Thực hiện kỹ thuật ELISA trên 139 mẫu huyết thanh để phát hiện kháng thể kháng Cysticercus cellulosae gồm 32 mẫu huyết thanh của những bệnh nhân mắc bệnh Cysticercus cellulosae, 82 mẫu huyết thanh của những người không mắc bệnh Cysticercus cellulosae, 25 mẫu huyết thanh của những người nhiễm ký sinh trùng khác. Kỹ thuật ELISA có độ nhạy 100% và độ đặc hiệu 96,3%. So sánh kết quả chẩn đoán Cysticercus cellulosae giữa bộ kit của Bộ môn Ký sinh trùng dùng kháng nguyên dịch nang với bộ kit của Biopharma có sự phù hợp cao (Kappa= 0,95).
SO SÁNH KẾT QUẢ CHẨN ĐOÁN CYSTICERCUS CELLULOSAE CỦA BỘ KIT CỦA BỘ MÔN KÝ SINH TRÙNG VÀ BỘ KIT CỦA BIOPHARMA Phan Anh Tuấn*, Trần Thò Kim Dung*, Trần Thò Thanh Nga** TÓM TẮT Thực kỹ thuật ELISA 139 mẫu huyết để phát kháng thể kháng Cysticercus cellulosae gồm 32 mẫu huyết bệnh nhân mắc bệnh Cysticercus cellulosae, 82 mẫu huyết người không mắc bệnh Cysticercus cellulosae, 25 mẫu huyết người nhiễm ký sinh trùng khác Kỹ thuật ELISA có độ nhạy 100% độ đặc hiệu 96,3% So sánh kết chẩn đoán Cysticercus cellulosae kit Bộ môn Ký sinh trùng dùng kháng nguyên dòch nang với kit Biopharma có phù hợp cao (Kappa= 0,95) SUMMARY COMPARATIVE EVALUATION OF DEPARMENT OF PARASITOLOGY’S KIT AND BIOPHARMA ‘ S FOR THE DIAGNOSIS OF HUMAN CYSTICERCOSIS Phan Anh Tuan, Tran Thi Kim Dung, Trần Thò Thanh Nga * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol * Supplement of No * 2005: 100 – 105 The ELISA with antigen produced by Department of Parasitology- University of Medicine and Pharmacy in Ho Chi Minh City was perform on 139 serum samples; 32 from patients having cysticercosis, 82 from persons not having Cysticercus cellulosae, 25 from patients who infected other parasites Considering all 139 specimens, the ELISA had sensitivity of 100% The specificity was 96,3% Compare betweem the result of ELISA and the kit of Biopharma have high coresspond (Kappa=0,95) ĐẶT VẤN ĐỀ chẩn đoán với kit Biopharma Bệnh Cysticercus cellulosae bệnh nuốt trứng thải sán trưởng thành Cysticercus cellulosae gặp cơ, da mắt, hệ thần kinh trung ương Bệnh Cysticercus cellulosae da, chẩn đoán trực tiếp phương pháp sinh thiết(1) Bệnh Cysticercus cellulosae nội tạng chẩn đoán khó sinh thiết Người ta chẩn đoán bệnh hình ảnh học CT scanner, MRI chẩn đoán hình ảnh học đắt tiền, có độ nhạy thấp, khó chẩn đoán phân biệt với tổn thương nguyên nhân khác Xu hướng ngày dùng phương pháp chẩn đoán huyết VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Tại Bộ môn Ký Sinh trùng, điều chế kháng nguyên từ Cysticercus cellulosae để sử dụng kỹ thuật ELISA chẩn đoán bệnh so sánh kết * Bộ môn Ký sinh trùng Đại học Y Dược TP HCM ** Bệnh viện Chợ Rẫy TP HCM 100 Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu thực nghiệm labo Nguyên vật liệu dụng cụ Kháng nguyên Được điều chế từ C cellulosae heo bò mắc tự nhiên Huyết Có 676 mẫu HT gồm: + HT nhóm bệnh C cellulosae (HT chứng dương): Có mẫu HT bệnh nhân xác đònh bệnh C cellulosae + HT nhóm chứng (HT chứng âm) HT nhóm chứng gồm 43 mẫu người Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập * Phụ Số * 2005 Nghiên cứu Y học khỏe mạnh + HT nhóm bệnh ký sinh trùng khác: gồm 113 mẫu + HT nhóm nghi ngờ mắc bệnh ký sinh trùng: gồm 514 Tất mẫu huyết cho thêm Azid de Natri 0,5% lưu giữ nhiệt độ –20oC 1/ 10 0 1/ 0 0 1/ 0 0 Tieán hành nghiên cứu 1/100 - Điều chế KN: gồm loại làø KN dòch nang KN mô nang - Thực kỹ thuật ELISA, đọc kết trò số OD máy đọc ELISA bước sóng 450nm - Xác đònh độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trò tiên đoán dương, giá trò tiên đoán âm kỹ thuật ELISA 1/400 1/1600 1/6400 Nồng độ KN 26,25mcg/ml 1/ 10 0 - So sánh kết xét nghiệm phát kháng thể kháng C cellulosae kỹ thuật ELISA kit Biopharma 1/ 0 0 1/ 0 0 1/100 KẾT QUẢ 1/400 1/1600 1/6400 Nồng độ KN 10,5mcg/ml Xác đònh thành phần kỹ thuật ELISA Xác đònh độ pha loãng cộng hợp Sau thời gian thử nghiệm, chọn mức độ pha loãng cộng hợp 1/10000, 1/20000 1/40000 Với nồng độ KN hiệu giá KT, có đường biểu diễn tỉ số OD+/OD- (OD+: trò số OD nhóm bệnh, OD-: trò số OD nhóm chứng) theo độ pha loãng cộng hợp sau: 1/10000 1/20000 1/40000 1/100 1/400 1/1600 1/6400 Nồng độ KN 5,25mcg/ml Biểu đồ 1: Tỉ số OD+/OD- theo hiệu giá kháng thể độ pha loãng cộng hợp 1/ 10000 1/ 20000 1/ 40000 1/100 1/400 1/1600 1/6400 Noàng độ KN 52,5mcg/ml Cho thấy độ pha loãng cộng hợp 1/40000 tỉ số thấp nhất, 1/20000 1/10000 tỉ số tương đương (P>0,05) Xác đònh loại KN Chúng điều chế KN từ C cellulosae thành loại KN dòch nang KN mô nang Thực kỹ thuật ELISA với loại KN với trò số OD đo được, có đường biểu diễn tỉ số OD+/OD- sử dụng KN dòch nang KN mô 101 Cho thấy KN dòch nang cho kết có trò số OD tỉ số OD+/OD- cao KN mô nang nang sau: Xác đònh nồng độ KN sử dụng hiệu Dòch nang Mô nang giá KT 4.5 3.5 26,25mcg/ml 1/100 1/400 1/1600 1/6400 13,12 mcg/ml 8,75 mcg/ml 2.5 Nồng độ 105 mcg/ml 6,56 mcg/ml 5,83 mcg/ml 1.5 4,37 mcg/ml 3,5 mcg/ml 0.5 Dòch nang Mô nang 1/100 1/200 1/400 1/800 1/16001/32001/6400 Biểu đồ 3: Tỉ số OD+/OD- theo nồng độ KN hiệu giá kháng thể 1/100 1/400 1/1600 1/6400 Nồng độ 52,5 mcg/ml Xác đònh ngưỡng OD dương tính Dòch nang Mô nang Thực thử nghiệm ELISA với nồng độ KN 5,83 mcg/ml hiệu giá KT 1/800, độ pha loãng cộng hợp 1/20000 43 mẫu HT nhóm chứng, trò số OD sau: - Trò số trung bình (X): 0,164 - Độ lệch chuẩn (SD): 0,009 Trò số OD dương tính tính: 1/100 1/400 1/1600 1/6400 X + 3SD = 0,164 + (3 x 0,009) = 0,191 Nồng độ 10,5 mcg/ml Dòch nang Mô nang 1/100 1/400 1/1600 1/6400 Vậy mẫu HT pha loãng hiệu giá1/800 có trò số OD lớn 0,191 coi dương tính Bảng 1: So sánh trò số OD kỹ thuật ELISA dùng KN dòch nang KN mô nang với HT bệnh ký sinh trùng khác Mẫu HT bệnh Toxocara spp Nồng độ 5,25 mcg/ml Entamoeba histolytica Biểu đồ 2: Tỉ số OD+/OD- theo hiệu giá KT sử dụng KN dòch nang KN mô nang 102 Strongyloides stercoralis KN Trò số OD theo hiệu giá KTtừ 1/50 - 1/6400 Dòch nang 0,264 - 0,158 Mô nang 0,317 - 0,181 Dòch nang 0,248 - 0,150 Mô nang 0,301 - 0,174 Dòch nang 0,256 - 0,167 Mô nang 0,305 - 0,163 Chuyên đề Ngoại Chuyên Ngànhi Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập * Phụ Số * 2005 Nghiên cứu Y học KN Trò số OD theo hiệu giá KTtừ 1/50 - 1/6400 Dòch nang 0,228 - 0,161 Mô nang 0,312 - 0,194 Dòch nang 0,216 - 0,167 Mô nang 0,318 - 0,212 Mẫu HT bệnh Paragonimus spp Fasciola spp Bảng cho thấy KN dòch nang đặc hiệu Bảng 2: Kết ELISA mẫu HT nhóm bệnh, nhóm chứng, nhóm nghi ngờ mắc bệnh ký sinh trùng nhóm bệnh ký sinh trùng khác Mẫu ht Số mẫu Kết qủa ELISA Dương tính m tính Nhóm bệnh C cellulosae Nhóm chứng 43 Nhóm nghi ngờ mắc bệnh ký sinh trùng 514 43 25 489 Nhóm bệnh ký sinh trùng khác gồm113 mẫu: 15 Fasciola spp 15 Strongyloides stercoralis 15 Paragonimus spp Toxocara spp 22 19 Entamoeba histolytica 19 18 Gnathostoma spp 4 Giun moùc 15 15 Ascasis lumbricoides 13 13 T solium 4 Viêm màng não Cryptococcus spp 2 14 Với mẫu HT nhóm bệnh, thử nghiệm Western Blot dương tính với băng protein có trọng lượng phân tử 14.300 Dalton 21.500 Dalton nhiên 40 mẫu để thử nghiệm kỹ thuật Western Blot, tất âm tính Vậy từ 514 mẫu HT bệnh nhân nghi ngờ mắc bệnh ký sinh trùng, xác đònh chẩn đoán 65 trường hợp gồm 25 trường hợp bệnh 40 trường hợp không bệnh - Với 113 mẫu HT bệnh ký sinh trùng khác có: - mẫu ELISA dương tính, thử nghiệm kỹ thuật Western - Blot, kết quả: - mẫu Western Blot âm tính: trường hợp ELISA dương tính giả - mẫu Toxocara sp có kết Western Blot dương tính Vậy trường hợp đa nhiễm - 108 mẫu ELISA âm tính, chọn ngẫu nhiên mẫu loại bệnh ký sinh trùng; tổng số 20 mẫu 10 loại bệnh trên, thử nghiệm với kỹ thuật Western - Blot, tất âm tính Như từ 113 trường hợp mắc bệnh ký sinh trùng khác, kỹ thuật Western Blot, xác đònh chẩn đoán 25 trường hợp gồm trường hợp bệnh 24 trường hợp không bệnh Xác đònh độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trò tiên đoán dương, giá trò tiên đoán âm kỹ thuật ELISA Để xác đònh độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trò tiên đoán dương, giá trò tiên đoán âm kỹ thuật ELISA, tổng hợp 139 mẫu xác đònh chẩn đoán Bảng 3: Kết ELISA 139 mẫu HT xác đònh chẩn đoán ELISA - Với 43 mẫu HT nhóm chứng, chọn 10 mẫu ngẫu nhiên: tất âm tính Dương tính - Với 514 mẫu HT nghi ngờ mắc bệnh ký sinh trùng có: Tổng cộng - 25 mẫu ELISA dương tính có trường hợp giải phẫu bệnh lý thấy ấu trùng sán 23 trường hợp lại làm thử nghiệm Western Blot, tất dương tính Bệnh Tổng cộng Có Không 32 36 103 103 107 139 Âm tính 32 a 32 = = = 100% a + c 32 103 d Độ đặc hieäu: = = 0,963 = 96,3% b + d 107 Độ nhạy: - 489 mẫu ELISA âm tính, chọn ngẫu 103 Giá trò tiên đoán dương: a 32 = = 0,889 = 88,9% a + b 36 d 103 Giá trò tiên đoán âm: = = = 100% c + d 103 So sánh kết xét nghiệm phát kháng thể kháng C cellulosae kỹ thuật ELISA kit Biopharma Chúng có kết ELISA 42 mẫu HT gồm 15 mẫu âm tính 27 mẫu dương tính Các mẫu làm thử nghiệm Bệnh viện Chợ Rẫy với kit chẩn đoán Biopharma, kết sau: Bảng 4: Kết xét nghiệm kỹ thuật ELISA kít Biopharma ELISA Kết kit Âm tính Dương tính Tổng cộng Âm tính 15 15 Dương tính 26 27 Tổng cộng 16 26 42 Chỉ số Kappa K = (Po – Pe)/ (1- Pe) Với Po = (a+d) / N = (15+26) / 42 = 0,976 Vaø Pe=((r1s1+r2s2)/N)/N=((15x16+26x27)/42)/42=0,534 K = (0,976 – 0,534)/ (1- 0,534)= 0,95 Chỉ số Kappa: K =0,95; cho thấy kết xét nghiệm kỹ thuật ELISA với KN dòch nang kit Biopharma có phù hợp cao BÀN LUẬN Về độ nhạy kỹ thuật ELISA Dựa kiện 139 mẫu HT thử nghiệm xác đònh chẩn đoán, kết phân tích theo bảng x (bảng 3) cho biết kỹ thuật ELISA có độ nhạy 100% độ đặc hiệu 96,3%, giá trò tiên đoán dương 88,9%, giá trò tiên đoán âm 100% Kết nghiên cứu tác giả khác cho biết độ nhạy kỹ thuật ELISA chẩn đoán bệnh C cellulosae từ 88,6% - 100%(3,4,813,14,16) Có biến thiên độ nhạy do: 104 - Loại nang sán để điều chế kháng nguyên: chẩn đoán miễn dòch với kỹ thuật ELISA kháng nguyên điều chế từ Cysticercus cellulosae, tác giả khác điều chế kháng nguyên từ loài khác Cysticercus longicollis(2,6) - Các thành phần nang sán: Từ nang sán Cysticercus cellulosae điều chế thành loại kháng nguyên kháng nguyên toàn nang, dòch nang kháng nguyên nội ngoại tiết Theo nghiên cứu Guo H (1997) Molinari J L (2002) độ nhạy kỹ thuật ELISA dùng KN nội -ngoại tiết từ 51,1% - 92% (9), (11) Theo nghiên cứu Costa J M (1986) Shiguekawa K Y (2000), dùng KN dòch nang độ nhạy từ 95% - 100%(3,13), tác giả Costa J M (1986), Dekumyoy P (1998), Silva A D (2000), Gekeler F (2002), Wang K H (1993) duøng KN ø toàn nang độ nhạy từ 85,7% - 100%(3,4,8,14,16) - Hơn nữa, độ nhạy kỹ thuật ELISA tùy thuộc vào bệnh nhân thử nghiệm Diawan sử dụng kháng nguyên để chẩn đoán thấy độ nhạy kỹ thuật ELISA 79% từ huyết bệnh nhân Mexico 61% huyết bệnh nhân Irian Jaya-Indonesia(5) Độ đặc hiệu kỹ thuật ELISA công trình nghiên cứu 96,3% So với nghiên cứu dùng KN toàn nang độ đặc hiệu kỹ thuật ELISA từ 75,3% - 100%(3,4,8,13) Ko R C (1998), Molinari J L (2002) dùng chất nội - ngoại tiết làm KN kỹ thuật ELISA có độ đặc hiệu từ 97% - 100%(10,11) Costa (1986), Bueno E C (2000) dùng dòch nang làm KN, độ đặc hiệu từ 90% - 100%(2,3) Độ đặc hiệu kỹ thuật ELISA nghiên cứu khác Điều chất lượng KN tình trạng mắc bệnh ký sinh trùng khác nơi nghiên cứu có khác Về phản ứng chéo Khi dùng kỹ thuật ELISA thử nghiệm huyết bệnh nhân bệnh ký sinh trùng khác cho thấy phản ứng có chéo với bệnh Entamoeba histolytics, Toxocara canis, Strongyloides stercoralis với tỉ lệ thấp (bảng 2) Chuyên đề Ngoại Chuyên Ngànhi Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập * Phụ Số * 2005 Ngoài phản ứng chéo với Entamoeba histolytics, T canis theo kết nghiên cứu tác giả khác, phản ứng chéo với Echinococcus spp, Schistosoma spp., Ascaris lumbricoides, Trichinella spiralis(4,8,13) So sánh kết chẩn đoán Cysticercus cellulosae kỹ thuật ELISA kit Biopharma Kết xét nghiệm phát kháng thể kháng C cellulosae kỹ thuật ELISA với kháng nguyên dòch nang so sánh với kit Biopharma có phù hợp cao (Kappa= 0,950) (bảng 2.4) KẾT LUẬN Kỹ thuật ELISA với kháng nguyên dòch nang kỹ thuật có độ nhạy, độ đặc hiệu cao, đáng tin cậy, thực nhanh tương đối đơn giản, không cần trang thiết bò đắt tiền, thực phòng thí nghiệm nhỏ thử nghiệm rẻ tiền có ích góp phần chẩn đoán xác đònh bệnh Kết xét nghiệm phát kháng thể kỹ thuật ELISA với kháng nguyên dòch nang so sánh với kit Biopharma có phù hợp cao Tuy nhiên nhiều câu hỏi đặt mà kỹ thuật ELISA chưa trả lời Trường hợp với kết ELISA xác đònh bệnh nhân nhiễm nhiều nang hay nang, với kết ELISA dương tính xác đònh bệnh mắc hay bệnh mãn tính? ELISA dương tính xác đònh bệnh ấu trùng sán dải heo giai đoạn tiến triển hay thoái hóa? Nếu phản ứng dương từ loại kháng nguyên ký sinh trùng đa nhiễm phản ứng chéo? Đây vấn đề mà nghiên cứu thời gian tới 10 11 12 13 14 TÀI LIỆU THAM KHẢO Baily GG (1988), “Serological diagnosis of neurocysticercosis: evaluation of ELISA tests using cyst fluid and other components of Taenia solium cysticerci as antigen”, Trans R Soc Trop Med Hyg, 82 (2), pp 295-299 Bueno E.C et al (2000), “Specific Taenia crassiceps and Taenia solium antigenic peptides for neurocysticercosis immunodiagnosis using serum samples”, J Clin Microbiol, 38(1), pp 146-151 Costa J M (1986), “Immunoenzymatic test (ELISA) in the diagnosis of neurocysticercosis: study of various 15 16 antigenic extracts in the detection of IgG antibodies in serum and cerebrospinal fluid samples”, Arq Neuropsiquiatr, 44(1), pp 15-31 Dekumyoy P et al (1998) “Use of delipidized antigens of Taenia solium metacestodes in IgG-ELISA for detection of neurocysticercosis”, Southeast Asian J Trop Med Public Health, 29(3), pp 572-578 Diwan A., Coker Vann M., Brown P et al (1982), “Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the dection of antibody to cysticerci of Taenia solium”, Am J Trop Med Hyg, 31, pp 364-369 Garcia E., Ordonez G., Sotelo J (1995), “Antigens from Taenia crassiceps used in complement fixation, enzyme – linked immunosorbent assay, and Western Blot (immunoblot) for diagnosis of neurocysticercosis, J Clin Microbiol, 33(12), pp 3324-3325 Garcia H H et al (1998), “A specific antigen detection ELISA for the diagnosis of human neurocysticercosis” Trans Royal Soc Trop Med Hyg, 92, pp 411-414 Gekeler F et al (2002), “Sensitivity and Specificity of ELISA and Immunoblot for Diagnosing Neurocysticercosis”, Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 21, pp 227-229 Guo H., Zhao Z F., Shi D Z (1997), “A study on the culture medium antigens of Cysticercus cellulosae for detecting antibodies of cysticercosis by means of ELISA”, Southeast Asian J Trop Med Public Health, 28 Suppl 1, pp 125-127 Ko RC, Ng TF (1998), “Evaluation of excretory/secretory products of larval Taenia solium as diagnostic antigens for porcine and human cysticercosis”, Journal of Helminthology, 72, pp 147-154 Molinari J L et al (2002), “Discrimination between active and inactive neurocysticercosis by metacestode excretory/secretory antigens of Taenia solium in an anzyme-linked immunosorbent assay”, Am J Trop Med Hyg, 66(6), pp 777-781 Shasha et al (1991), “Sero-epidemiological studies of cysticercosis in school children from two rural areas of Transkei, South Africa”, Annal of Tropical Medicine and Parasitology, 85, pp 349-355 Shiguekawa K.Y et al (2000), “ELISA and Western Blotting tests in the detection of IgG antibodies to Taenia solium metacestodes in serum samples in human neurocysticercosis”, Trop Med Int Health, 5(6), pp 443-449 Silva A D et al (2000), “A quantitative enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the immunodiagnosis of neurocysticercosis using a purified fraction from Taenia solium cysticerci”, Diagn Microbiol Infect Dis., 37(2), pp 87-92 Sloan L., Schneider S., Rosenblatt J (1995), “Evaluation of enzyme – linked immunoassay for serological diagnosis of cysticercosis”, J Clin Microbiol, 33(120), pp 3124-3128 Wang K H., Xu Z Y., Zeng D K (1993), “Comparative study on antigens of Cysticercus cellulosae by EITB and ELISA”, Chin J Parasitol Parasit Dis, 11, pp 53-5 105 ... hiệu Bảng 2: Kết ELISA mẫu HT nhóm bệnh, nhóm chứng, nhóm nghi ngờ mắc bệnh ký sinh trùng nhóm bệnh ký sinh trùng khác Mẫu ht Số mẫu Kết qủa ELISA Dương tính m tính Nhóm bệnh C cellulosae Nhóm... tiên đoán dương: a 32 = = 0,889 = 88,9% a + b 36 d 103 Giá trò tiên đoán âm: = = = 100% c + d 103 So sánh kết xét nghiệm phát kháng thể kháng C cellulosae kỹ thuật ELISA kit Biopharma Chúng có kết. .. tính Các mẫu làm thử nghiệm Bệnh viện Chợ Rẫy với kit chẩn đoán Biopharma, kết sau: Bảng 4: Kết xét nghiệm kỹ thuật ELISA kít Biopharma ELISA Kết kit Âm tính Dương tính Tổng cộng Âm tính 15 15 Dương