 19 22 23 23 24 24 25 26 26 28 28 29 31 31 34 35 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 protein virus II.15 Phương pháp phân tích nanoLC-ESI-MS/MS nhận diện protein virus II.16 Ly trích genome virus phương pháp Proteinase K phenol/chloroform II.17 Ly trích DNA Kit QIAamp MinElute Virus Spin II.18 Phương pháp ly trích DNA từ gel agarose II.19 Phương pháp ñiện di DNA gel agarose II.20 Phương pháp xác ñịnh chất acid nucleic enzyme nuclease II.21 Cắt DNA genome virus số enzyme cắt giới hạn II.22 Phương pháp RDVD giải trình tự nhanh virus II.23 Phương pháp PCR II.24 Khảo sát phân ñoạn DNA genome virus II.25 Chỉ thị RTV mẫu tế bào Sf9 nhiễm WSSV với cặp mồi P4 II.26 Phân tích trình tự DNA Protein II.27 Phương pháp gây nhiễm thực nghiệm cho tôm sú với RTV từ tế bào ni cấy II.28 Phương pháp điều tra tình hình bệnh (PL.4) PHẦN III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU III.1 Hiệu ứng hủy hoại tế bào III.2 Kết nghiên cứu hiển vi ñiện tử III.3 Kết xác ñịnh miễn dịch huỳnh quang tế bào côn trùng Sf9 nhiễm RTV III.4 Kết chuẩn ñộ phân lập virus theo phương pháp plaque III.5 Kết thu nhận virus ñậm ñặc từ dịch tế bào nuôi cấy III.5.1 ðậm ñặc dịch virus phương pháp ñông khô III.5.2 Kết thu nhận virus phương pháp SLT III.6 Kết xác ñịnh mật ñộ RTV sucrose III.7 Kết xác ñịnh mật ñộ RTV CsCl III.8 Kết phân tích nanoLC-ESI-MS/MS III.8.1 Lấy mẫu gel sau ñiện di III.8.2 Kết nhận diện protein III.8.3 Kết xác ñịnh khối lượng phân tử protein III.8.4 Giải trình tự de novo peptide III.9 Kết ñiện di hai chiều (2D) xác ñịnh thành phần protein RTV III.10 Kết xác ñịnh chất genome RTV III.11 Kết ước định kích thước genome RTV III.12 Kết thủy giải DNA genome RTV số 41 42 43 44 45 47 49 50 52 54 54 54 56 56 57 57 57 61 62 63 63 63 65 68 69 69 70 70 72 73 77 78 79 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 enzyme giới hạn III.13 Kết phân tích genome RTV phương pháp RDVD III.13.1 Trình tự phân ñoạn thu ñược III.13.2 Khảo sát PCR DNA RTV tinh với cặp mồi C1, C2, C3, C4 III.13.3 Kết PCR DNA RTV/tế bào Sf9 với cặp mồi C4 III.14 Kết phân tích trình tự sản phẩm PCR RTV III.14.1 Thu sản phẩm PCR gel agarose III.14.2 Giải trình tự sản phẩm PCRtrên mẫu RTV tinh với cặp mồi C4 III.14.3 Kết tìm kiếm trình tự tương đồng DNA1 DNA2 Genbank III.14.4 Kết tìm khung đọc mở (Open Reading FrameORF) từ trình tự DNA1 DNA2 III.15 Kết gây nhiễm thực nghiệm cho tôm với RTV từ tế bào nuôi cấy III.15.1 Kết gây nhiễm thực nghiệm cho tôm sú giống với RTV từ tế bào nuôi cấy III.15.2 Kết gây nhiễm thực nghiệm cho tôm sú trưởng thành với RTV từ tế bào nuôi cấy III.15.3 KẾT LUẬN VÀ ðỀ XUẤT Ý KIẾN III.16 Kết điều tra bệnh đỏ hoại tử tơm sú địa bàn Khánh Hịa, Ninh Thuận Bình Thuận III.16.1 Tình hình bệnh đỏ tơm sú ni thương phẩm III.16.2 Phân tích đa biến III.16.3 Kết luận ñề nghị PHẦN III KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 80 80 83 86 87 87 87 88 90 94 94 97 101 102 102 106 107 108 DANH MỤC HÌNH Số TT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 Tên hình Hình Sơ đồ cấu trúc virus Hình Cấu trúc vỏ capsid Hình Tế bào Vero nhiễm khơng nhiễm virus Polio Hình Các plaque virus động vật ni cấy tế bào Hình Sự tách hạt virus gradient mật độ Hình Mơ hình ly tâm lắng Hình Mơ hình ly tâm gradient mật độ Hình Chỉ thị tế bào nhiễm virus kháng thể ñặc hiệu ñánh dấu huỳnh quang Hình 10 Sơ đồ chọn dịng gene dùng tế bào vi khuẩn vector plasmid Hình 11 Sự chép virus nhóm phân loại Baltimore Hình 12 Cây phát sinh lồi khơng có gốc Hình 13 Tơm bị bệnh đỏ hoại tử Hình 16 Sơ ñồ nội dung phương pháp thực Hình 14 Cấu trúc cuộn xoắn PEG dung dịch nước Hình 15 Phương pháp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp Hình 16 Các pha phân tách ly trích acid nucleic phenol Hình 17 Các cặp primers sử dụng ñể xác ñịnh trình tự RNA virus Hình 18 A Tế bào Sf9 ñối chứng; B Tế bào Sf9 nhiễm RTV Hình 19 Ảnh HVðT lát cắt tế bào Sf9 Sau ngày cấy chuyển Hình 20 Ảnh HVðT lát cắt tế bào Sf9 nhiễm RTV sau ngày Hình 21 Ảnh HVðT thể vùi nguyên sinh chất tế bào Hình 22 Ảnh HVðT thể vùi tế bào Sf9 nhiễm RTV Hình 23 Ảnh HVðT thể vùi nguyên sinh chất tế bào Hình 24 A Ảnh HVðT dịch tế bào; B Ảnh HVðT hạt virus Hình 25, 26 Chỉ thị tế bào nhiễm virus với kháng thể ñặc hiệu gắn huỳnh quang Hình 27 Plaque tế bào nhuộm neutral red Hình 28 Ảnh chụp Plaque RTV kính hiển vi soi ngược Hình 29 Kết điện di mẫu virus đơng khơ trước SLT Hình 30 Kết điện di SDS-PAG mẫu RTV-LA qua SLT lắng Hình 31 Giá trị OD phân ñoạn sau SLT gradient sucrose Hình 32 Kết điện di phân ñoạn sau SLT sucrose mẫu RTV Hình 33 Kết ñiện di phân ñoạn mẫu RTV-CG sau SLT Hình 34 Ảnh HVðT hạt virus phân đoạn tập trung virus Trang 8 9 11 15 16 20 22 27 30 42 51 57 58 58 59 59 59 59 61 62 62 63 64 65 66 67 68 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 Hình 35 ðường cong giá trị OD phân đoạn sau SLT CsCl Hình 36 Bảng gel điện di protein RTV vị trí band cắt cho phân tích nanoprotein Hình 37 Phổ phân tích khối lượng phân tử Insulin (đối chứng) Hình 38 Phổ phân tích khối lượng phân tử protein băng Hình 39 Phổ phân tích khối lượng phân tử protein băng Hình 40 Vùng có spot thật Hình 41 Vùng khơng có Spotspot Hình 42 Kết phân tích gel spot khác biệt mức thống kê 99% từ mẫu RTV-LA mẫu ñối chứng Hình 43 Kết phân tích genome RTV gel agarose Hình 44 Kết tính kích thước genome RTV gel agarose Hình 45 Kết thủy giải genome RTV EcoRI BamH I Hình 46 Kết ñiện di agarose sản phẩm thủy giải genome RTV Hình 47 Kết PCR DNA RTV với cặp mồi C1 (P2F/P2R) Hình 48 Kết PCR DNA RTV với cặp mồi C2 (P3F/P3R) Hình 49 Kết PCR DNA RTV với cặp mồi C3 (P2F/P3R) Hình 50 Kết PCR DNA RTV với cặp mồi C4 (P3F/P2R) Hình 51 Kết PCR DNA RTV / tế bào Sf9 với cặp mồi C4 Hình 52 Kết PCR DNA band band với cặp mồi C4 Hình 53 Vùng trình tự mã hóa ORF1 DNA1 Hình 54 Vùng trình tự mã hóa ORF2 DNA2 Hình 55 Vùng trình tự mã hóa ORF3 DNA2 Hình (6) Dấu hiệu bệnh thể số tôm yếu chết nghiệm thức cho ăn virus Hình (7) Hình chụp mẫu tôm thu ngẫu nhiên nghiệm thức cho tôm dùng loại thức ăn ñã ñược bổ sung virus, độ mặn 10%o Hình (8) Dấu hiệu đỏ xuất tôm yếu chết nghiệm thức tiêm virus RTV Hình (1) Tỉ lệ đìa ni tơm sú ba Tỉnh: Khánh Hịa, Bình Thuận, Ninh Thuận xuất bệnh đỏ (n=128) Hình (2) Tỉ lệ đìa ni tơm sú xuất bệnh bệnh đỏ theo tháng năm Hình (3) Tỉ lệ đìa ni tơm sú mắc bệnh đỏ phân bố theo tháng ni Hình (4) Tỉ lệ tơm xuất bệnh đỏ đìa ni 68 69 70 71 71 73 73 74 77 78 79 80 84 84 85 85 86 87 92 93 93 100 100 100 103 104 105 105 DANH MỤC BẢNG Số TT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Tên bảng Bảng Nơi xảy trình chép genome virus tế bào Bảng Thành phần phản ứng thủy phân với S1 nuclease Bảng Thành phần phản ứng thủy phân với DNase I Bảng Phản ứng thủy phân với RNase A nồng ñộ muối thấp Bảng Phản ứng phân với RNase A nồng ñộ muối cao Bảng Thành phần phản ứng cắt enzyme giới hạn Bảng Các primer cho PCR xác ñịnh DNA RTV Bảng Thành phần phản ứng PCR (P1, P2, P3, P4) Bảng Chương trình nhiệt cho phản ứng PCR Bảng 10 Giá trị OD 254 nm dung dịch trước SLT phân ñoạn sau SLT Bảng 11 Chỉ số khúc xạ, nồng ñộ sucrose mật ñộ RTV từ phân ñoạn Bảng 12 Giá trị OD 254, ñộ khúc xạ nồng ñộ CsCl phân ñoạn sau SLT Bảng 13 Trình tự de novo số peptide băng Bảng 14 Trình tự de novo số peptide băng Bảng 15 Trình tự de novo số peptide băng Bảng 16 Khối lượng phân tử protein chủ yếu RTV ñiện di 2D Bảng 17 So sánh kết ñiện di chiều chiều mẫu RTV-LA Bảng 18 Trình tự phân đoạn DNA RTV thu ñược phương pháp RDVD Bảng 19 Kết giải trình tự DNA1 DNA2 Bảng 20 Tổng hợp trình tự tương đồng kết Blast DNA1 (blastn,blastx, Tblastx) Bảng 21 Tổng hợp trình tự tương ñồng kết Blast DNA2 (blastn,blastx, Tblastx) Bảng 22 Các khung dịch mã từ trình tự DNA1 Bảng 23 Các khung dịch mã từ trình tự DNA2 Bảng (5) Tỉ lệ tơm sú ni có biểu bất thường trước xuất bệnh đỏ Bảng (6): Những dấu hiệu bất thường mơi trường đìa ni trước xảy bệnh đỏ Trang 47 48 48 48 50 53 53 54 65 66 68 72 72 73 74 76 81 88 89 89 91 92 103 104 MỞ ðẦU Với quy mô phát triển kỹ thuật ngày cao, nghề nuôi trồng thủy sản trở thành ngành cơng nghiệp mang lại nhiều thành tựu ñáng kể kinh tế xã hội cho nước khu vực ven biển ðơng Nam Châu Á, đặc biệt Việt Nam Tuy vậy, nhiều ngành chăn nuôi khác, nghề nuôi trồng thủy sản quy mô công nghiệp tất yếu dẫn ñến dịch bệnh phát sinh nghiêm trọng Do ñặc thù chế miễn dịch môi trường sống tôm, dịch bệnh bùng phát, người nuôi hồn tồn bị động khơng có thuốc trị bệnh ñặc hiệu, nên thiệt hại tránh khỏi Sự rủi ro sản xuất tất yếu dẫn ñến khơng ổn định lĩnh vực chế biến xuất tạo hệ lụy dây chuyền ñời sống kinh tế - xã hội cộng ñồng Tình hình dịch bệnh virus gây tơm ngày phức tạp Hầu hết bệnh virus cơng bố giới có mặt Việt Nam Sự ñồng nhiễm nhiều loại virus cá thể làm dịch bệnh bùng phát nhanh chóng Những chứng bệnh lạ thường xuyên xuất làm người sản xuất thơng thể ứng phó kịp Chính vậy, nghiên cứu tác nhân bệnh virus ñể ñưa giải pháp kiểm soát bệnh hiệu yêu cầu cấp thiết lĩnh vực nuôi trồng thủy sản bền vững Tổ chức FAO ñã nỗ lực việc tạo lập tổ chức quốc tế nhằm thống mục tiêu nghiên cứu ñể tìm kiếm, phát sớm tác nhân bệnh phối hợp giải pháp kiểm soát bệnh quy mơ tồn cầu Với nỗ lực đó, danh sách tác nhân bệnh virus phát ñược ngày nhiều Tuy vậy, số virus ñã ñược phát chưa phản ánh hết diện loại virus tồn thực tế Vì vậy, việc tìm kiếm phát dấu hiệu bệnh thực cần thiết ñể sớm nhận diện nguy tiềm ẩn tìm giải pháp nhằm kiểm sốt hạn chế lây lan tác nhân bệnh Ở giai ñoạn I đề tài (2003 – 2006), chúng tơi phát khẳng ñịnh ñược tác nhân virus gây bệnh đỏ hoại tử tơm sú Nhiệm vụ ñề tài (2007 – 2010) xác ñịnh ñặc trưng sinh lý, sinh hóa phân tử virus làm sở ñể xác ñịnh nguồn gốc phát sinh loài tác nhân bệnh Ngồi ra, đề tài phối hợp với ñơn vị chuyên ngành bước ñầu ñiều tra tình hình bệnh đỏ hoại tử khu vực miền trung Chúng tơi hy vọng có thơng tin cần thiết cung cấp cho người ni tơm để nhận diện, đề phịng kiểm sốt tác nhân bệnh Bên cạnh chúng tơi mong muốn xây dựng ñược hệ phương pháp hoàn chỉnh hiệu phục vụ cho nghiên cứu nhằm tìm kiếm phát virus gây bệnh triển khai ñược phương pháp phát bệnh hiệu thực tế PHẦN I TỔNG QUAN I.1 ðẶC ðIỂM CƠ BẢN CHUNG CỦA VIRUS I.1.1 Virus vật ký sinh nội bào bắt buộc (Obligate Intracellular Parasite) Virus khác với tế bào cách nhân lên Một tế bào ln hình thành trực tiếp từ tế bào trước đó, virion hình thành trình chép bên tế bào chủ kéo theo tổng hợp thành phần cấu tạo tập hợp chúng thành virion Virus vật ký sinh tế bào phụ thuộc vào tế bào chủ chúng cho tất yêu cầu bao gồm: - Xây dựng thành phần amino acid nucleoside; - Bộ máy tổng hợp protein (các ribosome); - Năng lượng dạng adenosine triphosphate (ATP) Virus thay đổi mơi trường nội bào tế bào chủ để gia tăng hiệu suất q trình tái tạo Sự biến đổi bao gồm việc tạo cấu trúc màng mới, làm giảm biểu gene tế bào hay làm gia tăng trình tế bào từ làm tăng số lượng virus từ tế bào (John, 2007) I.1.2 Cấu trúc virus Virus có loại nucleic acid (DNA RNA), khơng có hệ thống sinh tổng hợp protein riêng (khơng có ribosome), khơng có hệ thống biến dưỡng riêng, khơng tạo màng lipid riêng, khơng có khung sườn tế bào không tăng trưởng (Phạm Thành Hổ, 2001) DNA + Vỏ protein capsid Nucleocapsid = Virus trần RNA Nucleocapsid + Màng lipid có glycoprotein Virus có màng bao Hình Sơ đồ cấu trúc virus Bên tế bào chủ, virus tồn hạt virus hay gọi virion Virion hệ thống chuyển tải gene Virion chứa genome virus chức bảo vệ genome trợ giúp đưa genome vào tế bào chủ Genome gói cấu trúc protein gọi capsid Nhiều virus có thành phần cấu tạo lipid, thường có bề mặt virion để hình thành vỏ màng (envelope) Envelope chứa protein với vai trò trợ giúp xâm nhập virus vào tế bào chủ Một số virus hình thành thể vùi protein (occlusion body) bảo vệ virion bên I.1.2.1 Genome virus Khác với thể sống khác, virus có chứa loại acid nucleic DNA RNA Genome thể bậc cao, ñộng vật thực vật DNA mạch kép, genome virus RNA DNA dạng mạch đơn mạch kép, dạng thẳng dạng vịng Nói chung, genome virus nhỏ nhiều so với genome tế bào Genome virus có dải rộng kích thước từ 1.7 đến 1000 kilobase (kb), chép theo ba ñường khác nhau: DNA → DNA RNA → RNA RNA → cDNA → RNA Các enzyme, chất dinh dưỡng, ribosome nguồn khác tế bào chủ ñược sử dụng ñể tạo nhiều gene protein cấu phần khác Khi phần riêng lẻ tích đủ, chúng tự ráp (self – assembly) với thành số lượng lớn virion phá vỡ tế bào ñể tìm tế bào chủ Các cấu phần gắn với liên kết yếu nên không cần enzyme * Nhóm lõi DNA: tất virus biến ñổi tế bào qua việc gắn nucleic acid virus vào DNA tế bào chủ Sự gắn ổn ñịnh ñược chép với gene hệ Một số virus Eukaryotae giống cấu trúc chức so với số gene tế bào chủ virus vi khuẩn * Nhóm lõi RNA: sáp nhập vào tế bào chủ, vỏ virion virus nhờ có chất sinh hóa mà dung giải liên tục, lẫn vào màng tế bào chủ, phần lõi cịn lại giải phóng vào tế bào chất tế bào chủ virion không bị phá hủy mà tế bào chủ chọn lọc ñược hợp phần virus cần thiết cho trình nhân virus Virus RNA có hai cách nhân bản: - Khi lõi virion vào tế bào chất (pha che khuất “eclypse”, phân tử RNA virus tự nhân đơi thành phân tử RNA virus tác ñộng enzyme tế bào chủ, số virus RNA ñược xác ñịnh có loại enzyme chép ngược (inverse transcriptase) phân tử DNA, xử lý ngược lại q trình nhả xoắn thơng thường sinh tổng hợp protein - Nhân virus phụ thuộc vào hoạt ñộng sống tế bào chủ chúng khơng có enzyme tiền trao đổi chất cần thiết để tự nhân đơi nên phải dùng vật chủ Sau lọt vào tế bào chủ, virus nhân ngay, tổng hợp riêng biệt loại lõi vỏ virus ghép lại thành virus Vỏ virus để lại ngồi màng tế bào chủ, lõi RNA hay DNA virus ñi vào tiếp xúc với ribosome (là quan tổng hợp protein tế bào chủ) Tại ñây nhờ enzyme nucleotid tế bào chủ, RNA hay DNA virus ñiều khiển tổng hợp protein phân ñơn vị protein chuyên nghiệm thức Tỷ lệ tôm chết, dấu hiệu bệnh lý, tỷ lệ sống tôm kết thúc thí nghiệm thơng số theo dõi Thu mẫu tơm lơ thí nghiệm sau cảm nhiễm giữ mẫu -200C cho chẩn đốn kỹ thuật Dot Blot Thí nghiệm kéo dài 25 ngày - Kết quả: Ở đợt thí nghiệm I, sau 25 ngày cảm nhiễm virus RTV cách tiêm vào mặt bụng đốt bụng thứ tơm (P.60), tỷ lệ sống tôm nghiệm thức ðC, NT1, NT2 NT3 là: 86,7%; 40.0%; 80,0%; 84,4% ñiều kiện ñộ mặn 10ppt 95,5%; 56.6%; 80,0% 85,6% ñộ mặn 30ppt Nếu so sánh cảm tính tỷ lệ sống tơm bị cảm nhiễm virus RTV thấp so với ñối chứng Tuy nhiên, dùng thống kê ñể so sánh giá trị trung bình cho thấy, nghiệm thức NT1 (ở ñộ mặn 10ppt) NT1, NT2 (ở ñộ mặn 30ppt) cho tỷ lệ sống thấp có ý nghĩa thống kê (P0,05) tỷ lệ sống tôm nghiệm thức độ mặn khác ðây khác biệt khả chịu ñựng ñiều kiện bất lợi mơi trường giai đoạn tơm giống (yếu hơn) so tơm thịt III.15.2.2 ðợt thí nghiệm thứ II (từ 1/ 2/2010 đến 21 2/2010) - ðiều kiện thí nghiệm: Huyền dịch virus gốc (1ml tương ứng với 1,1g protein virus) lấy từ tủ đơng pha loãng với nước cất dùng y tế với tỷ lệ: 1/2; 1/3; 1/4 cho nghiệm thức tương ứng (NT1, NT2 NT3) 0,1ml huyền dịch ñã pha loãng ñược tiêm vào mặt bụng đốt bụng thứ tơm thí nghiệm Mỗi tơm lơ đối chứng tiêm 0,1ml huyền dịch chứa tế SF9 không nhiễm virus RTV pha lỗng 1/2 Trong nghiệm thức thả ni 30 tơm thịt cỡ 4,5 ± 0,56g/con, điều kiện có sục khí nhẹ 24h/ngày Thức ăn cơng ty UP dùng cho tơm thí nghiệm suốt đợt thí nghiệm Siphon ñáy thay 50% nước hàng ngày tất nghiệm thức Tỷ lệ tôm chết, dấu hiệu bệnh lý, tỷ lệ sống tôm kết thúc thí nghiệm thơng số theo dõi Thu mẫu tơm lơ thí nghiệm sau cảm nhiễm cố ñịnh cồn etanol 95% dùng cho chẩn đốn kỹ thuật PCR Thí nghiệm kéo dài 21 ngày - Kết quả: Ở đợt thí nghiệm thứ II cho kết tương tự ñợt I Tỷ lệ sống tôm nghiệm thức có tiêm virus thấp so với đối chứng thấp dần liều virus tăng lên Tỷ lệ sống tơm sau 21 ngày thí nghiệm tương ứng với nghiệm thức ðC, NT1, NT2 NT3 : 93,4%; 58,9%; 87,8% 90,0% Tuy nhiên 98 kiểm ñịnh thống kê (one way ANOVA) cho thấy có tỷ lệ sống tơm nghiệm thức NT1 (tơm nghiệm thức tiêm dịch virus pha lỗng với tỷ lệ ½-liều cao nhất) thấp có ý nghĩa thống kê (P